拒鹽型牧草小花堿茅PutHKT2;1基因表達(dá)模式分析

李 劍，張金林

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)為禾本科堿茅屬多年生草本植物，主要分布于我國東北和西北地區(qū)，能夠在鹽堿地正常生長(zhǎng)，草質(zhì)柔軟，適口性好，是一種能夠改良鹽堿地的優(yōu)良牧草[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)于鹽漬生境下的小花堿茅具有很強(qiáng)的拒Na+能力，以保持其體內(nèi)低的Na+濃度，增強(qiáng)其耐鹽性[3-4]。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，小花堿茅根部對(duì)K+/Na+選擇吸收能力很強(qiáng)，大約是小麥(Triticumaestivum)的2倍。Wang等[6]采用22Na+同位素示蹤技術(shù)證明小花堿茅耐鹽的主要生理機(jī)制是其根系能控制Na+內(nèi)流，對(duì)K+有強(qiáng)的選擇性，從而提高體內(nèi)K+/Na+，而其耐鹽的分子機(jī)制尚不清楚。生長(zhǎng)于鹽漬生境中的植物，其體內(nèi)存在多種與耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT是目前研究的熱點(diǎn)。HKT蛋白是廣泛存在于植物和一些原核生物中的一類超級(jí)蛋白家族[7-8]。根據(jù)異源表達(dá)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)特性的差異，通常將HKT蛋白分為兩大類：第一類以擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtHKT1;1研究最多，通常為Na+專一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[9-11]；第二類以水稻(Oryzasativa)OsHKT2;1和小麥TaHKT2;1為代表，TaHKT2;1為K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12-13]，而OsHKT2;1是例外，為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[14-16]。HKT蛋白的離子轉(zhuǎn)運(yùn)特性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，目前公認(rèn)的8次跨膜結(jié)構(gòu)模型[17]，及擁有8個(gè)跨膜螺旋和中間的4個(gè)P環(huán)，已經(jīng)在擬南芥、水稻等植物中得到證實(shí)[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，在HKT蛋白的P環(huán)或離P環(huán)很近的區(qū)域上存在與K+、Na+選擇性吸收相關(guān)的多個(gè)位點(diǎn)[18]，且關(guān)于第1個(gè)P環(huán)過濾器位置的甘氨酸或絲氨酸殘基與離子選擇性密切相關(guān)，具有甘氨酸殘基的HKT通常為K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而具有絲氨酸殘基的通常為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[20]，小花堿茅PutHKT2;1第1個(gè)P環(huán)處為甘氨酸，因此推測(cè)可能為K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

Na+是鹽漬化土壤中的主要毒害離子，抑制K+吸收，引起滲透脅迫和離子脅迫，嚴(yán)重威脅植物的正常生長(zhǎng)[8,21]。植物可以通過限制根部Na+吸收，減小Na+向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，通過再循環(huán)途徑卸載地上部過多的Na+，將Na+區(qū)域化到地上部的特殊部位并積累或?qū)a+分泌到體外等諸多過程減輕鹽漬脅迫[22]。HKT蛋白在這些過程中發(fā)揮重要作用，能夠減輕脅迫對(duì)植物的損害[8,19,23-25]。

1 材料與方法

1.1材料處理 小花堿茅種子于2010年采自甘肅省張掖市臨澤縣白寨村鹽堿地。挑選顆粒飽滿的種子均勻地撒在篩網(wǎng)上，暗培養(yǎng)至發(fā)芽后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室中，澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)4周后，將幼苗移栽入樣品處理盒中，適應(yīng)2 d后施以各種處理。K+饑餓處理時(shí)，將KNO3從營(yíng)養(yǎng)液中移除，NO3-用NH4NO3補(bǔ)齊。處理24 h后，分別取100 mg幼根和地上部，經(jīng)無菌水沖洗后，置于干凈濾紙上吸干水分，快速放入1.5 mL離心管中，經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱中保存或直接用于總RNA提取。培養(yǎng)室晝夜溫度為28 ℃/22 ℃，光照周期16 h·d-1，光照強(qiáng)度約為600 μmol·m-2·s-1，空氣相對(duì)濕度為60%～80%。Hoagland營(yíng)養(yǎng)液組分：1 mmol·L-1KNO3，1 mmol·L-1NH4H2PO4，0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，92 μmol·L-1H3BO3，18 μmol·L-1MnCl2·4H2O，1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O，59 μmol·L-1Fe-citrate。

1.2主要試劑 總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，普通PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，UNIQ-10 PCR產(chǎn)物回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，pMD19-T Simple克隆載體(大連寶生物工程有限公司)，DNA ladder(北京天根生化科技有限公司)，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)，Escherichiacoli.DH5a菌株由蘭州大學(xué)草類逆境生理與基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3研究方法

1.3.1總RNA提取 總RNA的提取依照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。用1.0%甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性，用核酸蛋白檢測(cè)儀NanoDrop 1000檢測(cè)其純度和濃度。

1.3.2PutHKT2;1基因表達(dá)片段的擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄過程依據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)PutHKT2;1全長(zhǎng)cDNA序列，利用生物軟件(DNAMAN和Primer Premier 5.0)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1和P2，目的片段長(zhǎng)度為497 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。P1：5′-TGCACAGCCTCAGTCGAATCAGTAG-3′；P2：5′-ATTCCTCTTAAACTCTGCAGAACTC-3′。PCR反應(yīng)體系：10× PCR Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl22.5 μL，2 mmol·L-1dNTP 5 μL,10 μmol·L-1P1和P2各1 μL，Taq DNA polymerase(5 U·μL-1) 0.5 μL，cDNA 2 μL，加無菌水至總體積50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的回收和純化依據(jù)膠回收試劑盒操作說明書進(jìn)行，將回收到的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，之后在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.3PutHKT2;1基因表達(dá)模式分析 將4周齡小花堿茅在①1 mmol·L-1K+和0 mmol·L-1Na+；②0 mmol·L-1K+和0 mmol·L-1Na+；③1 mmol·L-1K+和25 mmol·L-1Na+；④0 mmol·L-1K+和25 mmol·L-1Na+；⑤1 mmol·L-1K+和300 mmol·L-1Na+；⑥0 mmol·L-1K+和300 mmol·L-1Na+6種不同條件下處理24 h后收獲，分別提取總RNA，立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA于-20 ℃保存，用于表達(dá)模式分析。內(nèi)參基因Actin參照王生銀等[26]所擴(kuò)增到片段，P3：5′-GTGGTCGTACAACTGGTATTGTG-3′；P4：5′-GCACCTCCAATCCAGACACTG-3′，片段長(zhǎng)度598 bp。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl23 μL，2 mmol·L-1dNTP 5 μL,10 μmol·L-1P31 μL，P41 μL，Taq DNA polymerase(5 U·μL-1) 0.5 μL，cDNA 2 μL，加無菌水至總體積50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，分析PutHKT2;1基因在不同處理下的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取與檢測(cè) 從小花堿茅根和地上部提取總RNA，甲醛變性膠顯示提取的RNA完整性較好；經(jīng)NanoDrop 1000核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)得OD260 nm/OD280 nm都在1.8～2.0，表明RNA純度較高，很少有DNA和蛋白質(zhì)污染，可用于下一步試驗(yàn)。

2.2PutHKT2;1基因表達(dá)片段的克隆 以cDNA為模板，用特異性引物P1和P2擴(kuò)增出1條497 bp長(zhǎng)的條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，所克隆到的片段為PutHKT2;1基因片段目的片段上下均沒有彌散，且沒有引物二聚體生成。表明引物特異性非常高，完全滿足后續(xù)表達(dá)模式分析實(shí)驗(yàn)。

圖1 PutHKT2;1基因表達(dá)片段的克隆Fig.1 Cloning of expression fragment of PutHKT2;1

2.3PutHKT2;1基因在不同處理下的表達(dá)PutHKT2;1基因受K+饑餓誘導(dǎo)，可以在小花堿茅根中和地上部表達(dá)。在6種處理?xiàng)l件下，根中的表達(dá)量都比地上部高，說明PutHKT2;1基因表達(dá)存在組織特異性(圖2、圖3)。根中K+饑餓處理時(shí)，表達(dá)量最高，且明顯高于其他處理下的表達(dá)量，在1 mmol·L-1K+或無K+條件下，根中PutHKT2;1表達(dá)量隨著鹽濃度的增大而減少。在不同處理?xiàng)l件下，地上部表達(dá)量相對(duì)較低，且變化幅度不大。

圖2 PutHKT2;1在根中的表達(dá)模式圖Fig.2 PutHKT2;1 expression pattern in the root

圖3 PutHKT2;1在地上部的表達(dá)模式圖Fig.3 PutHKT2;1 expression pattern in the shoot

3 討論與結(jié)論

高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT2;1能夠控制根部Na+吸收，增強(qiáng)對(duì)K+的選擇吸收能力，從而維持地上部高的K+/Na+，從而提高植株的耐鹽性[8]。小麥PutHKT2;1基因首次被克隆后[12]，人們相繼在水稻、大麥(Hordeumvulgar)和蘆葦(Phragmitesaustralis)等植物中也發(fā)現(xiàn)了HKT2;1基因[14,27-28]。基因的表達(dá)模式分析與其生理功能密不可分。小麥TaHKT2;1基因主要在根皮層細(xì)胞、葉和莖中表達(dá)，說明高親和性K+吸收可以在多種植物組織中進(jìn)行；TaHKT2;1在根的皮層細(xì)胞中表達(dá)，暗示皮層細(xì)胞具有很高的吸收K+的活性；TaHKT2;1可以在葉維管組織的細(xì)胞層表達(dá)，說明TaHKT2;1能夠參與地上部中K+的轉(zhuǎn)運(yùn)[12-13]。Laurie等[29]將反義的TaHKT2;1轉(zhuǎn)入小麥后，轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性增強(qiáng)，認(rèn)為TaHKT2;1在整株水平上的生理功能是介導(dǎo)Na+的吸收，說明皮層細(xì)胞不僅能夠吸K+，對(duì)Na+也有較高的吸收活性。Horie等[15]研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsHKT2;1基因主要在根部皮層和內(nèi)皮層中表達(dá)，在葉維管束中也有表達(dá)，受低K+條件誘導(dǎo)，在無K+時(shí)表達(dá)豐度最高，但同時(shí)加入Na+后，表達(dá)量急劇下調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsHKT2;1在整株水平上的生理功能是，在缺K+時(shí)，能夠介導(dǎo)根部吸收有益Na+，部分代替K+的生理功能，這與OsHKT2;1基因在根部的表達(dá)量最高密切聯(lián)系。另有研究也發(fā)現(xiàn)，水稻OsHKT2;1能夠介導(dǎo)根部對(duì)Na+的高親和性吸收[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，小花堿茅PutHKT2;1主要在根中表達(dá)，地上部表達(dá)量較少，推測(cè)PutHKT2;1可能主要介導(dǎo)根部對(duì)離子的吸收；在無K+無Na+條件下，根中PutHKT2;1表達(dá)量最高，說明PutHKT2;1有可能參與根部對(duì)K+的高親和性吸收。在1 mmol·L-1K+或無K+條件下，根中PutHKT2;1表達(dá)量隨著鹽濃度的增大而減少，在低鹽濃度且K+饑餓時(shí)，PutHKT2;1可能參與小花堿茅根部Na+吸收，PutHKT2;1表達(dá)量較大；當(dāng)鹽濃度增大后，小花堿茅不再吸入過多的Na+進(jìn)入體內(nèi)，PutHKT2;1表達(dá)量降低，因此推測(cè)PutHKT2;1能夠控制小花堿茅根部Na+吸收。下一步試驗(yàn)將對(duì)PutHKT2;1基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位，進(jìn)一步探索小花堿茅PutHKT2;1的生理功能。

[1] Flowers T J.Improving crop salt tolerance[J].Journal of Experimental Botany,2004,55:307-319.

[2] 任偉，王志峰，徐安凱.堿茅耐鹽堿基因克隆研究進(jìn)展[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19(5)：260-266.

[3] 王鎖民.不同程度鹽脅迫對(duì)堿茅離子吸收與分配的影響[J].草地學(xué)報(bào)，1996，4(3)：186-193.

[4] 石德成，殷立娟.鹽(NaCl)與堿(Na2CO3)對(duì)星星草脅迫作用的差異[J].植物學(xué)報(bào)，1993，34(5)：144-149.

[5] Wang S M,Zhao G Q,Gao Y S,etal.Puccinelliatenuifloraexhibits stronger selectivity for K+over Na+than wheat [J].Journal of Plant Nutrition,2004,27:1841-1857.

[6] Wang C M,Zhang J L,Liu X S,etal.Puccinelliatenuifloramaintains a low Na+level under salinity by limiting unidirectional Na+influx resulting in a high selectivity for K+over Na+[J].Plant Cell and Environment,2009,32:486-496.

[7] Liu W,Schachtman D P,Zhang W.Partial deletion of a loop region in the high affinity K+transporter HKT1 changes ionic permeability leading to increased salt tolerance[J].Journal of Biological Chemistry,2000,275(36):27924-27932.

[8] Zhang J L,Flowers T J,Wang S M.Mechanisms of sodium uptake by roots of higher plant[J].Plant and Soil,2010,326:45-60.

[9] Uozumi N,Kim E J,Rubio F,etal.The ArabidopsisHKT1 gene homolog mediates inward Na+currents inXenopuslaevisoocytes and Na+uptake inSaccharomycescerevisiae[J].Plant Physiology,2000,122(4):1249-1260.

[10] Berthomieu P,Conéjéro G,Nublat A,etal.Functional analysis of AtHKT1 in Arabidopsis shows that Na+recirculation by the phloem is crucial for salt tolerance[J].EMBO Journal,2003,22(9):2004-2014.

[11] Sunarpi,Horie T,Motoda J,etal.Enhanced salt tolerance mediated by AtHKT1 transporter-induced Na+unloading from xylem vessels to xylem parenchyma cells[J].Plant Journal,2005,44(6):928-938.

[12] Schachtman D P,Schroeder J I.Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants[J].Nature,1994,370:655-658.

[13] Gassmann W,Rubio F,Schroeder J I.Alkali cation selectivity of the wheat root high-affinity potassium transporter HKT1[J].Plant Journal,1996,10(5):869-882.

[14] Horie T,Yoshida K,Nakayama H,etal.Two types of HKT transporters with different properties of Na+and K+transport inOryzasativa[J].Plant Journal,2001,27(2):129-138.

[15] Horie T,Costa A,Kim T H,etal.Rice OsHKT2;1 transporter mediates large Na+influx component into K+-starved roots for growth[J].EMBO Journal,2007,26:3003-3014.

[16] Garciadeblás B,Senn M E,Bauelos M A,etal.Sodium transport and HKT transporters: the rice model[J].Plant Journal,2003,34(6):788-801.

[17] Durell S R,Hao Y,Nakamura T,etal.Evolutionary relationship between K+channels and symporters[J].Biophysical Journal,1999,77(2):775-788.

[18] Kato Y,Sakaguchi M,Mori Y,etal.Evidence in support of a four transmembrane-pore-transmembrane topology model for theArabidopsisthalianaNa+/ K+translocating AtHKT1 protein, a member of the superfamily of K+transporters[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,2001,98(11):6488-6493.

[19] Ren Z H,Gao J P,Li L G,etal.A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter[J].Nature Genetics,2005,37(10):1141-1146.

[20] M?ser P,Hosoo Y,Goshima S,etal.Glycine residues in potassium channel-like selectivity filters determine potassium selectivity in four-loop-per-subunit HKT transporters from plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,2002,99(9):6428-6433.

[21] 張宏飛，王鎖民.高等植物Na+吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞內(nèi)Na+穩(wěn)態(tài)平衡研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，2007，24(5)：561-571.

[22] 陳敏,彭建云,王寶山.整株水平上Na+轉(zhuǎn)運(yùn)體與植物的抗鹽性[J].植物學(xué)通報(bào)，2008,25(4):381-391.

[23] Byrt C S,Platten J D,Spielmeyer W,etal.HKT1;5-like cation transporters linked to Na+exclusion loci in wheat,Nax2 andKna1[J].Plant Physiology,2007,143:1918-1928.

[24] Plett D C,Mller I S.Na+transport in glycophytic plants: what we know and would like to know[J].Plant Cell and Environment,2010,33(4):612-626.

[25] Hauser F,Horie T.A conserved primary salt tolerance mechanism mediated by HKT transporters: a mechanism for sodium exclusion and maintenance of high K+/Na+ratio in leaves during salinity stress[J].Plant Cell and Environment,2010,33(4):552-565.

[26] 王生銀,張永超,李莉,等.拒鹽型鹽生植物小花堿茅肌動(dòng)蛋白基因片段的克隆及序列分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2009,28(4):673-677.

[27] Wang T B, Gassmann W,Rubio F,etal.Rapid up-regulation of HKT1, a high-affinity potassium transporter gene, in roots of barley and wheat following withdrawal of potassium[J].Plant Physiology,1998,118:651-659.

[28] Takahashi R,Liu S,Takano T.Cloning and functional comparison of a high-affinity K+transporter genePhaHKT1 of salt-tolerant and salt-sensitive reed plants[J].Journal of Experimental Botany,2007,58(15/16):4387-4395.

[29] Laurie S,Feeney K A,Maathuis F J,etal. A role for HKT1 in sodium uptake by wheat roots[J].Plant Journal,2002,32(2):139-149.