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    拒鹽型牧草小花堿茅PutHKT2;1基因表達(dá)模式分析

    2012-03-13 00:50:38張金林
    草業(yè)科學(xué) 2012年9期
    關(guān)鍵詞:親和性根部小花

    李 劍,張金林

    (蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730020)

    小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)為禾本科堿茅屬多年生草本植物,主要分布于我國東北和西北地區(qū),能夠在鹽堿地正常生長(zhǎng),草質(zhì)柔軟,適口性好,是一種能夠改良鹽堿地的優(yōu)良牧草[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)于鹽漬生境下的小花堿茅具有很強(qiáng)的拒Na+能力,以保持其體內(nèi)低的Na+濃度,增強(qiáng)其耐鹽性[3-4]。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn),小花堿茅根部對(duì)K+/Na+選擇吸收能力很強(qiáng),大約是小麥(Triticumaestivum)的2倍。Wang等[6]采用22Na+同位素示蹤技術(shù)證明小花堿茅耐鹽的主要生理機(jī)制是其根系能控制Na+內(nèi)流,對(duì)K+有強(qiáng)的選擇性,從而提高體內(nèi)K+/Na+,而其耐鹽的分子機(jī)制尚不清楚。生長(zhǎng)于鹽漬生境中的植物,其體內(nèi)存在多種與耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其中高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT是目前研究的熱點(diǎn)。HKT蛋白是廣泛存在于植物和一些原核生物中的一類超級(jí)蛋白家族[7-8]。根據(jù)異源表達(dá)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)特性的差異,通常將HKT蛋白分為兩大類:第一類以擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtHKT1;1研究最多,通常為Na+專一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[9-11];第二類以水稻(Oryzasativa)OsHKT2;1和小麥TaHKT2;1為代表,TaHKT2;1為K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12-13],而OsHKT2;1是例外,為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[14-16]。HKT蛋白的離子轉(zhuǎn)運(yùn)特性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān),目前公認(rèn)的8次跨膜結(jié)構(gòu)模型[17],及擁有8個(gè)跨膜螺旋和中間的4個(gè)P環(huán),已經(jīng)在擬南芥、水稻等植物中得到證實(shí)[18-19]。研究發(fā)現(xiàn),在HKT蛋白的P環(huán)或離P環(huán)很近的區(qū)域上存在與K+、Na+選擇性吸收相關(guān)的多個(gè)位點(diǎn)[18],且關(guān)于第1個(gè)P環(huán)過濾器位置的甘氨酸或絲氨酸殘基與離子選擇性密切相關(guān),具有甘氨酸殘基的HKT通常為K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,而具有絲氨酸殘基的通常為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[20],小花堿茅PutHKT2;1第1個(gè)P環(huán)處為甘氨酸,因此推測(cè)可能為K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

    Na+是鹽漬化土壤中的主要毒害離子,抑制K+吸收,引起滲透脅迫和離子脅迫,嚴(yán)重威脅植物的正常生長(zhǎng)[8,21]。植物可以通過限制根部Na+吸收,減小Na+向地上部轉(zhuǎn)運(yùn),通過再循環(huán)途徑卸載地上部過多的Na+,將Na+區(qū)域化到地上部的特殊部位并積累或?qū)a+分泌到體外等諸多過程減輕鹽漬脅迫[22]。HKT蛋白在這些過程中發(fā)揮重要作用,能夠減輕脅迫對(duì)植物的損害[8,19,23-25]。

    1 材料與方法

    1.1材料處理 小花堿茅種子于2010年采自甘肅省張掖市臨澤縣白寨村鹽堿地。挑選顆粒飽滿的種子均勻地撒在篩網(wǎng)上,暗培養(yǎng)至發(fā)芽后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室中,澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)4周后,將幼苗移栽入樣品處理盒中,適應(yīng)2 d后施以各種處理。K+饑餓處理時(shí),將KNO3從營(yíng)養(yǎng)液中移除,NO3-用NH4NO3補(bǔ)齊。處理24 h后,分別取100 mg幼根和地上部,經(jīng)無菌水沖洗后,置于干凈濾紙上吸干水分,快速放入1.5 mL離心管中,經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱中保存或直接用于總RNA提取。培養(yǎng)室晝夜溫度為28 ℃/22 ℃,光照周期16 h·d-1,光照強(qiáng)度約為600 μmol·m-2·s-1,空氣相對(duì)濕度為60%~80%。Hoagland營(yíng)養(yǎng)液組分:1 mmol·L-1KNO3,1 mmol·L-1NH4H2PO4,0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O,0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O,92 μmol·L-1H3BO3,18 μmol·L-1MnCl2·4H2O,1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O,0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O,0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O,59 μmol·L-1Fe-citrate。

    1.2主要試劑 總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司),cDNA第一鏈合成試劑盒(大連寶生物工程有限公司),普通PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程有限公司),UNIQ-10 PCR產(chǎn)物回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司),pMD19-T Simple克隆載體(大連寶生物工程有限公司),DNA ladder(北京天根生化科技有限公司),大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司),Escherichiacoli.DH5a菌株由蘭州大學(xué)草類逆境生理與基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.3研究方法

    1.3.1總RNA提取 總RNA的提取依照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。用1.0%甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性,用核酸蛋白檢測(cè)儀NanoDrop 1000檢測(cè)其純度和濃度。

    1.3.2PutHKT2;1基因表達(dá)片段的擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄過程依據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)PutHKT2;1全長(zhǎng)cDNA序列,利用生物軟件(DNAMAN和Primer Premier 5.0)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1和P2,目的片段長(zhǎng)度為497 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。P1:5′-TGCACAGCCTCAGTCGAATCAGTAG-3′;P2:5′-ATTCCTCTTAAACTCTGCAGAACTC-3′。PCR反應(yīng)體系:10× PCR Buffer 5 μL,25 mmol·L-1MgCl22.5 μL,2 mmol·L-1dNTP 5 μL,10 μmol·L-1P1和P2各1 μL,Taq DNA polymerase(5 U·μL-1) 0.5 μL,cDNA 2 μL,加無菌水至總體積50 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;94 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的回收和純化依據(jù)膠回收試劑盒操作說明書進(jìn)行,將回收到的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,之后在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,將陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

    1.3.3PutHKT2;1基因表達(dá)模式分析 將4周齡小花堿茅在①1 mmol·L-1K+和0 mmol·L-1Na+;②0 mmol·L-1K+和0 mmol·L-1Na+;③1 mmol·L-1K+和25 mmol·L-1Na+;④0 mmol·L-1K+和25 mmol·L-1Na+;⑤1 mmol·L-1K+和300 mmol·L-1Na+;⑥0 mmol·L-1K+和300 mmol·L-1Na+6種不同條件下處理24 h后收獲,分別提取總RNA,立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA于-20 ℃保存,用于表達(dá)模式分析。內(nèi)參基因Actin參照王生銀等[26]所擴(kuò)增到片段,P3:5′-GTGGTCGTACAACTGGTATTGTG-3′;P4:5′-GCACCTCCAATCCAGACACTG-3′,片段長(zhǎng)度598 bp。PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 5 μL,25 mmol·L-1MgCl23 μL,2 mmol·L-1dNTP 5 μL,10 μmol·L-1P31 μL,P41 μL,Taq DNA polymerase(5 U·μL-1) 0.5 μL,cDNA 2 μL,加無菌水至總體積50 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。以Actin基因?yàn)閮?nèi)參,分析PutHKT2;1基因在不同處理下的表達(dá)情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1總RNA的提取與檢測(cè) 從小花堿茅根和地上部提取總RNA,甲醛變性膠顯示提取的RNA完整性較好;經(jīng)NanoDrop 1000核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)得OD260 nm/OD280 nm都在1.8~2.0,表明RNA純度較高,很少有DNA和蛋白質(zhì)污染,可用于下一步試驗(yàn)。

    2.2PutHKT2;1基因表達(dá)片段的克隆 以cDNA為模板,用特異性引物P1和P2擴(kuò)增出1條497 bp長(zhǎng)的條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明,所克隆到的片段為PutHKT2;1基因片段目的片段上下均沒有彌散,且沒有引物二聚體生成。表明引物特異性非常高,完全滿足后續(xù)表達(dá)模式分析實(shí)驗(yàn)。

    圖1 PutHKT2;1基因表達(dá)片段的克隆Fig.1 Cloning of expression fragment of PutHKT2;1

    2.3PutHKT2;1基因在不同處理下的表達(dá)PutHKT2;1基因受K+饑餓誘導(dǎo),可以在小花堿茅根中和地上部表達(dá)。在6種處理?xiàng)l件下,根中的表達(dá)量都比地上部高,說明PutHKT2;1基因表達(dá)存在組織特異性(圖2、圖3)。根中K+饑餓處理時(shí),表達(dá)量最高,且明顯高于其他處理下的表達(dá)量,在1 mmol·L-1K+或無K+條件下,根中PutHKT2;1表達(dá)量隨著鹽濃度的增大而減少。在不同處理?xiàng)l件下,地上部表達(dá)量相對(duì)較低,且變化幅度不大。

    圖2 PutHKT2;1在根中的表達(dá)模式圖Fig.2 PutHKT2;1 expression pattern in the root

    圖3 PutHKT2;1在地上部的表達(dá)模式圖Fig.3 PutHKT2;1 expression pattern in the shoot

    3 討論與結(jié)論

    高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT2;1能夠控制根部Na+吸收,增強(qiáng)對(duì)K+的選擇吸收能力,從而維持地上部高的K+/Na+,從而提高植株的耐鹽性[8]。小麥PutHKT2;1基因首次被克隆后[12],人們相繼在水稻、大麥(Hordeumvulgar)和蘆葦(Phragmitesaustralis)等植物中也發(fā)現(xiàn)了HKT2;1基因[14,27-28]。基因的表達(dá)模式分析與其生理功能密不可分。小麥TaHKT2;1基因主要在根皮層細(xì)胞、葉和莖中表達(dá),說明高親和性K+吸收可以在多種植物組織中進(jìn)行;TaHKT2;1在根的皮層細(xì)胞中表達(dá),暗示皮層細(xì)胞具有很高的吸收K+的活性;TaHKT2;1可以在葉維管組織的細(xì)胞層表達(dá),說明TaHKT2;1能夠參與地上部中K+的轉(zhuǎn)運(yùn)[12-13]。Laurie等[29]將反義的TaHKT2;1轉(zhuǎn)入小麥后,轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性增強(qiáng),認(rèn)為TaHKT2;1在整株水平上的生理功能是介導(dǎo)Na+的吸收,說明皮層細(xì)胞不僅能夠吸K+,對(duì)Na+也有較高的吸收活性。Horie等[15]研究發(fā)現(xiàn),水稻OsHKT2;1基因主要在根部皮層和內(nèi)皮層中表達(dá),在葉維管束中也有表達(dá),受低K+條件誘導(dǎo),在無K+時(shí)表達(dá)豐度最高,但同時(shí)加入Na+后,表達(dá)量急劇下調(diào);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),水稻OsHKT2;1在整株水平上的生理功能是,在缺K+時(shí),能夠介導(dǎo)根部吸收有益Na+,部分代替K+的生理功能,這與OsHKT2;1基因在根部的表達(dá)量最高密切聯(lián)系。另有研究也發(fā)現(xiàn),水稻OsHKT2;1能夠介導(dǎo)根部對(duì)Na+的高親和性吸收[16]。本研究發(fā)現(xiàn),小花堿茅PutHKT2;1主要在根中表達(dá),地上部表達(dá)量較少,推測(cè)PutHKT2;1可能主要介導(dǎo)根部對(duì)離子的吸收;在無K+無Na+條件下,根中PutHKT2;1表達(dá)量最高,說明PutHKT2;1有可能參與根部對(duì)K+的高親和性吸收。在1 mmol·L-1K+或無K+條件下,根中PutHKT2;1表達(dá)量隨著鹽濃度的增大而減少,在低鹽濃度且K+饑餓時(shí),PutHKT2;1可能參與小花堿茅根部Na+吸收,PutHKT2;1表達(dá)量較大;當(dāng)鹽濃度增大后,小花堿茅不再吸入過多的Na+進(jìn)入體內(nèi),PutHKT2;1表達(dá)量降低,因此推測(cè)PutHKT2;1能夠控制小花堿茅根部Na+吸收。下一步試驗(yàn)將對(duì)PutHKT2;1基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位,進(jìn)一步探索小花堿茅PutHKT2;1的生理功能。

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