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    CBF1基因轉(zhuǎn)化飼草玉米SAUMZ1提高抗寒性的研究

    2012-03-13 00:51:24向白菊李成君
    草業(yè)科學(xué) 2012年9期
    關(guān)鍵詞:抗寒性飼草擬南芥

    向白菊,李成君,張 健,羅 藝,蔣 安

    (重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 402460)

    飼草玉米SAUMZ1(Zeamays)是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的科研人員以玉米和具有相關(guān)優(yōu)良基因的近緣種屬[大芻草(Z.diploperennis)等]為親本材料,采用分子育種技術(shù),進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新,經(jīng)過多年選育而成的一個(gè)產(chǎn)量高、飼用品質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性廣的多年生優(yōu)質(zhì)飼草玉米[1]。研究表明,飼草玉米SAUMZ1適合在重慶地區(qū)推廣利用,但其越冬情況較差,中海拔地區(qū)越冬率較低,自然越冬率為21.4%;低海拔地區(qū)自然越冬率為60.5%,在大部分地區(qū)難以實(shí)現(xiàn)多年生長和利用[2]。如果通過育種技術(shù)增強(qiáng)飼草玉米的抗寒能力,提高其在寒冷地區(qū)的越冬率,拓寬牧草生長的地理范圍,就可以提高草種利用效率,延長生長時(shí)間,提高牧草產(chǎn)量和品質(zhì),從而增加種植飼草玉米的經(jīng)濟(jì)效益。

    與傳統(tǒng)育種方法相比,植物基因工程育種周期短、見效快,打破了物種之間生殖隔離障礙,大大擴(kuò)展了育種的范圍,在牧草遺傳育種中占有越來越重要的地位。CBF(C-repeat Binding Factor)基因是一類受低溫誘導(dǎo)的反式作用因子,其編碼產(chǎn)物能與多個(gè)抗逆基因啟動子上的順式作用元件CRT/DRE特異結(jié)合,從而啟動下游多個(gè)冷誘導(dǎo)和脫水誘導(dǎo)基因的表達(dá)[3-4],激活植物體內(nèi)的多種耐逆機(jī)制,并且它極有可能是控制抗寒基因表達(dá)的主開關(guān)[5]。CBF轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)為植物耐逆性的改良研究提供了新的思路[6],該轉(zhuǎn)錄因子在改良植物耐寒性方面具有廣泛的應(yīng)用前景。目前,許多國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)通過導(dǎo)入CBF基因來提高作物的抗寒性[7],在水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatobacum)、油菜(Brassicacampestris)、草莓(Fragariaananassa)、番茄(Solanumlycopersicum)、小麥(Triticumaestivum)、高羊茅(Festucaarundinacea)、胡楊(Populuseuphratica)等植物上獲得了成功[8-9]。甄偉等[10]將CBF1轉(zhuǎn)入油菜和煙草中,電解質(zhì)滲漏法檢測轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗寒性比對照植株明顯提高,轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗寒性也有一定程度的提高。金萬梅等[11]用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將擬南芥的冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子CBF1導(dǎo)入草莓中,抗寒生理鑒定結(jié)果表明,CBF1基因可以提高草莓對低溫脅迫的抵抗力。

    本研究開展擬南芥CBF1轉(zhuǎn)化飼草玉米SAUMZ1,并對轉(zhuǎn)基因飼草玉米的抗寒性進(jìn)行鑒定分析,以期揭示出玉米基因組中CBF1類似轉(zhuǎn)錄激活因子是否調(diào)控抗寒基因,明確利用擬南芥CBF1轉(zhuǎn)錄激活因子來創(chuàng)新飼草玉米抗寒新材料的可行性,以期為培育具有較高抗寒能力的轉(zhuǎn)基因飼草玉米新品種奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1材料 植物材料飼草玉米SAUMZ1由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供;農(nóng)桿菌LBA4404、真核表達(dá)載體pBI121和其他菌種、質(zhì)粒為西南大學(xué)花卉實(shí)驗(yàn)室提供;序列測定由上海生物技術(shù)公司完成;各種核酸限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶等為寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn);所有引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。分化培養(yǎng)基:MS+0.5 mg·L-16-BA+100 μg·mL-1Kan+0.2 mg·L-1NAA;繼代培養(yǎng)基:MS+0.5 mg·L-16-BA;生根培養(yǎng)基:MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-1IBA。

    1.2方法

    1.2.1擬南芥CBF1的克隆

    1)引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)NCBI上公布的擬南芥CBF1基因序列設(shè)計(jì)一對引物,引物序列如下:

    上游引物(CBF1-UP)為:5′- C■GTACTCTGATCAATGAACTCATT-3′;

    下游引物(CBF1-DOWN):5′-C◆GGAAACGACTATCGAATATTAGT-3′。

    其中,■為BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC,◆為SacI酶切位點(diǎn)GAGCTC。

    2)CBF1基因序列的克隆

    采用分別加入BamHI和SacI酶切位點(diǎn)的上游引物(CBF1-UP)和下游引物(CBF1-DOWN)擴(kuò)增擬南芥(哥倫比亞野生型)基因組DNA,PCR擴(kuò)增體系為20 μL,擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,共循環(huán)35次,72 ℃延伸10 min,在18 ℃時(shí)結(jié)束反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物連接T-Easy載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài),挑取陽性克隆,用含卡拉霉素的液體LB搖菌培養(yǎng)過夜,獲得含目的基因序列的菌體。

    1.2.2對擴(kuò)增出的序列進(jìn)行初步分析 從擬南芥基因組DNA擴(kuò)增出的序列中挑選一個(gè)單克隆進(jìn)行測序,將測序結(jié)果與GenBank登陸的CBF1基因序列用DANMAN軟件進(jìn)行對比分析,初步分析其功能屬性。

    1.2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建 質(zhì)粒DNA提取、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備以及酶切、連接等植物表達(dá)載體構(gòu)建過程參考文獻(xiàn)[12-13]。采用凍融法[12]將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

    1.2.4農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備(CaCl2法)

    1)挑選LBA4404農(nóng)桿菌單菌落,接種于含Sm 125 mg·L-1的5 mL YEB液體培養(yǎng)基中,28 ℃下?lián)u菌2 d(250 r·min-1)。

    2)將過夜活化的菌液2 mL轉(zhuǎn)入新鮮YEB液體培養(yǎng)基50 mL中,28 ℃下?lián)u菌至OD600 nm值0.5,冰浴30 min。

    3)4 ℃,5 000 r·min-1,離心5 min,去除上清液,收集菌體。

    4)加10 mL冷的0.15 mol·L-1的NaCl重懸浮菌體,4 ℃下5 000 r·min-1離心5 min,倒掉上清液。

    5)用1 mL冷的CaCl2(20 mmol·L-1)重懸浮菌體,加入15%~20%的甘油。

    6)分裝成每管100 μL,液氮中冷凍后置于低溫冰箱-80 ℃保存。

    1.2.5飼草玉米SAUMZ1的轉(zhuǎn)化 無菌的飼草玉米SAUMZ1嫩葉沿著橫向切成2 mm左右的小條,在農(nóng)桿菌菌液中浸泡20 min。用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液,轉(zhuǎn)入上面鋪有一層濾紙的MS基本培養(yǎng)基,在28 ℃下暗培養(yǎng)3 d,然后轉(zhuǎn)到含有抗生素的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。待抗性芽生長為2~3 cm高時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

    1.2.6轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 用CBF1基因引物(CBF1-UP和CBF1-DOWN)對轉(zhuǎn)基因再生植株總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測是否擴(kuò)增出了CBF1轉(zhuǎn)錄因子基因的片段。

    1.2.7相對電導(dǎo)率的測定 本試驗(yàn)采用人工模擬冷凍試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)基因植株玉米草抗寒性,選取玉米草幼苗,用去離子水沖洗2~3次,再用濾紙吸干表面水分,剪成1 cm長的小段放入10 mL的離心管中,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),分別放入-4、-8、-12、-16 ℃低溫中處理30 min后取出,置于4 ℃的冰箱30 min后,加入5 mL去離子水,真空抽氣7 min,然后靜置1.5 h,用DDS-ⅡA型電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率,然后將樣品置于沸水浴15 min,使質(zhì)膜完全破壞,取出在自來水中冷卻5 min,冷卻至室溫后再次測定電導(dǎo)率,按以下公式計(jì)算低溫脅迫對植物相對電導(dǎo)率[14]。

    2 結(jié)果

    2.1擬南芥CBF1的克隆 本試驗(yàn)從擬南芥(哥倫比亞野生型)的基因組DNA中擴(kuò)增出一段686 bp長的序列,挑選單克隆進(jìn)行測序,初步分析發(fā)現(xiàn)該序列包含一個(gè)642 bp的最大開放閱讀框。用DANMAN軟件將所測序列與GenBank登陸的CBF1基因序列進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示二者同源性高達(dá)99.84%。所測序列第426位堿基G被置換成A,導(dǎo)致第142位的一個(gè)氨基酸與GenBank上的不同,但這一位置并不在CBF1轉(zhuǎn)錄因子的功能結(jié)構(gòu)域上,推測這一處堿基的變化并不會影響其基因功能。因此,所克隆到的產(chǎn)物應(yīng)該具有正常的生理功能。

    2.2植物表達(dá)載體構(gòu)建

    2.2.1構(gòu)建流程 因?yàn)橹参锉磉_(dá)載體pBI121中的Gus基因兩端帶有限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI酶切位點(diǎn),所以設(shè)計(jì)引物(CBF1-UP和CBF1-DOWN)時(shí)特意加入了這兩個(gè)酶切位點(diǎn),擴(kuò)增出的CBF1基因序列兩端也就有了這兩個(gè)位點(diǎn)。同時(shí),載體pBI121帶有NptⅡ基因序列,可用于篩選被轉(zhuǎn)化細(xì)胞,它還帶有CaMv35s啟動子,能啟動雙子葉植物細(xì)胞中外源基因的表達(dá)。因此,本試驗(yàn)利用BamHI和SacⅠ這兩個(gè)酶切位點(diǎn)將pBI121的Gus結(jié)構(gòu)序列(1.9 kb)切除,并同時(shí)保留了CaMv35s啟動子、Nos終止子等其他部分,總長為10.9 kb,將這部分序列與約686 bp長的CBF1基因序列連接之后,就構(gòu)建成了一個(gè)植物表達(dá)載體,命名為pBI121-CBF1(圖1)。

    2.2.2植物表達(dá)載體酶切鑒定 將重組質(zhì)粒pBI121-CBF1用限制性內(nèi)切酶BanmHI和SacI進(jìn)行酶切,凝膠電泳結(jié)果顯示獲得了長約0.7和10.9 kb的兩個(gè)條帶,與預(yù)期結(jié)果相符,證實(shí)重組質(zhì)粒中含有目的基因CBF1片段(圖2)。

    圖 1 pBI121-CBF1植物表達(dá)載體圖譜Fig.1 Map of plant expression vector pBI121-CBF1

    圖2 酶切鑒定重組質(zhì)粒pBI121-CBF1Fig.2 Result of enzyme digestion of pBI121-CBF1

    取上述玉米草抗性植株和對照植株的總DNA,用加入BanmHI和SacI酶切位點(diǎn)引物(CBF1-UP和CBF1-DOWN)直接對總DNA進(jìn)行PCR,結(jié)果從抗性植株總DNA中擴(kuò)增出了預(yù)期的約686 bp的片段,而對照組則沒有(圖3),表明擬南芥CBF1基因已整合到玉米草基因組中。

    2.4轉(zhuǎn)基因玉米草低溫下相對電導(dǎo)率的變化 對所獲轉(zhuǎn)基因玉米草在低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率的測定結(jié)果表明,玉米草植株經(jīng)過低溫脅迫后,隨著處理溫度的降低,其相對電導(dǎo)率的變化呈上升趨勢,且變化明顯,轉(zhuǎn)基因飼草玉米SAUMZ1葉片相對電導(dǎo)率在各種低溫下均比對照組低,說明轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜受低溫傷害程度小于對照組(圖4)。

    圖3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定Fig.3 PCR detection of transgenic plants

    3 討論

    低溫是危害和限制我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素,而農(nóng)作物的抗寒性是由多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀。近年來的研究表明,CBF1是一個(gè)冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子,能夠調(diào)控下游多個(gè)抗寒基因的表達(dá),因此,轉(zhuǎn)入CBF1基因是提高植物耐寒性的一條有效途徑。實(shí)踐證明,過量表達(dá)CBF1基因可以提高水稻、小麥等農(nóng)作物的抗寒性。本研究將克隆到的擬南芥CBF1基因轉(zhuǎn)入飼草玉米SAUMZ1中也獲得了抗寒性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因玉米草新材料。

    植物細(xì)胞電解質(zhì)滲出率是用來衡量細(xì)胞內(nèi)溶物擴(kuò)散到細(xì)胞外程度的一項(xiàng)生理指標(biāo)[15],也是衡量細(xì)胞質(zhì)膜是否受傷害和細(xì)胞組織幼嫩程度的指標(biāo)。由于植物細(xì)胞膜是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的主要通道,在環(huán)境脅迫下,細(xì)胞膜最為敏感,當(dāng)?shù)蜏孛{迫時(shí),傷害最先發(fā)生于細(xì)胞膜系統(tǒng),造成膜脂過氧化作用增強(qiáng),膜透性增大,離子發(fā)生泄漏,最終可以導(dǎo)致植物死亡[16-17]。因此,本研究采用低溫脅迫下細(xì)胞相對電導(dǎo)率方法檢測植株抗寒能力。植株體細(xì)胞的相對電導(dǎo)率能夠反映細(xì)胞膜受損害的程度,相對電導(dǎo)率越高,則細(xì)胞膜受傷害就越嚴(yán)重。本研究表明,轉(zhuǎn)基因植株的相對電導(dǎo)率隨溫度降低而呈現(xiàn)上升趨勢,在不同低溫脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株的相對電導(dǎo)率均低于對照組。由此可以判斷,轉(zhuǎn)基因玉米草植株在低溫脅迫時(shí)相對于對照組的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定,細(xì)胞受傷害程度較低,表明植株抗寒性有所提高。

    圖4 低溫脅迫后相對電導(dǎo)率的變化Fig.4 Change of cell membrane permeability after chilling stress

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