CBF1基因轉(zhuǎn)化飼草玉米SAUMZ1提高抗寒性的研究

向白菊,李成君,張 健,羅 藝,蔣 安

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

飼草玉米SAUMZ1(Zeamays)是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的科研人員以玉米和具有相關(guān)優(yōu)良基因的近緣種屬[大芻草(Z.diploperennis)等]為親本材料，采用分子育種技術(shù)，進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，經(jīng)過多年選育而成的一個(gè)產(chǎn)量高、飼用品質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性廣的多年生優(yōu)質(zhì)飼草玉米[1]。研究表明，飼草玉米SAUMZ1適合在重慶地區(qū)推廣利用，但其越冬情況較差，中海拔地區(qū)越冬率較低，自然越冬率為21.4%；低海拔地區(qū)自然越冬率為60.5%，在大部分地區(qū)難以實(shí)現(xiàn)多年生長和利用[2]。如果通過育種技術(shù)增強(qiáng)飼草玉米的抗寒能力，提高其在寒冷地區(qū)的越冬率，拓寬牧草生長的地理范圍，就可以提高草種利用效率，延長生長時(shí)間，提高牧草產(chǎn)量和品質(zhì)，從而增加種植飼草玉米的經(jīng)濟(jì)效益。

與傳統(tǒng)育種方法相比，植物基因工程育種周期短、見效快，打破了物種之間生殖隔離障礙，大大擴(kuò)展了育種的范圍，在牧草遺傳育種中占有越來越重要的地位。CBF(C-repeat Binding Factor)基因是一類受低溫誘導(dǎo)的反式作用因子，其編碼產(chǎn)物能與多個(gè)抗逆基因啟動子上的順式作用元件CRT/DRE特異結(jié)合，從而啟動下游多個(gè)冷誘導(dǎo)和脫水誘導(dǎo)基因的表達(dá)[3-4]，激活植物體內(nèi)的多種耐逆機(jī)制，并且它極有可能是控制抗寒基因表達(dá)的主開關(guān)[5]。CBF轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)為植物耐逆性的改良研究提供了新的思路[6]，該轉(zhuǎn)錄因子在改良植物耐寒性方面具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，許多國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)通過導(dǎo)入CBF基因來提高作物的抗寒性[7]，在水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatobacum)、油菜(Brassicacampestris)、草莓(Fragariaananassa)、番茄(Solanumlycopersicum)、小麥(Triticumaestivum)、高羊茅(Festucaarundinacea)、胡楊(Populuseuphratica)等植物上獲得了成功[8-9]。甄偉等[10]將CBF1轉(zhuǎn)入油菜和煙草中，電解質(zhì)滲漏法檢測轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗寒性比對照植株明顯提高，轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗寒性也有一定程度的提高。金萬梅等[11]用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將擬南芥的冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子CBF1導(dǎo)入草莓中，抗寒生理鑒定結(jié)果表明，CBF1基因可以提高草莓對低溫脅迫的抵抗力。

本研究開展擬南芥CBF1轉(zhuǎn)化飼草玉米SAUMZ1，并對轉(zhuǎn)基因飼草玉米的抗寒性進(jìn)行鑒定分析，以期揭示出玉米基因組中CBF1類似轉(zhuǎn)錄激活因子是否調(diào)控抗寒基因，明確利用擬南芥CBF1轉(zhuǎn)錄激活因子來創(chuàng)新飼草玉米抗寒新材料的可行性，以期為培育具有較高抗寒能力的轉(zhuǎn)基因飼草玉米新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 植物材料飼草玉米SAUMZ1由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供；農(nóng)桿菌LBA4404、真核表達(dá)載體pBI121和其他菌種、質(zhì)粒為西南大學(xué)花卉實(shí)驗(yàn)室提供；序列測定由上海生物技術(shù)公司完成；各種核酸限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶等為寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)；所有引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。分化培養(yǎng)基：MS+0.5 mg·L-16-BA+100 μg·mL-1Kan+0.2 mg·L-1NAA；繼代培養(yǎng)基：MS+0.5 mg·L-16-BA；生根培養(yǎng)基：MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-1IBA。

1.2方法

1.2.1擬南芥CBF1的克隆

1)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上公布的擬南芥CBF1基因序列設(shè)計(jì)一對引物，引物序列如下：

上游引物(CBF1-UP)為：5′- C■GTACTCTGATCAATGAACTCATT-3′；

下游引物(CBF1-DOWN)：5′-C◆GGAAACGACTATCGAATATTAGT-3′。

其中，■為BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC，◆為SacI酶切位點(diǎn)GAGCTC。

2)CBF1基因序列的克隆

采用分別加入BamHI和SacI酶切位點(diǎn)的上游引物(CBF1-UP)和下游引物(CBF1-DOWN)擴(kuò)增擬南芥(哥倫比亞野生型)基因組DNA，PCR擴(kuò)增體系為20 μL，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，在18 ℃時(shí)結(jié)束反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物連接T-Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取陽性克隆，用含卡拉霉素的液體LB搖菌培養(yǎng)過夜，獲得含目的基因序列的菌體。

1.2.2對擴(kuò)增出的序列進(jìn)行初步分析 從擬南芥基因組DNA擴(kuò)增出的序列中挑選一個(gè)單克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank登陸的CBF1基因序列用DANMAN軟件進(jìn)行對比分析，初步分析其功能屬性。

1.2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建 質(zhì)粒DNA提取、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備以及酶切、連接等植物表達(dá)載體構(gòu)建過程參考文獻(xiàn)[12-13]。采用凍融法[12]將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

1.2.4農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備(CaCl2法)

1)挑選LBA4404農(nóng)桿菌單菌落，接種于含Sm 125 mg·L-1的5 mL YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下?lián)u菌2 d(250 r·min-1)。

2)將過夜活化的菌液2 mL轉(zhuǎn)入新鮮YEB液體培養(yǎng)基50 mL中，28 ℃下?lián)u菌至OD600 nm值0.5,冰浴30 min。

3)4 ℃,5 000 r·min-1,離心5 min，去除上清液，收集菌體。

4)加10 mL冷的0.15 mol·L-1的NaCl重懸浮菌體，4 ℃下5 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液。

5)用1 mL冷的CaCl2(20 mmol·L-1)重懸浮菌體，加入15%～20%的甘油。

6)分裝成每管100 μL，液氮中冷凍后置于低溫冰箱-80 ℃保存。

1.2.5飼草玉米SAUMZ1的轉(zhuǎn)化 無菌的飼草玉米SAUMZ1嫩葉沿著橫向切成2 mm左右的小條，在農(nóng)桿菌菌液中浸泡20 min。用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，轉(zhuǎn)入上面鋪有一層濾紙的MS基本培養(yǎng)基，在28 ℃下暗培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)到含有抗生素的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。待抗性芽生長為2～3 cm高時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

1.2.6轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 用CBF1基因引物(CBF1-UP和CBF1-DOWN)對轉(zhuǎn)基因再生植株總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測是否擴(kuò)增出了CBF1轉(zhuǎn)錄因子基因的片段。

1.2.7相對電導(dǎo)率的測定 本試驗(yàn)采用人工模擬冷凍試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)基因植株玉米草抗寒性，選取玉米草幼苗，用去離子水沖洗2～3次，再用濾紙吸干表面水分，剪成1 cm長的小段放入10 mL的離心管中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別放入-4、-8、-12、-16 ℃低溫中處理30 min后取出，置于4 ℃的冰箱30 min后，加入5 mL去離子水，真空抽氣7 min，然后靜置1.5 h，用DDS-ⅡA型電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率，然后將樣品置于沸水浴15 min，使質(zhì)膜完全破壞，取出在自來水中冷卻5 min，冷卻至室溫后再次測定電導(dǎo)率，按以下公式計(jì)算低溫脅迫對植物相對電導(dǎo)率[14]。

2 結(jié)果

2.1擬南芥CBF1的克隆 本試驗(yàn)從擬南芥(哥倫比亞野生型)的基因組DNA中擴(kuò)增出一段686 bp長的序列，挑選單克隆進(jìn)行測序，初步分析發(fā)現(xiàn)該序列包含一個(gè)642 bp的最大開放閱讀框。用DANMAN軟件將所測序列與GenBank登陸的CBF1基因序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示二者同源性高達(dá)99.84%。所測序列第426位堿基G被置換成A，導(dǎo)致第142位的一個(gè)氨基酸與GenBank上的不同，但這一位置并不在CBF1轉(zhuǎn)錄因子的功能結(jié)構(gòu)域上，推測這一處堿基的變化并不會影響其基因功能。因此，所克隆到的產(chǎn)物應(yīng)該具有正常的生理功能。

2.2植物表達(dá)載體構(gòu)建

2.2.1構(gòu)建流程 因?yàn)橹参锉磉_(dá)載體pBI121中的Gus基因兩端帶有限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI酶切位點(diǎn)，所以設(shè)計(jì)引物(CBF1-UP和CBF1-DOWN)時(shí)特意加入了這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增出的CBF1基因序列兩端也就有了這兩個(gè)位點(diǎn)。同時(shí)，載體pBI121帶有NptⅡ基因序列，可用于篩選被轉(zhuǎn)化細(xì)胞，它還帶有CaMv35s啟動子，能啟動雙子葉植物細(xì)胞中外源基因的表達(dá)。因此，本試驗(yàn)利用BamHI和SacⅠ這兩個(gè)酶切位點(diǎn)將pBI121的Gus結(jié)構(gòu)序列(1.9 kb)切除，并同時(shí)保留了CaMv35s啟動子、Nos終止子等其他部分，總長為10.9 kb，將這部分序列與約686 bp長的CBF1基因序列連接之后，就構(gòu)建成了一個(gè)植物表達(dá)載體，命名為pBI121-CBF1(圖1)。

2.2.2植物表達(dá)載體酶切鑒定 將重組質(zhì)粒pBI121-CBF1用限制性內(nèi)切酶BanmHI和SacI進(jìn)行酶切，凝膠電泳結(jié)果顯示獲得了長約0.7和10.9 kb的兩個(gè)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，證實(shí)重組質(zhì)粒中含有目的基因CBF1片段(圖2)。

圖 1 pBI121-CBF1植物表達(dá)載體圖譜Fig.1 Map of plant expression vector pBI121-CBF1

圖2 酶切鑒定重組質(zhì)粒pBI121-CBF1Fig.2 Result of enzyme digestion of pBI121-CBF1

取上述玉米草抗性植株和對照植株的總DNA，用加入BanmHI和SacI酶切位點(diǎn)引物(CBF1-UP和CBF1-DOWN)直接對總DNA進(jìn)行PCR，結(jié)果從抗性植株總DNA中擴(kuò)增出了預(yù)期的約686 bp的片段，而對照組則沒有(圖3)，表明擬南芥CBF1基因已整合到玉米草基因組中。

2.4轉(zhuǎn)基因玉米草低溫下相對電導(dǎo)率的變化 對所獲轉(zhuǎn)基因玉米草在低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率的測定結(jié)果表明，玉米草植株經(jīng)過低溫脅迫后，隨著處理溫度的降低，其相對電導(dǎo)率的變化呈上升趨勢，且變化明顯，轉(zhuǎn)基因飼草玉米SAUMZ1葉片相對電導(dǎo)率在各種低溫下均比對照組低，說明轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜受低溫傷害程度小于對照組(圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定Fig.3 PCR detection of transgenic plants

3 討論

低溫是危害和限制我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素，而農(nóng)作物的抗寒性是由多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀。近年來的研究表明，CBF1是一個(gè)冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠調(diào)控下游多個(gè)抗寒基因的表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)入CBF1基因是提高植物耐寒性的一條有效途徑。實(shí)踐證明，過量表達(dá)CBF1基因可以提高水稻、小麥等農(nóng)作物的抗寒性。本研究將克隆到的擬南芥CBF1基因轉(zhuǎn)入飼草玉米SAUMZ1中也獲得了抗寒性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因玉米草新材料。

植物細(xì)胞電解質(zhì)滲出率是用來衡量細(xì)胞內(nèi)溶物擴(kuò)散到細(xì)胞外程度的一項(xiàng)生理指標(biāo)[15]，也是衡量細(xì)胞質(zhì)膜是否受傷害和細(xì)胞組織幼嫩程度的指標(biāo)。由于植物細(xì)胞膜是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的主要通道，在環(huán)境脅迫下，細(xì)胞膜最為敏感，當(dāng)?shù)蜏孛{迫時(shí)，傷害最先發(fā)生于細(xì)胞膜系統(tǒng)，造成膜脂過氧化作用增強(qiáng)，膜透性增大，離子發(fā)生泄漏，最終可以導(dǎo)致植物死亡[16-17]。因此，本研究采用低溫脅迫下細(xì)胞相對電導(dǎo)率方法檢測植株抗寒能力。植株體細(xì)胞的相對電導(dǎo)率能夠反映細(xì)胞膜受損害的程度，相對電導(dǎo)率越高，則細(xì)胞膜受傷害就越嚴(yán)重。本研究表明，轉(zhuǎn)基因植株的相對電導(dǎo)率隨溫度降低而呈現(xiàn)上升趨勢，在不同低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的相對電導(dǎo)率均低于對照組。由此可以判斷，轉(zhuǎn)基因玉米草植株在低溫脅迫時(shí)相對于對照組的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，細(xì)胞受傷害程度較低，表明植株抗寒性有所提高。

圖4 低溫脅迫后相對電導(dǎo)率的變化Fig.4 Change of cell membrane permeability after chilling stress

[1] 王琳，范彥，何瑋，等．飼草玉米SAUMZ1不同生育期飼用價(jià)值的分析[J]．飼料研究,2007(7):3-6.

[2] 范彥，何瑋，王琳，等．玉米新材料——飼草玉米SAUMZ1在重慶地區(qū)的生產(chǎn)性能評定[J]．草業(yè)與畜牧,2007(12)：15-18.

[3] Stockkinger E J，Gilmour S J，Thomashow M F．Arabidopsis thalianaCBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulate stranscription in response to low temperature and water deficit[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences USA，1997，94：1035-1040．

[4] Ito Y，Katsura K，Maruyama K，etal．Functional analysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice[J]．Plant Cell Physiology，2006，47(1)：141-153．

[5] Thomashow M K．So what’s new in the field of plant cold acclimation lots[J]．Plant Physiology，2001，125(1)：89-93．

[6] 王洋，胡吉吉，王崇英，等．?dāng)M南芥CBF/DREB途徑的研究進(jìn)展及其在植物基因工程中的應(yīng)用[J]．生物物理學(xué)報(bào)，2007，23 (2)：101-108．

[7] 劉強(qiáng)，趙南明．DREB轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性中的作用[J]．科學(xué)通報(bào)，2000，45(1)：11-16．

[8] 張麗麗，李景富，王傲雪，等．轉(zhuǎn)錄激活因子CBF1基因在植物抗冷分子機(jī)制中的作用[J]．園藝學(xué)報(bào)，2008，35(5)：765-771．

[9] 吳關(guān)庭，陳錦清，胡張華,等．根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得耐逆性增強(qiáng)的高羊茅轉(zhuǎn)基因植株[J]．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(12)：2395-2402.

[10] 甄偉，陳溪，孫恩洋,等．冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)化油菜和煙草及抗寒性鑒定[J]．自然科學(xué)進(jìn)展，2000，10(12)：1104-1109．

[11] 金萬梅，董靜，尹淑萍，等．冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)化草莓及其抗寒性鑒定[J]．西北植物學(xué)報(bào)，2007，27(2)：0223-0227.

[12] Sambrook J， Russell D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂,譯.北京：科學(xué)出版社,2005.

[13] 王關(guān)林，方宏鈞.植物基因工程原理與技術(shù)[M].北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

[14] 房義福，吳曉星，李長貴，等．電導(dǎo)法對11種常綠闊葉樹種抗寒性的測定[J]．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35(12)：16-17．

[15] 王連敏，王立志，張國民，等．苗期低溫對玉米體內(nèi)脯氨酸、電導(dǎo)率及光合作用的影響[J]．中國農(nóng)業(yè)氣象，1999，20(2)：28-30．

[16] 王以柔．在黑暗和光照條件下低溫對水稻幼苗光合器官膜脂過氧化作用的影響[J]．植物生理學(xué)報(bào)，1986，12(3)：244-251．

[17] Badawi M,Danyluk J,Boucho B，etal．TheCBFgene family in hexaploid wheat and its relationship to the phylogenetic complexity of cerealCBFs[J]．Molecular Genetics and Genomics，2007，277(5)：533-554．