香梨越冬期樹(shù)干形成層保護(hù)酶活性變化特性分析

鄭曉輝，巴特爾·巴克*，海利力·庫(kù)爾班，茹鮮·木沙，劉珊珊

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052）

植物體內(nèi)有許多酶參與生化反應(yīng)，調(diào)節(jié)和控制著代謝的方向和速率。正常情況下，植物依賴(lài)體內(nèi)存在的活性氧清除系統(tǒng)，包括SOD、POD和CAT等維持自由基生成與消除的動(dòng)態(tài)平衡，因此對(duì)活性氧清除的能力是決定細(xì)胞應(yīng)對(duì)脅迫抗性的關(guān)鍵因素。整個(gè)保護(hù)酶系統(tǒng)防御能力的強(qiáng)弱取決于這幾種酶相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。而植物體內(nèi)保護(hù)酶活性的強(qiáng)弱受到溫度變化的直接影響：凍害發(fā)生時(shí)，細(xì)胞中原生質(zhì)過(guò)度脫水，蛋白質(zhì)變性，酶活性下降或喪失，冰晶體還會(huì)對(duì)細(xì)胞造成物理性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；日灼發(fā)生時(shí)，由于溫度過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性或凝固，酶失去活性，組織脫水灼傷甚至死亡，外在表現(xiàn)為樹(shù)干干燥開(kāi)裂，葉片出現(xiàn)死斑。內(nèi)陸地區(qū)冬季樹(shù)干南側(cè)受日光直射，皮層內(nèi)溫度上升到20℃或更高，而北側(cè)皮層內(nèi)溫度與氣溫（0～5℃）大致相同，這種冷熱不均，使皮層與木質(zhì)部?jī)?nèi)脹外縮，皮層開(kāi)裂[1]。當(dāng)日灼和凍害同時(shí)發(fā)生時(shí)，不僅會(huì)造成樹(shù)干、大枝樹(shù)皮組織損傷，骨干枝部位縱裂，影響水分和養(yǎng)分供給，還會(huì)使樹(shù)勢(shì)生長(zhǎng)減弱，腐爛病、干腐病等病害蔓延，以至于死樹(shù)毀園，造成嚴(yán)重危害[2]。

庫(kù)爾勒香梨屬于新疆梨種（Pyrus sinkiangensis Yü），是新疆傳統(tǒng)地方品種。2002年巴州庫(kù)爾勒香梨種植面積達(dá)3.33×104hm2[3]，至2010年底達(dá)3.61×104hm2。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期栽培馴化，使香梨具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性。然而，由于不利的氣候條件及近30年的氣候異常等，已嚴(yán)重影響庫(kù)爾勒香梨的正常生長(zhǎng)發(fā)育，甚至因越冬傷害導(dǎo)致大量樹(shù)體死亡[4]。本文通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定越冬期間香梨樹(shù)干形成層保護(hù)酶活性變化特性，為后續(xù)的香梨越冬防護(hù)工作提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州庫(kù)爾勒市上戶(hù)鎮(zhèn)哈拉蘇村金友聯(lián)果品有限公司果園進(jìn)行。該地區(qū)屬于暖溫帶大陸性干旱氣候（E 86°08'，N 41°45'），多年平均總?cè)照諘r(shí)數(shù)2990 h，年平均氣溫13.2℃，年極端最低氣溫-28℃，年極端最高氣溫38.2℃，1～3月逐日最低氣溫平均值-19℃，逐日最高氣溫平均值22℃；年降水量55 mm，年最大蒸發(fā)量為2788.2 mm，無(wú)霜期210 d，主風(fēng)風(fēng)向?yàn)闁|北風(fēng)，海拔高度931.5 m。土壤母質(zhì)為山前沖積扇上緣，土壤類(lèi)型為荒漠風(fēng)沙土，1 m土層土壤質(zhì)地為沙礫至沙土[3-5]。試驗(yàn)材料為庫(kù)爾勒香梨，試驗(yàn)果園面積24 hm2（四圍也是梨園），梨樹(shù)株行距為4 m×5 m，株齡8年，樹(shù)干胸徑12～15 cm。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

取樣時(shí)間為2009年1月22日、2月19日、3月21日。選取8棵（重復(fù)）直徑相仿、株齡8年且健康的梨樹(shù)，在離地50～60 cm高的樹(shù)干陰、陽(yáng)面鑿取包括韌皮部、形成層2.5 cm寬，5 cm長(zhǎng)的樹(shù)皮組織（不取木質(zhì)部）樣本并截取3～4個(gè)帶芽的當(dāng)年生枝條，然后把樹(shù)皮組織樣本和枝條分別截至2 cm長(zhǎng)，干凈紗布包裹，標(biāo)記后放入液氮罐中，由于需測(cè)定數(shù)據(jù)較多，先將樣品轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室后置于-30℃冰箱中保存，時(shí)間不超過(guò)24 h。

酶液提?。悍Q(chēng)取鮮樣0.1～0.2 g于預(yù)冷的研缽中，加入2 mL預(yù)冷的提取介質(zhì)（50 mmol·L-1，pH 7.8的磷酸緩沖液，內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）研磨至勻漿，再加入提取介質(zhì)充分研磨沖洗，使終體積為5 mL，4℃下15000 g超速冷凍離心15 min，上清液即為酶提取液。

1.2.2 酶活性測(cè)定

SOD活性測(cè)定采用NBT（氮蘭四唑）顯色法[6]；POD活性測(cè)定采用李合生等方法[7]；CAT活性測(cè)定采用分光光度法，利用高錳酸鉀滴定法和紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性[8]。每個(gè)樣品測(cè)定5次。

1.2.3 樹(shù)干形成層溫度的測(cè)定

測(cè)量點(diǎn)取果園中心位置；相鄰兩行中選取健康的梨樹(shù)3棵（重復(fù)），在樹(shù)干陽(yáng)、陰面離地面50～60 cm高處樹(shù)皮形成層與樹(shù)皮中間插入植物體內(nèi)熱電偶溫度傳感器（型號(hào)：AV-AT），采用AR5數(shù)據(jù)采集器采集連續(xù)3個(gè)月的溫度數(shù)據(jù)，詳細(xì)監(jiān)測(cè)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用DPS軟件對(duì)庫(kù)爾勒香梨不同部位形成層酶活性進(jìn)行多重比較，用Excel統(tǒng)計(jì)酶活性與溫度的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 香梨取樣期間氣象條件及樹(shù)干形成層溫度變化

1～3月樹(shù)干形成層溫度變化與氣溫高低關(guān)系密切（見(jiàn)表1），當(dāng)氣溫升高時(shí)，太陽(yáng)輻射增強(qiáng)，樹(shù)干形成層溫度也隨之升高，反之亦然。隨著氣溫升高，形成層極端最低、最高溫度都有所升高。

表1 氣溫與樹(shù)干形成層溫度變化關(guān)系Table 1 Temperature change relationship between air and trunk cambium(℃)

1～3月陽(yáng)面和陰面樹(shù)干形成層極端溫度有所差異（見(jiàn)表1）。陽(yáng)面形成層極端最低溫度均低于陰面，極端最高溫度又均高于陰面。故陽(yáng)面形成層溫度日溫差大于陰面，陽(yáng)面日溫差最高值出現(xiàn)在2009年1月17日，達(dá)33.14℃，比陰面日溫差高17.14℃。冬季由于林木進(jìn)入休眠期，抗凍性增強(qiáng)，但抗相對(duì)高溫能力下降。因此，日灼傷害在樹(shù)干陽(yáng)面出現(xiàn)幾率比陰面大[9]。

樹(shù)干形成層溫度24 h變化：1月份日出前陰面形成層溫度略高于陽(yáng)面，日出后陽(yáng)陰面形成層溫度都呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，陽(yáng)面增幅高于陰面，14:00左右達(dá)到高峰值，隨后溫度持續(xù)下降，日落后陰面溫度降幅小于陽(yáng)面，陽(yáng)面溫度略低于陰面；2月份樹(shù)干陽(yáng)陰面形成層溫度變化與1月份相似，峰值出現(xiàn)在15:00左右，溫差達(dá)15℃左右；3月份日出前陰面溫度略高，日出后陽(yáng)陰面形成層溫度快速升高，陽(yáng)面增幅較快，峰值出現(xiàn)在16:00左右，隨后溫度開(kāi)始下降，陽(yáng)面溫度降幅較大。

2.2 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)SOD活性變化

由表2可知，同一個(gè)部位2月份酶活性均比其在1月份和3月份數(shù)據(jù)高，但各不同部位SOD酶活性差異不顯著。在持續(xù)低溫下，陽(yáng)面酶活性較高，因?yàn)槎┐撼跗陂g，白天氣溫在0℃以上，夜間氣溫小于等于0℃，晝夜溫差常達(dá)10℃以上，樹(shù)皮向陽(yáng)面受陽(yáng)光直射，增溫快，溫差大，使形成層組織受損，細(xì)胞內(nèi)將產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，迫使陽(yáng)面形成層內(nèi)將產(chǎn)生大量SOD，清除細(xì)胞中的自由基，以免機(jī)體受到損害[10]。

表2 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干不同組織器官SOD活性變化Table 2 SOD activities variation in parts of Fragrant Pear trunk

超氧化物歧化酶活力變化趨勢(shì)為先升后降。因降溫初期梨樹(shù)在低溫條件下，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的超氧物陰離子自由基，為維持體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)，需要高活力的SOD酶來(lái)清除過(guò)多的自由基。但隨著溫度的降低，當(dāng)溫度下降到超過(guò)各產(chǎn)量對(duì)寒冷的忍耐限度，自由基產(chǎn)生過(guò)多，細(xì)胞發(fā)生膜脂氧化作用，從而SOD活性一直降低[11]。樹(shù)體將遭到比較嚴(yán)重的凍害，高濃度的自由基超過(guò)傷害“閾值”，必將導(dǎo)致酶蛋白分子的破壞，從而降低超氧化物歧化酶活力，超氧化物歧化酶活性降低。

2.3 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)POD活性變化

由表3可知，越冬期間庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干形成層POD的活性變化與SOD活性變化的總體趨勢(shì)相似，即先上升后下降。

表3 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干不同組織器官POD活性變化Table 3 POD activities variation in parts of Fragrant Pear trunk

同一個(gè)部位2月份酶活性均比其在1月份和3月份數(shù)據(jù)高，庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干陽(yáng)面、陰面形成層的POD活性都存在顯著性差異；在1月份和2月份枝條和芽中的POD活性差異不顯著，而3月份枝條和芽的POD活性達(dá)顯著差異。低溫下，陽(yáng)面和陰面形成層的POD活性較高，芽的活性最低，陽(yáng)面POD活性約是芽中的兩倍，即老化組織中POD活性較高，幼嫩組織POD活性較低。這是因?yàn)镻OD能使組織中的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度[12]，所以POD可作為判斷組織老化的一種生理指標(biāo)。

2.4 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)CAT活性變化

由表4可知，同一個(gè)部位2份月CAT活性均比其在1月份和3月份活性高，樹(shù)干陽(yáng)面、陰面形成層的CAT活性存在顯著差異；枝條、芽在1月份和3月份存在顯著差異，在2月份差異不顯著；持續(xù)低溫下，陽(yáng)面CAT活性較高。CAT催化H2O2分解為H2O和O2，可清除植物體內(nèi)的氧自由基，防止氧自由基對(duì)植物組織的傷害。

表4 越冬期庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干不同組織器官CAT活性變化Table 4 CAT activities variation in parts of Fragrant Pear trunk

庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干形成層CAT活性變化比較平緩，隨著溫度降低，其活性升高；隨著溫度升高，CAT活性表現(xiàn)為下降，表明CAT活性與組織中H2O2含量和植物的抗逆性密切相關(guān)。

3 討論

在逆境脅迫下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，給細(xì)胞帶來(lái)一定傷害。SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的保護(hù)酶之一，超氧自由基是生物細(xì)胞某些生理生化反應(yīng)常見(jiàn)的中間產(chǎn)物，是活性氧的一種[13]。SOD能通過(guò)歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基，生成H2O2和O2-，H2O2由CAT催化生成H2O和O2，從而減少自由基對(duì)有機(jī)體的毒害。SOD活性高低以及在逆境中其活性變化趨勢(shì)在一定程度上可反映植物抗逆性的強(qiáng)弱。POD具有雙重作用：一方面POD可在衰老或逆境的初期表達(dá)，清除H2O2，表現(xiàn)為保護(hù)效應(yīng)，作為細(xì)胞活性氧保護(hù)酶系統(tǒng)成員之一；另一方面POD可在衰老或逆境的后期表達(dá)，作為衰老組織中不斷累積活性氧的來(lái)源之一[14]。本試驗(yàn)主要體現(xiàn)POD的清除作用。植物在逆境下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。CAT可以催化H2O2分解成H2O和O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成有害的羥自由基。

綜上所述，庫(kù)爾勒香梨植株的保護(hù)酶活性強(qiáng)弱與活性氧的積累量、樹(shù)木受損傷程度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。保護(hù)酶在面對(duì)低溫脅迫時(shí)表現(xiàn)出一定的活躍性來(lái)維持植物正常的生理功能。酶活性的最高值之所以沒(méi)有出現(xiàn)在平均氣溫最低的1月份，而是出現(xiàn)在平均氣溫相對(duì)較低的2月份，是因?yàn)?月份處于冬季末端，冷熱交替明顯，晝夜溫差極大，氣溫不穩(wěn)定，凍融結(jié)合使樹(shù)體受損更為嚴(yán)重，日灼和凍害同時(shí)對(duì)香梨造成的傷害程度為冬季中最大，導(dǎo)致香梨體內(nèi)活性氧較1月份增多，從而引起保護(hù)酶活性增強(qiáng)。這一現(xiàn)象與2月份形成層平均日較差為3個(gè)月份中最大相吻合。進(jìn)入3月份，溫度上升，低溫脅迫減弱，日灼和凍害同時(shí)發(fā)生作用的效果降低，活性氧含量減小，保護(hù)酶活性下降。冬季特別是冬末春初期間的冷熱變化、凍融交替和溫度驟變，使枝干（尤其是樹(shù)干）組織損傷，出現(xiàn)皮層局部死亡，甚至形成層和木質(zhì)部外層也死亡[1]。因此著重在2月份加強(qiáng)樹(shù)木的防護(hù)工作，防止日灼與凍害同時(shí)作用帶給樹(shù)木的傷害。

冬季日灼現(xiàn)象的存在是導(dǎo)致形成層溫度劇烈變化，保護(hù)酶活性變化的重要原因。庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干陽(yáng)面形成層溫度變化比陰面強(qiáng)烈，這與冬季香梨直接受陽(yáng)光暴曬而升溫有關(guān)；越冬期間樹(shù)干陽(yáng)面日灼傷害并不只是細(xì)胞間持續(xù)結(jié)冰導(dǎo)致的，是強(qiáng)光使樹(shù)干陽(yáng)面組織反復(fù)升溫降溫，組織抗寒性降低所致[8]。從保護(hù)酶活性的變化特征分析得知，冬季既有低溫脅迫，還有不為人們所熟知的日灼傷害。

4 結(jié)論

a.保護(hù)酶活性隨著形成層溫度的降低而升高，但同時(shí)受日灼影響。保護(hù)酶活性的變化反映出香梨樹(shù)木受損害的程度。越冬期間，凍害和日灼共同作用造成對(duì)樹(shù)木的傷害，其中2月份受日灼和凍害共同作用最為嚴(yán)重，因此有必要在此期間采取遮蔭等措施防止日灼，從而減輕日灼和凍害同時(shí)對(duì)樹(shù)干的傷害。

b.庫(kù)爾勒香梨樹(shù)干形成層陽(yáng)陰面的SOD活性差異不顯著，而POD、CAT活性達(dá)差異極顯著，因此POD和CAT可作為樹(shù)干日灼傷害的指標(biāo)。由于越冬期間香梨樹(shù)干無(wú)葉片遮蔭，太陽(yáng)輻射直接暴曬樹(shù)干陽(yáng)面，使陽(yáng)面形成層溫度日變化比陰面劇烈，形成層中活性氧增多，促使保護(hù)酶活性變化增強(qiáng)，陽(yáng)面受日灼和凍害同時(shí)作用的可能性遠(yuǎn)大于陰面。

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