大豆GmRAV基因的密碼子偏好性分析

楊春亮，王 良，武 斌，趙 琳，張曉麗，鐘淑琦

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150081；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，哈爾濱 150030；3.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院食品系，哈爾濱 150025；4.哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150070）

RAV（Related to ABI3/VP1）轉(zhuǎn)錄因子首先是在擬南芥中被克隆出來的，含有AP2/ERF與B3兩種DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[1]。大豆屬于光周期敏感的短日照作物，短日照促進其開花。據(jù)報道，在大豆中，雖然短日照能夠強烈誘導(dǎo)大豆葉片GmRAV基因表達，但該基因同時受多個信號調(diào)控，由日長和其他因素共同調(diào)控開花時間，過量表達該基因的煙草植株開花時間明顯延遲，說明GmRAV基因為大豆光周期抑制開花的重要抑制因子[2]。Castillejo等報道，長日照植物擬南芥AtRAV（At1g25560）（也稱為TEM1）基因抑制FT的表達從而抑制開花[3]?？梢?，RAV轉(zhuǎn)錄因子為短日照和長日照植物中光周期開花途徑的關(guān)鍵抑制因子。此外，有報道RAV蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄激活物，定位在細胞核中，能夠被病原、植物激素以及環(huán)境壓力所誘導(dǎo)，誘導(dǎo)防衛(wèi)基因表達[4]。

根據(jù)中心法則，遺傳信息傳遞是由DNA到mRNA，再由mRNA到蛋白質(zhì)。遺傳信息在由mRNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程中是以三聯(lián)體密碼子的形式傳遞。編碼天然蛋白質(zhì)20種氨基酸的密碼子共61種，每種氨基酸至少對應(yīng)1種密碼子，最多的有6種對應(yīng)的密碼子。編碼同1種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。在已經(jīng)研究過的物種中，基因?qū)νx密碼子的使用不是隨機的，而是優(yōu)先使用其中的一些密碼子，即存在密碼子使用偏好[5]。對不同物種的密碼子使用偏好性進行研究，發(fā)現(xiàn)不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏好性；不同功能的基因其密碼子使用偏好性也存在較大差異。分析密碼子的偏好性對于外源基因選擇合適的宿主表達系統(tǒng)，進行基因體外表達具有重要意義。如果外源基因含有大量宿主表達系統(tǒng)的稀有密碼子，尤其是這些稀有密碼子呈連續(xù)分布時，就會造成表達量降低或翻譯提前終止，阻礙基因工程和酶工程的發(fā)展[6-7]。通過密碼子偏好性分析，可選擇合適的表達系統(tǒng)或通過改造密碼子來提高外源基因的表達。本研究利用大豆GmRAV基因的cDNA序列[8]，通過EMBOSS和CodonW在線程序，分析該基因的密碼子偏好性，并與擬南芥等11種植物的RAV基因密碼子偏好性進行比較，以期為該基因在作物遺傳改良中選擇合適的受體植物提供參考。

1 材料與方法

1.1 序列來源

大豆GmRAV轉(zhuǎn)錄因子（GenBank登錄號DQ147914）cDNA全序列為1380 bp，ORF為1056 bp，編碼351個氨基酸，含有B3（53-108氨基酸）和AP2（172-286氨基酸）DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不含有內(nèi)含子，與大豆基因組數(shù)據(jù)庫（www.phytozome.com）中大豆Williams 82 Glyma10g34760序列完全一致，位于Gm10上，另外在大豆基因組數(shù)據(jù)庫找到另外3個拷貝Glyma01g22260、Glyma20g32730和Glyma02g-11060。東方山羊豆、水稻、高粱、鹽芥、擬南芥、玉米RAV基因的完整編碼區(qū)序列來源于GenBank，苜蓿、毛果楊、木薯、甜橙、蓖麻RAV基因的完整編碼區(qū)序列來源于Phytozome，序列登錄號見表1。

表1 RAV基因的完整編碼區(qū)序列來源Table 1 Sources of coding sequences of RAV genes

1.2 分析方法

1.2.1DNAMAN軟件

利用DNAMAN軟件（http://www.ibioo.com/soft/biosoft/2011/11535.html）對大豆GmRAV序列DQ14-7914與另外3個拷貝Glyma20g32730、Glyma01g22-260、Glyma02g11060 RAV氨基酸同源性進行分析。

1.2.2 CodonW軟件

利用CodonW軟件（http://codonw.sourceforge.net/）計算有效密碼子數(shù)（Enc）、計算CDS區(qū)的GC含量、密碼子中第3位堿基的GC含量（GC3s）和相對同義密碼子使用概率RSCU（Relative synonymous codon usage）。

1.2.3 CUSP程序

利用EMBOSS中的CUSP程序（http://150.185.138.86/cgi-bin/emboss/cusp）計算密碼子使用概率。

1.2.4 基于密碼子使用偏好性的聚類分析

利用SPSS 11.5（http://www.ibioo.com/soft/netsoft/2009/7573.html）對不同物種的15條RAV基因基于密碼子使用偏好性進行聚類分析。在此過程中，將每一條基因作為一個對象，將密碼子的RSCU值作為變量。除去值始終為1的編碼Trp和Met的密碼子UGG和AUG，再除去3個不編碼氨基酸的終止密碼子，取余下的59個密碼子的值對基因的密碼子使用偏好性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆RAV 4個同系物同源性比較

根據(jù)大豆基因組網(wǎng)站Phytozome提供的基因相關(guān)信息，使用DNAMAN軟件對其氨基酸同源性比較發(fā)現(xiàn)，該大豆GmRAV序列DQ147914與另外3個拷貝高度同源，都不含有內(nèi)含子。與Glyma20g32730、Glyma01g22260和Glyma02g11060 RAV序列同源性分別為82.04%、65.90%和66%。

2.2 有效密碼子數(shù)（ENc）和GC含量分析

ENc值（Effective number of codons）為基因的密碼子偏好性程度提供了一個客觀的評判標(biāo)準(zhǔn)，代表特定基因中同義密碼子非均衡使用的偏好程度。該值的范圍在20（每個氨基酸只使用一個密碼子的極端情況）到61（各個密碼子均被平均使用）之間，越靠近20偏好性越強。GC3s則表示密碼子的第3位堿基中G+C的含量在第3位堿基總量中所占的比率[9]。本研究應(yīng)用CodonW在線程序計算大豆GmRAV基因的ENc值、GC含量和GC3s值（見表2）分別為52.09、0.580和0.686，并且另外3個大豆RAV拷貝ENc值均大于50，可見ENc值偏大，表明大豆RAV基因各密碼子在編碼氨基酸時出現(xiàn)的頻率比較一致；大豆RAV基因編碼區(qū)GC含量較高，而GC3s值則更高，表明大豆偏好使用以C、G結(jié)尾的密碼子，且在整個編碼區(qū)序列中G+C含量大于A+T。

表2 12個物種RAV的Enc、GC和GC3sTable 2 ENc values and contents of GC and GC3s for RAV in 12 species

2.3 密碼子偏好性分析

相對同義密碼子使用度（RSCU）是指對于某一特定的密碼子在編碼對應(yīng)氨基酸的同義密碼子中的相對概率。RSCU值與氨基酸的使用及密碼子的豐度無關(guān)，它能直觀地反映出密碼子使用的偏好性程度[10]。如果密碼子的使用沒有偏好，則該密碼子的RSCU=1。當(dāng)某一密碼子的RSCU值大于1，則表明該密碼子的使用頻率相對較高，反之亦然。Fraction（比例）表示各個密碼子在編碼該氨基酸的密碼子中所占的比例（各個比例相加總和等于1）。Frequency（頻率）代表該密碼子在編碼基因總密碼子中出現(xiàn)的頻率，即在1000個密碼子中出現(xiàn)的次數(shù)[9]。CUSP和CodonW在線程序計算結(jié)果（見表3）表明，在大豆GmRAV基因的密碼子中，26個密碼子（不包括終止子）的RSCU值大于1，其中，24個密碼子是以C或G堿基結(jié)尾的，且Fraction值也較大，為大豆GmRAV基因的偏好密碼子。大多數(shù)A或U堿基結(jié)尾的密碼子的RSCU值和Fraction值均較低，表明這些密碼子在該基因中的使用頻率較低。

表3 CUSP和CodonW程序分析大豆GmRAV基因的密碼子偏好性Table 3 Condon bias of GmRAV gene analyzed by CUSP and CodonW program

續(xù)表

2.4 與其他植物RAV基因密碼子偏好性的比較

2.4.1 ENc、RSCU及GC含量分析

各物種RAV基因的ENc值、GC和GC3s含量計算結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，大豆4個拷貝RAV基因ENc值相似，為50～52。東方山羊豆、鹽芥、擬南芥、苜蓿、毛果楊、木薯、甜橙和蓖麻在密碼子使用上與大豆相似，ENc均值＞40；而單子葉植物水稻、高粱和玉米的ENc＜40分別為33.17、36.45和35.20。一般來說，ENc值越小表明該基因的表達水平越高，ENc＜30和ENc＞55的基因可被預(yù)測為高表達和低表達基因[10]。由數(shù)據(jù)分析得出，大豆、東方山羊豆、鹽芥、擬南芥、毛果楊、甜橙6個雙子葉植物的RAV基因表達水平一般，苜蓿、木薯和蓖麻表達水平很低，而水稻、高粱和玉米這3個單子葉植物表達水平偏高。大豆等共9種雙子葉植物的GC和GC3s含量明顯低于單子葉植物水稻、高粱和玉米，表明單子葉植物比雙子葉植物對C或G的偏好性更強。

為了解這幾個物種RAV基因密碼子使用的具體情況，表4列出了59個密碼子[去除編碼蛋氨酸（M）的起始密碼子ATG、編碼色氨酸（W）的密碼子TGG以及3個終止密碼子]的相對使用度。由表4可知，大豆GmRAV有26個RSCU值均大于1的密碼

子，大豆Glyma02g11060有25個，大豆Glyma01g-22260有29個，大豆Glyma20g32730有24個，雙子葉植物擬南芥有27個，東方山羊豆有25個，鹽芥有25個，苜蓿有28個，毛果楊有28個，木薯有24，甜橙有24個，蓖麻有28個密碼子的RSCU＞1。單子葉植物水稻有25個，高粱有27個，玉米有28個密碼子的RSCU＞1，其中以G或C堿基結(jié)尾RSCU＞1的密碼子，大豆GmRAV有24個，大豆Glyma02g11060有21個，大豆Glyma01g22260有25個，大豆Glyma20g32730有21個，雙子葉植物擬南芥有17個，鹽芥有15個，甜橙有21個，占大多數(shù)。而東方山羊豆有9個，苜蓿有12個，毛果楊有7個，木薯有12，蓖麻有7個密碼子RSCU＞1，占比例較少。但單子葉植物水稻和高粱的密碼子全部以G或C堿基結(jié)尾且RSCU＞1，玉米有27個密碼子的RSCU＞1。

2.4.2 基于密碼子使用偏好性的系統(tǒng)聚類

親緣關(guān)系較近的物種常表現(xiàn)出相似的密碼子使用頻率[11]。因此，基于密碼子使用頻率的聚類樹狀圖常可用于推測不同物種、不同基因，以及物種和基因之間在密碼子使用方面的相似度或親緣性，也可推測不同物種之間的進化關(guān)系。為進一步了解幾個物種RAV基因密碼子使用差異的大小，根據(jù)表4中各密碼子的相對使用度（RSCU）進行聚類分析，結(jié)果見圖1。9個雙子葉植物12個RAV基因聚為一大類，3個單子葉植物聚為一大類?；诖蠖筊AV基因的相對同義密碼子使用度進行的聚類分析表明大豆GmRAV和Glyma20g32730聚為一類，Glyma01g22260和Glyma02g11060聚為一類，這與氨基酸同源性比較結(jié)果一致：GmRAV和Glyma20g32730同源性最高，而Glyma01g22260和Glyma02g11060 RAV序列同源性高。另外兩種豆科植物東方山羊豆和苜蓿聚為一小支，與豆科植物大豆距離較遠，而大豆卻與甜橙較近，這還反映在這兩者均具有較大GC3s值上。十字花科擬南芥和鹽芥聚為一小支，再與大豆和甜橙聚為一支。

表4 各物種RAV基因相對同義密碼子使用度（RSCU）Table 4 Relatively synonymous codon usage(RSCU)of RAV

續(xù)表

圖1 基于RAV基因的相對同義密碼子使用度的聚類樹狀Fig.1 Cluster analysis dendrogram of RSCU values of RAV genes

3 討論與結(jié)論

核酸是生物遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)是發(fā)揮生物功能的主要分子，密碼子作為聯(lián)系二者的紐帶，其使用情況具有重要的生物學(xué)意義，所以密碼子偏好性現(xiàn)象在許多生物學(xué)領(lǐng)域中受到關(guān)注。不同物種或同一物種的不同基因?qū)γ艽a子的偏好性有所不同。對于密碼子具有偏好性的解釋，目前獲得較為廣泛認(rèn)可的是“突變—選擇平衡”假說（Mutation-selection balance）[12]，由于選擇壓力的存在，生物體傾向于選用最優(yōu)密碼子來編碼氨基酸，但由于突變的發(fā)生，仍會有非最優(yōu)密碼子的存在，不同物種的基因組的密碼子偏好情況主要就是在這兩個力量的動態(tài)平衡中形成的。

通過分析大豆GmRAV基因的密碼子偏好性，發(fā)現(xiàn)該基因主要偏好以C或G結(jié)尾的密碼子，較少使用以A或T結(jié)尾的密碼子。已有研究表明，單子葉植物的密碼子偏好性明顯不同于雙子葉植物[13]。雙子葉植物的GC3s＜50%，而單子葉植物往往具有較高的GC3s值。本研究中單子葉植物水稻、玉米和高粱RAV的GC3s＞90%與該結(jié)論相一致，但雙子葉植物中大豆、擬南芥、鹽芥和甜橙GC3s＞50%，其他5種雙子葉植物RAV的GC3s＜50%。

要實現(xiàn)目的基因在外源表達系統(tǒng)中的成功表達和提高其表達量，可通過增加目的基因劑量，目的基因密碼子優(yōu)化，改善培養(yǎng)條件等方法實現(xiàn)，其中目的基因密碼子優(yōu)化起到關(guān)鍵作用。本研究分析了該基因在大豆和其他植物中密碼子偏好性，以期為該基因在作物遺傳改良中選擇合適的受體植物提供依據(jù)?；赗AV基因的密碼子使用偏性的系統(tǒng)聚類分析表明，大豆等共9種雙子葉植物聚為一類，玉米、高粱和水稻這3種單子葉植物聚為一類，預(yù)示大豆GmRAV基因更適合導(dǎo)入雙子葉植物。

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