同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的實驗研究

楊文奇，毛淑丹，陶貴周

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

急性心肌梗死(AMI)是目前我國發(fā)病率、病死率較高的重大疾病之一，AMI后可致大量無功能心肌形成，梗死區(qū)域最終被瘢痕組織代替并逐步發(fā)生心室重構(gòu)而導(dǎo)致心力衰竭，其最基本的病理改變是具有完整舒縮功能的心肌細(xì)胞壞死或凋亡致瘢痕組織形成。目前，再灌注療法在臨床中廣泛開展，雖可使閉塞血管再通，但無法使已壞死的心肌細(xì)胞再生。干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，其分化方向和分化能力是全能的，可形成包括所有組織的有機(jī)體。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞移植替代壞死心肌己成為目前心肌梗死治療領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點。2010年6月～2012年6月，本研究觀察了同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)移植治療AMI的療效，評價其對梗死區(qū)毛細(xì)血管增生和非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡的影響，以探討B(tài)MMSCs治療AMI的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雌性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(215±25)g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。LDMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司，4，6二脒基-2-苯吲哚(DAPI)(Sigma公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Heraeus公司)，熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制作 將大鼠隨機(jī)分成2組:BMMSCs移植組(15只)、培養(yǎng)液注射組(15只)。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，氣管插管連接小動物呼吸機(jī)。在心電監(jiān)護(hù)下于胸骨正中縱向切口開胸，打開心包，暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動脈前降支，結(jié)扎后即刻可見遠(yuǎn)端心肌缺血左室前壁心肌變蒼白，術(shù)后ECG兩個或兩個以上導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)J點抬高0.2 mV以上，并持續(xù)30 min以上，或新出現(xiàn)的明顯Q波表示AMI模型制作成功。術(shù)后給予抗生素預(yù)防感染。

1.2.2 BMMSCs的分離、培養(yǎng)、標(biāo)記與移植 取健康Wistar大鼠3只，頸椎脫臼處死，75%的乙醇消毒10 min，無菌條件下分離大鼠股骨及脛骨，從股骨干和脛骨干兩端剪斷，用磷酸鹽(PBS)緩沖液反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)200目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩過濾掉大的團(tuán)塊后充分吹打混勻獲取細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液并將其轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液重懸，以1× 106/cm2密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液，以后每2～3天換液1次。細(xì)胞長到80%～90%融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集第4代BMMSCs，將1 mL用L-DMEM培養(yǎng)基配制的DAPI (終濃度為50 mg/L)加入骨髓細(xì)胞懸液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育40 min。PBS反復(fù)洗滌6次，除去未殘留的DAPI，離心收集細(xì)胞，用無血清L-DMEM制成細(xì)胞懸液1 mL，含MSCs 1 ×107個，BMMSCs移植組大鼠于心肌梗死后1周再次開胸將0.2 mL BMMSCs共2×106個注射到心梗部位及周圍［1］，分5點注射，梗死四周及中央，注射后注射部位局部隆起，顏色變白;培養(yǎng)液注射組開胸后于梗死區(qū)中心及周圍注射等量的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.3 左心功能測定 AMI模型制備成功后第4周由同一資深超聲技術(shù)人員采用超聲測量實驗鼠的左室收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)測定毛細(xì)血管密度 完成上述測定后處死大鼠，取出心臟，PBS沖洗，去除左右心房和右心室，垂直于心臟長軸，平行于心臟短軸將心臟組織切成3塊，每塊組織厚約2 mm，標(biāo)記清楚后，分別行10%中性甲醛固定、石蠟包埋，然后切片，在熒光顯微鏡下觀察DAPI藍(lán)色標(biāo)記的陽性供體細(xì)胞。鏡下計算心肌梗死區(qū)毛細(xì)血管密度，每張切片隨機(jī)取10個400倍視野，取平均數(shù)作為測定值。

1.2.5 心梗周圍非缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡TUNEL分析 每個心臟標(biāo)本的3個組織蠟塊各取切片1張，進(jìn)行TUNEL染色分析。TUNEL陽性反應(yīng):細(xì)胞核呈棕黃色顆粒者為染色陽性的凋亡細(xì)胞，其他細(xì)胞核為藍(lán)色。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以s表示，組間兩兩比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMMSCs培養(yǎng)的生長情況 原代培養(yǎng)的細(xì)胞，接種48 h可見部分細(xì)胞已經(jīng)開始變形貼壁，多呈短梭形或橢圓形，并逐漸呈集落樣生長。5～12 d細(xì)胞生長迅速，貼壁細(xì)胞體積增大，仍呈梭形，有粗大突起伸出，有些細(xì)胞則呈三角形或多角形，核居中，有1～2個核仁，出現(xiàn)較大集落樣生長，14 d左右細(xì)胞生長達(dá)80%融合即可傳代，以后每3～4天傳代一次。傳代后細(xì)胞形態(tài)較為均一，呈梭形。DAPI標(biāo)記的BMMSCs胞核呈藍(lán)色，標(biāo)記率達(dá)100%，造模后4周可在BMMSCs移植組大鼠心肌梗死區(qū)發(fā)現(xiàn)大量DAPI標(biāo)記陽性細(xì)胞，胞核呈藍(lán)色。見圖1。

圖1 BMMSCs移植前后的DAPI標(biāo)記情況

2.2 兩組左心功能指標(biāo)比較 見表1。

表1 兩組左心功能指標(biāo)比較(s)

表1 兩組左心功能指標(biāo)比較(s)

注:與培養(yǎng)液注射組比較，*P＜0.05

組別 n LVEF(%) LVEDs(mm)LVEDd(mm) BMMSCs移植組 15 46.80±9.20*3.72±0.50* 5.85±0.40*培養(yǎng)液注射組15 33.50±7.60 6.15±0.40 7.25±0.60

2.3 兩組毛細(xì)血管密度比較 AMI造模后4周，BMMSCs移植組心肌梗死區(qū)毛細(xì)血管密度為(13.24 ±1.27)個/HP，對照組為(3.45±0.72)個/HP，兩組比較P＜0.05。

2.4 心梗周圍非缺血區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡TUNEL分析結(jié)果 BMMSCs移植組大鼠心肌梗死區(qū)域凋亡細(xì)胞明顯少于培養(yǎng)液注射組。

3 討論

目前報道的BMMSCs移植方式主要有經(jīng)靜脈移植、經(jīng)冠脈移植及心內(nèi)膜下移植［2］。有實驗比較了上述3種方式的移植效率，發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈移植組的動物心外器官中滯留的BMMSCs數(shù)量顯著高于其他兩組，移植成功率較低;而冠脈移植組動物心肌梗死區(qū)域中BMMSCs的數(shù)量則顯著高于另外兩組，但經(jīng)冠脈移植組遠(yuǎn)端血流降低最明顯，甚至在無病變區(qū)域也出現(xiàn)心肌灌注減少的現(xiàn)象，這可能是因BMMSCs的直徑與毛細(xì)血管的直徑相似，使BMMSCs流經(jīng)毛細(xì)血管時造成阻塞所致。因此，這也可能會在一定程度上削弱經(jīng)冠脈移植的優(yōu)勢。在本實驗中，我們采取經(jīng)心內(nèi)膜下注射干細(xì)胞的方式進(jìn)行移植，BMMSCs移植組大鼠心功能明顯好于培養(yǎng)液注射組，與有關(guān)報道［3］結(jié)果相似?？紤]可能與心內(nèi)膜下注射時，BMMSCs可在梗死部位形成干細(xì)胞團(tuán)有關(guān)［4］。至于干細(xì)胞移植治療 AMI的最佳移植時機(jī)為AMI發(fā)生后1～2周［5］，這可能是因為:一方面AMI發(fā)生后的最初幾天是心肌的損傷修復(fù)期，此時損傷的心肌會產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，如在此時植入干細(xì)胞，其很可能是參與到炎癥反應(yīng)中，而不是參與心肌的再生和血管的形成;另一方面，若移植時間的間隔過長，心肌瘢痕生成過多，則不利于移植細(xì)胞在梗死區(qū)域的擴(kuò)散。AMI發(fā)生后1周左右，炎癥反應(yīng)明顯減輕，同時壞死心肌的周邊聚集的大量黏附分子、趨化因子和細(xì)胞基質(zhì)因子是干細(xì)胞在心肌損傷區(qū)域聚集分化的必要條件。因此，本實驗采取在心肌梗死后1周進(jìn)行干細(xì)胞移植。

本試驗中，造模4周后行心臟超聲檢查發(fā)現(xiàn)BMMSCs移植組大鼠LVEDs和LVEDd顯著降低，LVEF明顯增加。處死大鼠后，熒光顯微鏡下BMMSCs移植組大鼠心肌梗死區(qū)可見大量DAPI標(biāo)記的陽性細(xì)胞，同時觀察到BMMSCs移植組大鼠梗死區(qū)毛細(xì)血管密度明顯大于培養(yǎng)液注射組，而心肌梗死區(qū)域凋亡細(xì)胞明顯少于培養(yǎng)液注射組。上述觀察結(jié)果證實，細(xì)胞移植后大鼠心臟結(jié)構(gòu)功能的改善與MSCs在心肌梗死局部存活分化為心肌樣細(xì)胞，減少梗死區(qū)心室壁變薄，增加局部收縮功能有關(guān);同時BMMSCs移植組大鼠梗死區(qū)毛細(xì)血管密度的增加同樣證明干細(xì)胞除了分化為心肌細(xì)胞外，尚可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)損傷局部毛細(xì)血管的再生，以增加心肌灌注改善心功能，與Tang等［6］研究結(jié)果一致。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，是與壞死截然不同的死亡方式。近年研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死后心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中非梗死區(qū)心肌收縮單位不斷喪失的主要原因，心肌細(xì)胞的凋亡參與了AMI后心衰的基本病理生理進(jìn)程［7］。在本研究中，就非梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡率而言，BMMSCs移植組明顯低于培養(yǎng)液注射組。而BMMSCs移植組心梗局部毛細(xì)血管密度明顯多于培養(yǎng)液注射組，因此推測，心肌細(xì)胞調(diào)亡的減少與心梗局部毛細(xì)血管密度增加有關(guān)。

在本實驗中，對AMI大鼠經(jīng)心肌注射BMMSCs達(dá)到了預(yù)期的結(jié)果，但是本實驗樣本量較小，觀察時間較短，有必要增加樣本量，延長觀察時間，以進(jìn)一步證實BMMSCs移植在AMI治療中的安全性及有效性。相信隨著更多的基礎(chǔ)理論研究以及臨床研究的深入，干細(xì)胞移植會有更為廣闊的研究范圍和應(yīng)用前景。

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