信陽水牛GHRH基因第二外顯子的SNPs檢測

徐永杰，吳海港，姚 瑾，3，劉 英，梁小娟，馬 云＊

（1.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000；2.信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校，河南 信陽 464000；3.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；）

信陽水牛GHRH基因第二外顯子的SNPs檢測

徐永杰1，吳海港2，姚 瑾1，3，劉 英1，梁小娟1，馬 云＊1

（1.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000；2.信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校，河南 信陽 464000；3.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；）

［目的］檢測信陽水牛群體GHRH基因的SNP多態(tài)性。［方法］以56頭信陽水牛為材料，采集血樣，提取基因組DNA，以GenBank公布的牛GHRH 基因（gi：194719389）序列作為參照序列，設(shè)計PCR引物，采用PCR－SSCP和DNA測序方法對該基因第二外顯子的進行突變檢測。［結(jié)果］經(jīng)SSCP分析發(fā)現(xiàn)，這些個體總共出現(xiàn)六種不同的帶型。測序結(jié)果表明：位于GHRH基因的4461bp、4529bp、4845bp、5053bp和5058bp處分別存在C→T、T→G、G→A、G→A和G→T五個單核苷酸突變。［結(jié)論］表明該基因在信陽水牛群體中單核苷酸多態(tài)較為豐富。

信陽水牛；GHRH 基因；SNPs；PCR－SSCP

引言

信陽水牛主產(chǎn)于河南省信陽市，中心產(chǎn)區(qū)為信陽市的光山、羅山、固始、商城、新縣等縣區(qū)［1］。信陽水牛屬?？啤⑺?，于1983年被列入《河南省地方優(yōu)良畜禽品種志》，2003年被列入《中國畜禽遺傳資源名錄》，體型較大、體質(zhì)結(jié)實、結(jié)構(gòu)勻稱，胸寬深，肋骨開張良好，背平直而寬，尻寬廣而傾斜，而且性情溫馴、喜水、繁殖性能、適應(yīng)性強，耐粗飼［2］，這些優(yōu)點使得信陽水牛在役用方面?zhèn)涫芡茖?。隨著農(nóng)業(yè)機械化水平的不斷提高和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的逐步實現(xiàn)，信陽水牛的經(jīng)濟用途已逐步從單純的役用向乳、肉方向轉(zhuǎn)化。信陽水牛肉質(zhì)較好，在營養(yǎng)價值很高的牛肉中占有很大的比例；其水牛奶濃稠、清香，沒有膻味，營養(yǎng)價值很高，總固形物達20%，是普通牛奶1.7倍，蛋白質(zhì)達4.5%，比普通牛奶高出1.3個百分點，而且水牛奶中鈣、鐵、磷、維生素A、維生素E等含量非常豐富 ，是老幼皆宜營養(yǎng)食品，水牛奶將成為消費新寵［3］。由此可見，信陽水牛有著舉足輕重的價值性和極好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

然而，近年來信陽水牛的存欄數(shù)呈現(xiàn)快速、持續(xù)下降趨勢，加之信陽水牛飼養(yǎng)業(yè)得不到應(yīng)有的重視，科技普及力度不夠，飼養(yǎng)周期長、經(jīng)濟效益低，群眾的養(yǎng)牛積極性不高；而且信陽水牛品種分布不合理，對于一些引進的品種在分布上也不能形成規(guī)模，原始的放牧式養(yǎng)牛方法還普遍存在；品種結(jié)構(gòu)不合理，缺乏龍頭企業(yè)帶動，沒有形成產(chǎn)業(yè)化經(jīng)營，這些禁錮著水牛業(yè)發(fā)展的諸多問題亟待解決［4］。因此，在分子水平上運用現(xiàn)代技術(shù)對信陽水牛進行遺傳育種改良以促進水牛業(yè)的發(fā)展，具有極其重要的意義。生長激素釋放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）是下丘腦合成和分泌的小分子蛋白，是一種直接或間接的免疫功能狀態(tài)下維持生理和病理的下丘腦激素［5］，是促進生長激素分泌的重要的一種正性調(diào)控因子。牛的下丘腦分泌的GHRH有3種形式，分別由44、40、37個氨基酸組成。研究證明這3種GHRH均具有生物活性，其中以44肽的活性最高，Barendse［6］利用基因連鎖分析法把牛的GHRH基因定位于13號染色體上，并證明牛的GHRH基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成［7］，對普通牛GHRH全基因測序得到的基因全長為9356 bp［8］。GHRH 基因具有多種極其重要的作用，其主要功能是誘導(dǎo)并刺激垂體促生長區(qū)的細胞合成和釋放生長激素。通過注射GHRH 刺激牛、羊、豬、猴和犬的研究表明，GHRH 的促GH釋放活性較高［9－11］。此外，GHRH 在其他方面也有不可或缺的作用，例如：GHRH 有助于 HIV患者骨骼的增強［12］；GHRH 還具有免疫調(diào)節(jié)的功能［13］。

近年來有關(guān)黃牛、牦牛等的GHRH 基因的多態(tài)性及與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析等已有相關(guān)的研究報道［14－19］，但在信陽水牛上，至今尚未見有關(guān)GHRH基因影響其生產(chǎn)性能的報道，本研究運用PCR－SSCP結(jié)合測序的方法，對信陽水牛的GHRH基因的第二外顯子進行突變檢測，以期為進一步進行生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)與重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的DNA分子遺傳標記，對信陽水牛的遺傳育種改良以促進水牛業(yè)的發(fā)展具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣本 采集共計56頭均無血緣關(guān)系的信陽水牛（♀）的靜脈血液，加入抗凝劑ACD搖勻（血液：ACD＝6∶1），用加冰塊的泡沫箱帶回試驗室，－20℃低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Golden DNA 聚合酶（Polymerase）、2×Reaction Mix、dNTP、Marker DL2000、瓊脂糖、Tris飽和酚、蛋白酶K等購自鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；引物合成和測序由南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.3 主要實驗儀器 PCR儀（型號：Gene Amp PCR System9600）；電泳儀（型號：DYY－6C型）；水平電泳槽（型號：DYCP－31B）；垂直板電泳槽（型號：DYCZ－20A）；凝膠成像系統(tǒng)（型 號：UVP GDS－8000）。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取與檢測 采用傳統(tǒng)的氯仿提取法［20－21］提取信陽牛血樣基因組DNA，提取后 的DNA用TE緩沖液溶解后，采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測定濃度后，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物的設(shè)計與合成 參照NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫中公布的GHRH 基因序列（gi：194719389）以及外顯子序列，利用Primer 5.0軟件自行設(shè)計GHRH基因的第二外顯子序列的PCR擴增引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行引物合成，序列信息見表1。

表1 引物序列信息

在PCR反應(yīng)為15μL體系，具體如下：2×Reaction Mix 7.5μL、Golden Taq DNA聚合酶（5U／μL）0.1μL、引物GHRH2S（上游引物，10μmol／L）0.1μL、引物GHRH2A（下游引物，10μmol／L）0.1μL、無菌水6.2μL、DNA 模板（1μg／μL）1.0 μL。按照如下條件進行擴增：95℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，63.4℃退火40s，72℃延伸30s，循環(huán)32次。

1.2.3 PCR結(jié)果的瓊脂糖電泳檢測 取2.0μL PCR產(chǎn)物，點樣于1.5%瓊脂糖（0.21g瓊脂糖，16 mL 1×TBE緩沖液）凝膠膠孔中，120V電壓，電泳約35min，EB（溴化乙啶）染色，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的SSCP檢測 洗凈烘干玻璃板，兩板側(cè)邊用夾子夾緊，底部用1%的瓊脂糖封住，放置5min；將現(xiàn)配的、混勻的8%的PAGE凝膠迅速倒入玻璃板內(nèi)，插入梳子；室溫下凝膠約30min后，小心拔出梳子，立即用蒸餾水立刻沖洗點樣孔，取出橡膠條，將注有膠的玻璃板放到垂直電泳槽內(nèi)，加入電泳緩沖液；取4μL PCR產(chǎn)物，加6μL變性緩沖液，瞬時離心后PCR儀中98℃變性10min；取出變性后的PCR產(chǎn)物立即埋入冰中，冰浴5min后迅速上樣，并作好點樣順序記錄，冰浴條件下250 V電壓電泳20min，而后160V電壓電泳20h；取凝膠：電泳結(jié)束后切斷電源，卸下膠板，將凝膠從玻璃板中小心取出，用蒸餾水漂洗2次（每次20s）；銀染凝膠：將染色液（0.1%AgNO3）倒入塑料盤中浸沒凝膠，放在搖床上避光輕輕搖30min，凝膠用蒸餾水漂洗2次；凝膠顯色：加入顯色液至浸沒凝膠，邊搖邊觀察，直到凝膠上顯現(xiàn)出清晰的電泳帶；終止顯色：倒出顯色液，用蒸餾水漂洗兩次；凝膠照相：將凝膠用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，并作好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 GHRH基因第二外顯子PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

圖1 GHRH基因第二外顯子PCR擴增結(jié)果

圖1是信陽水牛GHRH基因第2外顯子PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜。由圖1可以看出，PCR產(chǎn)物帶型明亮清晰，又根據(jù)Marker所示，產(chǎn)物與預(yù)期的目的條帶一致，可以作為SSCP分析的樣本。

2.2 GHRH 基因第二外顯子PCR產(chǎn)物的SSCP檢測結(jié)果

圖2 信陽水牛GHRH＊exon2的PCR－SSCP分型比較

SSCP分型結(jié)果見圖2，信陽水牛GHGH＊exon2基因PCR擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后出現(xiàn)六種帶型，分別命名為AD、AB、CA、AC、AA、AC和BB，對SSCP檢測結(jié)果進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)AA型個體有3個，BB型個體有1個，AB型個體有14個，AC型個體有36個，CA型個體有1個，AD型個體有1個，說明信陽水牛GHRH 基因存在較豐富的多態(tài)性。

2.3 GHRH基因第二外顯子的SNPs測序結(jié)果

圖3 GHRH基因＊exon2的SNPs檢測結(jié)果（a～e）分別表示牛GHRH＊exon2的4461bp、4529bp、4845bp、5053bp、5058bp處的SNP）

對SSCP結(jié)果中呈現(xiàn)不同帶型的PCR產(chǎn)物進行直接測序，以進一步驗證其多態(tài)位點的存在。結(jié)果表明：GHRH 基因第2外顯子上共出現(xiàn)5個SNPs，4461bp處存在C→T突變，4529bp處T→G突變，4845bp處G→A突變，5053處G→A突變，5058bp處G→T突變。這些突變導(dǎo)致了SSCP檢測中多種帶型的出現(xiàn)。測序結(jié)果見圖3。

3 討論

生長激素釋放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）是由下丘腦合成并分泌的，是GH軸的主要調(diào)控因子，能促進腦垂體生長激素的合成與釋放。除此之外，GHRH對刺激GH合成和促生長細胞增殖具有重要作用。目前GHRH基因與生長性狀相關(guān)的遺傳多態(tài)只有少量報道，劉凱等［22］利用PCR－SSCP和 PCR－RFLP技術(shù)研究波爾山羊和徐淮白山羊2個群體GHRH基因的單核苷酸多態(tài)性，并對山羊GHRH 基因座的不同基因型與2個山羊群體體尺性狀做相關(guān)分析，結(jié)果表明GHRH基因位點對波爾山羊的管圍指數(shù)和體軀指數(shù)有顯著影響（P＜0.05），對其他指標影響不顯著（P＞0.05），該研究對山羊生長性狀的標記輔助選擇具有一定的參考價值。Meng等［23］對羔羊?qū)嵤┘∽愇槐磉_GHRH質(zhì)粒結(jié)合電轉(zhuǎn)染，促進了羔羊的生長。牛GHRH基因同樣是與生長性狀相關(guān)的功能基因［24］。總之，GHRH 基因是一個動物生長發(fā)育相關(guān)的重要功能候選基因。

PCR－SSCP分析結(jié)果受多種因素的影響，如電泳溫度、電壓、離子強度（電泳緩沖液濃度）、凝膠濃度和交聯(lián)劑濃度及特異性好的PCR產(chǎn)物等［25－27］。不同的實驗條件甚至可能導(dǎo)致完全不同的結(jié)果，因此在實驗時要優(yōu)化好PCR－SSCP分析的條件。本研究中發(fā)現(xiàn)溫度對電泳條帶清晰度的影響很大，用冰浴電泳要比室溫下電泳效果好；合適的丙烯酰胺濃度在SSCP的分析中也是關(guān)鍵的，濃度太高，會分辨不出條帶，或者帶型很雜，難以對基因型進行判斷；此外，染色和顯色對于SSCP的結(jié)果也有很大影響，在本研究中我們改進了染色和顯色的步驟，使用0.1%AgNO3染色、2%NaOH顯色，效果較好而且步驟簡單。在具體的實驗操作中要根據(jù)不同的實驗?zāi)康膬?yōu)化PCR－SSCP條件從而得到最佳的結(jié)果。

本研究對信陽水牛GHRH基因第二外顯子進行SSCP檢測，出現(xiàn)了不同的帶型，并結(jié)合測序的方法對GHRH 基因片段進行遺傳變異檢測研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了8個SNPs，表明在信陽水牛群體中GHRH基因存在較為豐富的突變，這些突變可能對信陽水牛的生長發(fā)育有著重要影響，進一步分析其與信陽水牛重要經(jīng)濟性狀的相關(guān)性，可能會篩選到與經(jīng)濟狀相關(guān)的分子遺傳標記，這些對信陽水牛的遺傳育種改良以促進水牛業(yè)的發(fā)展都將具有重要的意義。

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SNPs Detection of GHRHGene on the 2th Exon Region in Xinyang Buffalo

XU Yong－jie1，WU Hai－gang2，YAO Jin1，3，LIU Ying1，LIANG Xiao－juan1，MA Yun＊1

（1.College of Life Sciences，Xinyang Normal University，Xinyang，Henan，464000；2.Xinyang Agricultural College，Xinyang，Henan，464000；3.College of Life Sciences，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu，212023；）

【Objective】This study was aimed to detect the SNP of GHRHgene.【Method】The Genomic DNA was taken from 56Xinyang buffalo blood samples.PCR primers were designed according the sequence of GHRH gene（gi：194719389）.PCR－SSCP and DNA sequencing methods were used to detect the mutations.【Results】The results showed that there were six different band types in different individuals by PCR－SSCP analysis.8SNPs were detected，located at 4461bp （C→T mutation），4529bp （T→G mutation），4845bp（G→A mutation），5053bp（G→A mutation），5058bp（G→T mutation），respectively.【Conclusion】The results indicated that GHRHgene was polymorphic in Xinyang buffalo population.

Xinyang buffalo；GHRH gene；SNPs；PCR－SSCP

S823.2

A

1001－9111（2012）04－0001－05

2012－04－04

2012－04－16

河南省科技攻關(guān)項目（092300410010）；河南省高等學(xué)校骨干教師資助計劃

徐永杰（1980－），男，河南商城縣人，講師，主要從事動物分子遺傳研究。

＊通訊作者：馬 云（1974－），男，寧夏平羅縣人，副教授，主要從事動物分子遺傳育種研究。