高效毛細(xì)管電泳法同時(shí)檢測(cè)飼料中七種防腐劑

曹小妹 薛江超 高文惠 閆路娜

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

飼料中加入防霉劑及防腐劑可以起到防腐、抑菌、殺菌、延長(zhǎng)保質(zhì)期等作用。防腐劑的種類繁多，常見(jiàn)報(bào)道的有山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類。飼料中加入防腐劑有其必要性但是用量要合乎相關(guān)規(guī)定，因此探索飼料中防腐劑高效快速的檢測(cè)方法尤為重要。目前毛細(xì)管電泳法檢測(cè)防腐劑的報(bào)道多為堿性條件下的分離測(cè)定[1-7]，堿性不利于柱子的使用壽命；而采用酸性緩沖溶液在低pH值下，吸附和電滲流值都很小，毛細(xì)管涂層的壽命較長(zhǎng)[8]。Mahuzier等[9]利用膠束電動(dòng)色譜分別在pH值9.5和pH值2.1條件下測(cè)定MP、EP、BP、PP和對(duì)羥基苯甲酸，但是pH值9.5時(shí)對(duì)羥基苯甲酸的峰形很差。He等[10]曾報(bào)道了在pH值2.28分離測(cè)定了MP、EP、BP、PP，取得滿意的分離效果。本試驗(yàn)旨在探索酸性條件下多種防腐劑的分離檢測(cè)方法。分別從緩沖液的種類，緩沖液的濃度以及pH值幾個(gè)方面選擇合適的分離條件，最終獲得七種物質(zhì)的高效分離。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純)、十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純)。

標(biāo)準(zhǔn)品：山梨酸（SA）、苯甲酸（BA）、脫氫乙酸(DHA)、對(duì)羥基苯甲酸甲酯(MP)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(EP)、對(duì)羥基苯甲酸丙酯(PP)、對(duì)羥基苯甲酸丁酯(BP)純度均大于99%(Sigma)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取SA、BA、DHA、MP、EP、PP、BP標(biāo)品 50 mg用甲醇溶解，分別定容至100 ml容量瓶。

1.2 儀器

CAPEL-105高效毛細(xì)管電泳儀，配有紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器(俄羅斯劉梅克斯公司生產(chǎn))；LD5-2A低速離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司生產(chǎn))；KH5200型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司生產(chǎn))；756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)）；FA2204N分析天平(上海菁海儀器有限公司生產(chǎn))。

1.3 樣品處理

飼料樣品用甲醇：水=1：1（體積比）的混合液提取,超聲25 min,然后在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min,取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜后直接上機(jī)測(cè)定。

1.4 緩沖溶液的配制

用超純水分別配制40 mmol/l KH2PO4和100 mmol/l SDS溶液，將兩種溶液以體積比為1：1進(jìn)行混合作為緩沖液，并調(diào)節(jié)pH值至4.00，過(guò)0.45 μm微孔濾膜備用。

1.5 色譜條件

彈性石英毛細(xì)管柱（50 cm×75 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，分析電壓為-18 kV，進(jìn)樣時(shí)間為5 s，檢測(cè)溫度為25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

七種防腐劑的紫外光譜掃描圖如圖1所示。SA、BA、DHA 的最大吸收波長(zhǎng)分別為 256、226、226 nm，MP、EP、PP、BP的最大吸收波長(zhǎng)均為258 nm。若選定256 nm，SA、MP、EP、PP、BP 可以獲得較高的靈敏度，但是BA和DHA在此處幾乎沒(méi)有吸收，故256 nm不可取。綜合考慮七種物質(zhì)的吸收情況并且獲得相對(duì)較好的靈敏度，本試驗(yàn)選擇245 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 七種防腐劑的紫外吸收曲線

2.2 緩沖液的選擇

本試驗(yàn)探究酸性條件下七種物質(zhì)的分離情況，因此選擇酸性的KH2PO4溶液。對(duì)羥基苯甲酸酯類是中性物質(zhì)，需添加表面活性劑SDS而形成膠束電泳。

對(duì)于緩沖液濃度的選擇，分別配制了40 mmol/l KH2PO4(A)和100 mmol/l SDS(B)以不同體積比的混合液，如 1：1，1：2，1：3，1：4，2：1，3：1，4：1。試驗(yàn)結(jié)果是：配制的A和B兩種溶液體積比為1：4，1：3時(shí)，PP和BP不能完全分離(見(jiàn)圖2中a和b)，1：2時(shí)PP和BP，MP和BA不能完全分離（見(jiàn)圖2中c）；體積比為 2：1，3：1，4：1 時(shí)，即當(dāng)緩沖液中 KH2PO4的濃度接近或大于SDS的濃度時(shí)，溶液有析出現(xiàn)象，不能正常使用。而當(dāng)體積比為1：1，七種防腐劑可實(shí)現(xiàn)完全分離，故確定體積比為1：1。

圖2 在KH2PO4和SDS不同體積比下七種防腐劑的色譜

pH值能影響膠束電動(dòng)色譜中帶電組分遷移的速度，但是不改變SDS的荷電狀況，因此不影響它的泳流速度。因電滲流受pH值的限制，故它的凈速度也與pH值有關(guān)[8]。在酸性條件下，分別考察了pH值為2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 六個(gè)條件下七種物質(zhì)的分離情況。通過(guò)色譜圖分析得到：不同的pH值影響到物質(zhì)的出峰順序，在pH=2.50～3.50條件下，MP在BA之前出峰，而在pH=4.00～5.00時(shí)BA在MP之前出峰；且從pH=2.50到pH=4.50，隨著pH值的增加七種物質(zhì)的出峰時(shí)間延長(zhǎng)，但是pH=2.50～3.50時(shí)BP和PP分離不好，且pH=3.50時(shí)MP和BA也分離不好。綜合考慮分離效果和出峰時(shí)間，確定4.00為試驗(yàn)最佳pH值。

綜上所述：在最佳條件下七種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液分離色譜圖如圖3所示。由圖3中看出，七種防腐劑在19 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離。

圖3 七種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品的分離色譜

2.3 線性范圍與檢測(cè)限

配制一系列濃度（0.5～500 μg/ml）的七種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的最佳色譜條件下進(jìn)行線性關(guān)系和檢測(cè)限的測(cè)定。由表1結(jié)果可以看出，SA、BA的線性范圍分別為 1～500，3～500 μg/ml，DHA、MP、PP、BP 和 PP 的線性范圍均為 5～500 μg/ml。SA、BA、DHA和四種對(duì)羥基苯甲酸酯類的檢測(cè)限分別為0.5、1.5、3、2.5 μg/ml。

表1 七種防腐劑的線性關(guān)系及檢測(cè)限

2.4 樣品的檢測(cè)

飼料樣品按照1.3節(jié)處理。典型飼料樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。由圖4、圖5看出,牛飼料樣品中檢測(cè)到BA，預(yù)混料中檢測(cè)到EP和BA。

圖4 牛飼料的樣品

圖5 預(yù)混料的樣品

2.5 回收率試驗(yàn)

對(duì)飼料樣品進(jìn)行低水平和高水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。七種防腐劑的回收率為80.8%～107.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.0%。

表2 七種防腐劑的加標(biāo)回收率和精密度(n=5)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了一種在酸性條件下同時(shí)檢測(cè)飼料中酸類和酯類等七種防腐劑的快速、高效毛細(xì)管電泳方法，在19 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了七種防腐劑的分離。七種防腐劑的檢測(cè)限在 0.5～3 μg/ml，回收率為 80.8%～107.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.0%。本方法可以作為飼料企業(yè)自檢和其他機(jī)構(gòu)檢測(cè)的參考方法。

[1]胡美珍，王文錚，燕琴.毛細(xì)管電泳法分離測(cè)定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，33(3)：63-66.

[2]高勇，何友昭，謝海洋，等.頂空液相微萃取-膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜分析藥品中酯類防腐劑[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2010，38(11)：1625-1628.

[3]王萍，丁曉靜.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜快速測(cè)定化妝品中的防腐劑[J].色譜，2005，23(3)：315.

[4]谷學(xué)新，田莉，葉能勝，等.毛細(xì)管電泳法檢測(cè)化妝品中對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑[J].分析化學(xué)，2009，37：21.

[5]Boyce M C.Simultaneous determination of antioxidants,preservatives and sweeteners permitted as additives in food by mixed micellar electrokinetic chromatography[J],Journal of Chromatography A,1999(847):369-375.

[6]Blanco E,Maria Del Carmen C,Maria Del Carmen M,et al.Combination of off-line solid-phase extraction and on-column sample stacking for sensitive determination of parabens and p-hydroxybenzoic acid in waters by non-aqueous capillary electrophoresis[J].Analytica Chimica Acta,2009,647:104-111.

[7]Huang S Y,Lai Y C,Chui C W,et al.Comparing micellar electrokinetic chromatoraphy and microemulsion electrokinetic chromatography for the analysis of preservatives in pharmaceutical and cosmetic products[J].Journal of Chromatography A,2003(993):153-164.

[8]林炳承.毛細(xì)管電泳導(dǎo)論[M].北京：科學(xué)出版社，1996：85.

[9]Mahuzier P E,Altria K D,Clark B J.Selective and quantitative analysis of 4-hydroxybenzoate reservatives by microemulsion electrokinetic chromatography[J].Journal of Chromatography A,2001(924):465-470.

[10]He S L,Zhao Y F,Zhu Z W.Comparative study for the analysis of parabens by micellar electrokinetic capillary chromatography with and without large-volume sample stacking technique[J].Talanta,2006(69):166-171.