高效凈化污水光合細菌的分離鑒定

馬姝萍 趙述淼 郭俊平 葛向陽

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070）

光合細菌（Photosynthetic bacteria）簡稱 PSB，廣泛存在于自然界的江河、湖泊、海洋、土壤及活性污泥內(nèi)。它們具有原始的光能合成體系，以光為能源，能在好氧黑暗或厭氧光照條件下進行光合作用，而作為供氫體和碳源的是自然界的有機物、硫化物、氨等，這就使得光合細菌在自然界的氮、碳、硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，具有重要的科學(xué)研究價值。也正是由于PSB的這一生理特性，使得其作為水質(zhì)凈化劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖和污水凈化中顯示出強有力的優(yōu)勢。

本研究主要是通過比較不同來源的光合細菌對實際污染水樣的處理情況，選擇一株具有高效凈水效果的菌株，并探討將其用于生產(chǎn)實踐的可能性。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院發(fā)酵工程室提供沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）等3株光合細菌；其它來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)青年湖及食堂污水池。

1.2 培養(yǎng)基及其他試劑

富集培養(yǎng)基：NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NH4Cl 1 g、NaHCO32 g、KH2PO41.75 g、CH3COONa 3 g、酵母粉 1 g，蒸餾水 1000 ml，pH 值 7.0。

分離培養(yǎng)基：添加1%瓊脂粉的富集培養(yǎng)基。

T載體試劑盒與引物：均由上海英俊基因技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

波長掃描使用美國Beckman紫外可見分光光度計DU800。

1.3 菌株的分離與篩選

1.3.1 富集

取1 ml污水樣本裝入已有500 ml富集培養(yǎng)基的鹽水瓶中，30℃，60 W白熾燈光照培養(yǎng)7～8 d。待培養(yǎng)液變成紅色，吸出紅色液體5 ml，連續(xù)富集3次。

1.3.2 分離純化

采用稀釋瓊脂管與雙層平板相結(jié)合的方法。取富集液稀釋至105倍,吸取0.1 ml加入冷卻至45～55℃分離培養(yǎng)基的螺口試管中，30℃，光照培養(yǎng)4～5 d后，挑取紅色單菌落,平板劃線后鋪上一層已冷卻至40℃的0.8%瓊脂液，30℃光照培養(yǎng)3～4 d，再挑取紅色單菌落如此反復(fù)2～3次，直至在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)一致，純化結(jié)束。

1.4 分離菌株對污水處理

取華中農(nóng)業(yè)大學(xué)青年湖中水樣分裝于500 ml鹽水瓶中,立即滅菌(121℃，30 min),待冷卻至室溫后分別接入0.04%的光合細菌培養(yǎng)液(菌數(shù)為1.7×109個/ml),無菌操作取200 ml待測水質(zhì)指標,30℃,光照培養(yǎng)4 d后取200 ml待測水質(zhì)指標。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 16S rDNA序列分析

引物:上游引物 27F：5-agagtttgatcctggctcag-3;下游引物 1492R：5-ggttaccttgttacgactt-3；擴增體系(50 μl):27F 1 μl，1492R 1 μl，ddH2O 23 μl，MasterMix 25 μl，單菌落。擴增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；50 ℃，45 s；72 ℃，2 min；72 ℃，10 min；32個循環(huán)；4 ℃，10 min。

1.5.2 T-載體克隆

純化的PCR產(chǎn)物與PCR 2.1載體連接并轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α受體菌，在氨芐青霉素（Amp）篩選平板上挑選克隆子，接于含有Amp的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。取1 ml培養(yǎng)物用于質(zhì)粒抽提，使用EcoR I酶酶切，點樣于瓊脂糖凝膠，電泳，選擇5500 bp條帶相對應(yīng)的菌進行測序。

1.5.3 生理生化鑒定

該菌株的生理生化特性鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行，主要有運動性試驗、H2S生成試驗、硝酸鹽還原試驗、過氧化氫酶試驗、淀粉水解試驗和唯一碳源試驗。

1.6 藥敏試驗

取打孔濾紙片，浸泡在不同抗生素中，稀釋菌液1000倍,涂布,待菌液干后,將濾紙片貼在其表面,30℃光照培養(yǎng)5 d，測量抑菌圈直徑。以浸泡滅菌蒸餾水的濾紙為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

通過對不同樣品反復(fù)分離純化，得到7株菌，命名為 P1、P2、P3(實驗室提供沼澤紅假單胞菌)、P4、P5、P6、P7，這幾株菌菌落形態(tài)較一致，在瓊脂管里菌落呈深紅色，圓餅狀，直徑為0.4～1.0 mm。邊緣光滑，稍突起，不透明。顯微鏡觀察，P1菌和P3菌呈短桿狀，P2、P4、P5、P6、P7 菌呈球狀。

2.2 分離菌株對污水處理效果

2.2.1 分離菌株對水體CODMn的去除效果

水體CODMn值是指利用化學(xué)氧化劑高錳酸鉀將水中可氧化物質(zhì)（如有機物、亞硝酸鹽、亞鐵鹽、硫化物等）氧化分解，然后根據(jù)殘留的氧化劑的量計算出氧的消耗量，是表示水質(zhì)污染度的重要指標。當(dāng)水體的CODMn值過高，水體變成還原性，導(dǎo)致水生生物死亡，它們的尸體被厭氧菌不完全氧化，產(chǎn)生有機毒物，如尸體中的硫元素會轉(zhuǎn)變成硫化氫，氮元素會變成甲胺等，這些物質(zhì)不但奇臭無比而且有很強生物毒性，影響水體質(zhì)量。

取滅菌污水樣品，分別投入分離得到的7株菌并檢測它們對水體CODMn的去除效果。實驗結(jié)果見圖1。

圖1 7株光合細菌對青年湖水CODMn的去除效果

從圖1可知，這7株菌對水體有機質(zhì)均有一定的吸收能力，其中P1、P3、P4能力較強，CODMn的去除率分別達到了66.87%、52.31%、46.93%，而其它菌對CODMn的去除效果不明顯，均未超過30%。由于不同菌株的生理活性有所差異，它們的培養(yǎng)液中有機質(zhì)含量可能會不同，導(dǎo)致各個樣品的CODMn起始值也有差異?？偟膩碚f，P1菌對水體有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化能力很強，能有效降低水體有機質(zhì)含量，達到凈化水體的作用。

2.2.2 分離菌株對水體氨態(tài)氮的去除效果

水體氨態(tài)氮含量過高會引起藻類及其他浮游生物迅速繁殖，水體溶解氧下降，水質(zhì)惡化，魚類及其他生物大量死亡，導(dǎo)致水體的富營養(yǎng)化。人畜長期飲用這樣的水，會中毒致病。

取滅菌污水樣品，分別投入分離得到的7株菌并檢測它們對水體氨態(tài)氮的去除效果。實驗結(jié)果見圖2。

圖2 7株光合細菌對青年湖水氨態(tài)氮的去除效果

由圖 2 分析可知，P1、P3、P4、P5、P7 對水體氨態(tài)氮有一定的降低作用，其中P1菌的效果相對于其他菌的效果最好，達到3.33%；P3菌對氨態(tài)氮的去除率僅為1.52%，低于P1菌。P2、P6菌不但對氨態(tài)氮沒有降低作用，反而提高了水體的氨含量，可能是這兩株菌對氨態(tài)氮的吸收轉(zhuǎn)化活性沒有其他菌強?？傊?，P1菌相對于其他菌對水體氨態(tài)氮的吸收轉(zhuǎn)化能力較好，對降低水體氨態(tài)氮有一定效果。

2.2.3 分離菌株對污水磷的去除效果

水體的磷含量過高也是水體富營養(yǎng)化的原因之一。水體中過量的磷一方面來自工業(yè)廢水和生活污水，另一方面，水體中的底泥在還原狀態(tài)下也會釋放磷酸鹽。如果不對水體過量的磷進行處理，會造成水體的惡性循環(huán)。

取滅菌污水樣品，分別投入分離得到的7株菌并檢測它們對水體磷的去除效果。實驗結(jié)果見圖3。

這7株菌對水體磷均有一定的去除效果，其中P1菌和P4菌的除磷效果好于其他5株菌，去除率分別為8.03%和9.37%，P3菌的去除效果最差，去除率僅為0.48%。由此可知，P1菌和P4菌對水體磷的降低有一定作用。

圖3 7株光合細菌對青年湖水磷的去除效果

通過對以上7株菌處理污水能力的比較，發(fā)現(xiàn)P1菌對污水體的CODMn、氨態(tài)氮含量、磷含量都有明顯的降低作用,能夠分別達到66.87%、3.33%和8.03%。表明P1菌凈化水質(zhì)的綜合能力較強，確定其為本研究的目的菌株。

2.3 P1菌菌種鑒定

2.3.1 測序結(jié)果及序列分析

將相對應(yīng)的陽性轉(zhuǎn)化子送至上海英俊基因技術(shù)服務(wù)有限公司測序,序列結(jié)果顯示目的基因為1568 bp,接近16S rDNA基因片段的長度。用NCBI-Blast軟件將測序結(jié)果在GenBank等數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索。在GeneBank上登錄結(jié)果顯示P1菌的16S rDNA序列與Rhodopseudomonas faecalis(糞紅假單胞菌)16S rDNA序列的同源性較高，相似性達到99%。

2.3.2 P1菌生理生化特征

2.3.2.1 形態(tài)特征

本菌株為革蘭氏染色陰性，短桿狀，二分分裂繁殖，運動活躍，菌落呈深紅色，圓餅狀，直徑1.0 mm左右，表面微凸，邊緣整齊，光滑濕潤。

2.3.2.2 生理生化實驗

P1菌的生理生化特征實驗結(jié)果見表1。

表1 P1菌生理生化特征實驗結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及16S rDNA的測序結(jié)果，P1菌即為糞紅假單胞菌（R.faecalis）。

2.4 P1菌活細胞吸收光譜

P1菌株活細胞經(jīng)過波長300～800 nm范圍內(nèi)連續(xù)掃描結(jié)果見圖4。在300～650 nm波長范圍內(nèi)有3個特征吸收峰，分別位于370、480、590 nm處。在370 nm和590 nm處有吸收峰，說明活細胞中存在細菌葉綠素a；在480 nm處有吸收峰說明活細胞中含有類胡羅卜素。光合細菌的吸收光譜主要受葉綠素a和類胡蘿卜素成分的影響。

圖4 光合細菌P1吸收光譜

2.5 抗生素對P1菌的影響

光合細菌菌劑多用于養(yǎng)殖水體，而養(yǎng)殖水體中多含有添加抗生素的餌料，故需要考慮光合細菌對抗生素的敏感性。藥敏實驗結(jié)果見表2。

表2 P1菌對各種常用抗生素的敏感性（x±s，n=3）

從表2分析可以看出，P1菌對以上7種常用抗生素均有一定的敏感性,其中對慶大霉素最敏感,抑菌圈直徑超過1.5 cm,其次是氨芐青霉素和鏈霉素,抑菌圈接近1.0 cm，最不敏感的是卡那霉素，不足0.7 cm。該結(jié)果表明在使用P1菌凈化養(yǎng)殖水體時，需要注意餌料中抗生素對其的影響，及時補充P1菌的投放量，確保其在水體微生物中的優(yōu)勢地位以保證凈化水質(zhì)效果。

3 討論

近20年來，對光合細菌的應(yīng)用研究獲得了很大的進展，但是也出現(xiàn)過不少問題，如菌種純化問題。在本研究中采用稀釋瓊脂管法和雙層平板法結(jié)合分離純化光合細菌可以彌補因為長期厭氧光照培養(yǎng)導(dǎo)致固體培養(yǎng)基滲水干枯的缺點，強化分離純化效果。而采用T載體克隆的方法進行光合細菌16S rDNA測序,可以避免雜菌DNA對目的菌的影響,大大提高DNA測序效率。

參照水質(zhì)監(jiān)測國家標準對菌株進行凈水能力的檢測，結(jié)果顯示分離菌株對水體的有機質(zhì)、氨態(tài)氮和磷有一定的去除作用，但各個菌去除效果不同，可能是因為不同菌株在不同污水中生理活性不同，導(dǎo)致其對水質(zhì)凈化效果有一定差異，尚待進一步研究。

本研究從篩選分離出的7株光合細菌為出發(fā)，挑選出一株光合細菌P1，經(jīng)鑒定，該菌為糞紅假單胞菌（R.faecalis），其對污水有機質(zhì)的去除率達到了66.87%，說明該菌能高效吸收污水中的有機質(zhì)，對氨態(tài)氮和磷的去除也有一定的效果，但去除率均不高，分別為3.33%和8.03%。此外，本研究中的沼澤紅假單胞菌(R.palustris)對上述指標的去除率分別為52.31%、1.52%和0.48%。由此可見，糞紅假單胞菌各項指標均高于沼澤紅假單胞菌。同時對該菌進行了藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)該菌對常用抗生素均有一定的敏感性，使用該菌凈化養(yǎng)殖水體時需要及時投放光合細菌以保證凈化效果。

4 結(jié)語

隨著工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，水體的污染越來越嚴重。采用微生物法治理污水，使用方便，投資少、收效快。在水中自然生長、繁殖、再建微生物生態(tài)平衡的同時提高水體的自凈能力。雖然糞紅假單胞菌尚未列入飼用微生物制劑行列，關(guān)于其凈化水質(zhì)能力也鮮有報道，但該菌對水體有機質(zhì)較強的吸收能力必將引起極大的關(guān)注，今后在微生物治理污水中有著廣泛的應(yīng)用前景。

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