Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)與胰島素抵抗相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子水平在妊娠期糖耐量受損孕婦中的相關(guān)性研究

錢源 宗迪 馬潤玫 褚嘉佑 孫浩＊

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，云南 昆明 650032；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118）

妊娠期糖耐量受損（gestational impaired glucose tolerance，GIGT）為早期的血糖穩(wěn)態(tài)改變，是介于正常妊娠狀態(tài)和妊娠期糖尿病的一種中間狀態(tài)，并有可能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為妊娠期糖（GDM）尿病。已有研究支持在糖耐量受損的妊娠中，大于胎齡兒、新生兒轉(zhuǎn)入ICU 及剖宮產(chǎn)、胎兒高胰島素血癥和胎盤成熟不良的發(fā)生率增高［1-3］。HOPA 的新研究結(jié)果也支持“隨著母體孕期糖耐量受損程度的加重，胎兒受累的危險(xiǎn)性變化是連續(xù)的”這一結(jié)論。GIGT和GDM 在發(fā)病機(jī)制上是相同的，只是病變程度有所不同，兩者對(duì)妊娠結(jié)局的影響也是極其相似的，這個(gè)已經(jīng)得到大量資料的證明。但臨床上常因GIGT引起的糖代謝紊亂相對(duì)較輕而被忽視，結(jié)果導(dǎo)致有些情況下GIGT 的妊娠結(jié)局比GDM 更嚴(yán)重，GIGT巨大兒發(fā)生率甚至高于GDM［4，5］。GIGT 的研究在產(chǎn)科發(fā)展中占據(jù)重要地位。在重視GDM 的同時(shí)，也不可忽視對(duì)GIGT 的研究。

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是糖代謝異常及糖尿病的關(guān)鍵因素之一。胰島素生理作用的反應(yīng)性降低或敏感性降低，其實(shí)質(zhì)為細(xì)胞對(duì)胰島素介導(dǎo)的糖代謝能力的減低。胰島素抵抗與全身炎癥反應(yīng)有關(guān)，脂肪細(xì)胞因子參與著妊娠期胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展過程，與妊娠期糖耐量異常密切相關(guān)［6，7］。本研究亦采用了液相芯片技術(shù)對(duì)與胰島素抵抗相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測(cè)，以尋找脂肪細(xì)胞因子表達(dá)水平變化與GIGT 之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù)知情同意的原則，選擇2008年11月至2009年11月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的漢族孕婦共80例，根據(jù)28周OGTT 檢測(cè)糖耐量情況分為2 組，其中妊娠期糖耐量受損（GIGT）組共40例，平均年齡（30.7±2.7）歲，平均孕齡（28.1±1.2）周；對(duì)照組為糖耐量正常孕婦，共40例，平均年齡（29.8±3.1）歲，平均孕齡（28.4±1.1）周。2組年齡、孕周均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)靜脈采血5 ml，其中2 ml靜脈血EDTA 鹽抗凝，另外3ml血靜置，離心，提取血清。所有樣本均置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 2組孕婦于孕26～30周進(jìn)行75g糖篩查，GIGT 診斷采用1999 年世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖＜7.0mmol／L且75g口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT）2 小時(shí)血糖在7.8～11.1mmol／L之間即可診斷為GIGT。

1.3 儀器 液相芯片系統(tǒng)Luminex 200TM（美國Luminex公司）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各細(xì)胞因子表達(dá)水平通過Luminex 100IS V2.3計(jì)算，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，樣本比較采用t檢驗(yàn)，變量之間互相關(guān)系用相關(guān)分析，非正態(tài)分布變量經(jīng)對(duì)數(shù)變換后分析。

2 結(jié) 果

2.1 比較結(jié)果 40例糖耐量正常孕婦的空腹血糖水平分布在3.0～4.1之間。餐后2小時(shí)血糖水平分布在4.4～5.23 之間。該組平均身高為（160±4.4）cm，孕前平均體重（49.5±4.0）kg，OGTT 平均體重為（59.9±5.6）kg。孕前BMI（19.4±1.5），孕中BMI（23.4±2.0）。

相似地，40例糖耐量受損的孕婦空腹血糖分布于3.1～6.1 之間，餐后2 小時(shí)血糖水平分布在8.43～15.02 之間。該組平均身高為（159±4.2）cm，孕前體重（54.6±8.3）kg，OGTT 平均體重為（65.4±9.3）kg，孕前BMI（21.5±3.0），孕中BMI（25.8±3.4）。

糖耐量正常孕婦組與糖耐量受損組之間，身高不具有顯著性差異，但孕前體重以及孕中體重具有顯著性差異（P＜0.01）。糖耐量受損組的孕前體重顯著高于正常對(duì)照組，至孕中期前者增加的體重?cái)?shù)目小于后者。

2.2 血清脂肪細(xì)胞因子的水平 采用Luminex液相芯片技術(shù)對(duì)脂肪細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、瘦素、MCP-1水平進(jìn)行了檢測(cè)，具體結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，在GIGT 組和正常對(duì)照組之間，血清瘦素水平具有顯著性差異（P＜0.01）。其他脂肪細(xì)胞因子在兩組之間則無明顯區(qū)別（P＞0.05）。

表1 孕婦血清IL-6、TNF-α、Leptin、MCP-1表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（x-±s）

3 討 論

3.1 妊娠期糖耐量受損組及對(duì)照組之間脂肪細(xì)胞因子表達(dá)水平的差異 瘦素（Leptin）是肥胖基因

（obese gene，Ob）編碼的167個(gè)氨基酸的蛋白產(chǎn)物，最初是由洛克菲勒大學(xué)杰克遜實(shí)驗(yàn)室通過定位克隆于ob／ob肥胖小鼠身上發(fā)現(xiàn)［8］，這些小鼠攜帶有瘦素缺陷型基因的純合子，結(jié)果導(dǎo)致瘦素的完全缺乏，表現(xiàn)為貪食、極度肥胖、糖尿病、神經(jīng)內(nèi)分泌異常、不孕等癥狀。瘦素主要由脂肪組織分泌，并且表達(dá)水平與身體脂肪含量密切相關(guān)［9］

本研究中發(fā)現(xiàn)瘦素在GIGT 患者中的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，這在其他相關(guān)的研究中也得到了證實(shí)［10-12］，結(jié)果支持可能瘦素水平將成為妊娠期糖耐量異常的一個(gè)潛在標(biāo)志物。目前筆者所知，懷孕是一個(gè)生理胰島素抵抗的狀態(tài)，如果胰島素分泌不能維持血糖平衡，孕婦將發(fā)展成為妊娠期糖耐量異常，而高瘦素血癥則會(huì)造成胰島素抵抗或者加劇胰島素抵抗，從而成為妊娠期糖耐量異常發(fā)生過程中的一個(gè)重要因素。瘦素的高表達(dá)量引發(fā)胰島素抵抗主要有以下幾個(gè)原因：①高濃度的瘦素可以通過葡萄糖-6-磷酸酶抑制肝糖原分解，而游離的葡萄糖又可以通過糖異生轉(zhuǎn)變成糖原，從來導(dǎo)致血糖水平降低，這種情況下，胰島素只有增加分泌來維持血糖平衡，引發(fā)胰島素抵抗［13］；②瘦素對(duì)脂肪的影響主要為抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解，胰島素則具有相反的作用，從而高濃度的瘦素引發(fā)胰島素抵抗［14］；③瘦素對(duì)胰島素分泌起到抑制作用，而胰島素則刺激瘦素分泌，兩者之間達(dá)到某種平衡。在病理狀態(tài)下，瘦素受體對(duì)瘦素不敏感，即瘦素敏感性下降，瘦素不能發(fā)揮作用，造成高瘦素血癥，瘦素不能有效抑制胰島β細(xì)胞分泌胰島素，兩者之間的平衡被打破，胰島素分泌增加，則導(dǎo)致胰島素抵抗［15］。

同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α、MCP-1 血清水平與GIGT 無明顯的關(guān)聯(lián)，而這些細(xì)胞因子又被報(bào)道與胰島素抵抗相關(guān)，筆者推測(cè)其原因可能是GIGT 為糖耐量異常的早期狀態(tài)，在這個(gè)過程中血清中相關(guān)的炎癥因子還未產(chǎn)生或者較少量產(chǎn)生，其存在的胰島素抵抗程度尚未非常嚴(yán)重，推測(cè)可能由單一瘦素所引發(fā)的胰島素抵抗造成了糖耐量受損。多個(gè)細(xì)胞因子引起的胰島素抵抗將具有累積效應(yīng)，可能在更為后期更嚴(yán)重的妊娠期糖耐量異常即GDM 中才能發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，血清瘦素水平與GIGT 密切相關(guān)，如果改善血清瘦素水平，提高胰島素敏感性，將對(duì)GIGT 的防治有重要的臨床意義。而IL-6、TNF-α、MCP-1等細(xì)胞因子水平與GIGT 則無關(guān)，其與GIGT 的關(guān)系需要我們進(jìn)一步的研究才能加以確定。

3.2 液相芯片技術(shù)在細(xì)胞因子檢測(cè)中的應(yīng)用 隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)已經(jīng)不能完全反映研究對(duì)象的生理狀態(tài)，而高通量的多指標(biāo)檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)成為臨床科學(xué)研究及臨床應(yīng)用的迫切需要。

Luminex液相芯片系統(tǒng)就是結(jié)合了流式細(xì)胞儀技術(shù)和微球技術(shù)的高通量檢測(cè)平臺(tái)，它可以對(duì)同一樣品同時(shí)進(jìn)行多達(dá)100種不同的檢測(cè)項(xiàng)目，樣本量卻僅僅需要25微升。

Luminex液相分析系統(tǒng)的核心技術(shù)包括了熒光微球技術(shù)、流式檢測(cè)技術(shù)和信號(hào)處理技術(shù)等幾部分，其中微球技術(shù)是Luminex 的特色所在。Luminex公司在其早期的研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，最初采用根據(jù)微球大小來區(qū)分出的微球類型數(shù)目受到很大限制，因此Luminex系統(tǒng)采用2種不同熒光染料對(duì)同一大小的微球進(jìn)行染色，每種染料分別有10種不同的濃度梯度，而這2個(gè)濃度梯度進(jìn)行自由組合后就可以得到100種可區(qū)分的不同顏色的微球，這樣不同的熒光微球上包被不同的檢測(cè)分子，就可以在一個(gè)反應(yīng)體系里同時(shí)檢測(cè)100種不同的分子。Luminex的檢測(cè)系統(tǒng)通過2 束不同波長(zhǎng)的激光進(jìn)行檢測(cè)，635nm的紅色激光照射微球后，微球能發(fā)射658nm和712nm 的熒光，根據(jù)探測(cè)到的熒光微球的熒光強(qiáng)度來判斷是哪種微球，從而對(duì)探針分子定性；另一束532nm 的綠色激光用來激發(fā)探針分子上的PE染料，通過對(duì)PE發(fā)出的橙色熒光強(qiáng)度的測(cè)量，來對(duì)待檢生物分子進(jìn)行定量。通過這個(gè)反應(yīng)體系，我們就能夠快速的對(duì)同一個(gè)樣本中的不同指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行定性定量檢測(cè)，由于其處理樣本類似計(jì)算機(jī)芯片密度高、速度快，且在溶液中進(jìn)行，故稱之為液相芯片技術(shù)。

在Luminex系統(tǒng)中，熒光微球是通過化學(xué)反應(yīng)與特定的分子（抗原抗體、核苷酸探針、受體與底物等）結(jié)合。在這一過程中，預(yù)先經(jīng)化學(xué)修飾的熒光微球提供活性化學(xué)基團(tuán)，此基團(tuán)與特定分子的特定化學(xué)基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合，從而各種探針分子得以穩(wěn)定地與微球結(jié)合，而且結(jié)合的效果可以方便地通過控制反應(yīng)中的條件來穩(wěn)定。這種化學(xué)偶聯(lián)熒光微球與各種探針的方式對(duì)于Luminex液相分析系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性是非常重要的。

3.3 孕前體重水平確實(shí)是發(fā)生GIGT 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 糖耐量正常孕婦組與糖耐量受損組之間，身高不具有顯著性差異，但孕前體重以及孕中體重具有顯著性差異（P＜0.01）。糖耐量受損組的孕前體重顯著高于正常對(duì)照組，至孕中前者增加的體重?cái)?shù)目小于后者。Young等［16］報(bào)道妊娠期OGTT 異常者中，孕前肥胖者發(fā)生GDM 的危險(xiǎn)性是正常者的22.4倍。Berkowitz等［17］報(bào)道，孕前高BMI者患GDM 的危險(xiǎn)性大大增加，經(jīng)多因素logistic回歸分析后，孕前高BMI是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。由此可見大量研究支持孕前肥胖是GDM 和GIGT 發(fā)生的重要因素。因此，控制孕前肥胖是預(yù)防GDM 和GIGT發(fā)生的重要方面，對(duì)孕前肥胖的孕婦應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，盡早識(shí)別和診斷GDM 和GIGT，降低母嬰并發(fā)癥的發(fā)生。

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