豇豆重花葉病毒RT－LAMP檢測方法的建立

郭木金， 廖富榮， 陳 青， 林石明＊， 陳紅運(yùn)， 沈建國

（1．廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局，廈門 361026； 2．福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002； 3．福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福州 350003）

豇豆重花葉病毒（Cowpea severe mosaic vir us，CPSMV）為類小 RNA 病毒目（Picor navirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花葉病毒亞科（Co movirinae）、豇豆花葉病毒屬（Comovir us）成員。該病毒主要侵染大豆（Gl ycine max）、菜豆（Phaseol us vul garis）、綠豆（Vigna r adiata）、豇豆（Vigna unguicul ata）等豆科植物，造成葉片斑駁和花葉，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整株萎縮甚至死亡［1－2］。目前，CPSMV主要分布在美洲地區(qū)，如特立尼達(dá)和多巴哥、古巴、巴西、墨西哥等國家［2］，而在我國還沒有發(fā)生危害的報(bào)道。CPSMV可通過菜豆葉甲（Cer atoma trif urcata）、南美葉甲（Diabr otica speciosa）等昆蟲介體傳播，也可機(jī)械傳播，還可通過長豇豆（Vigna sesquipedalis）、豇豆（V．unguicul ata）等種子傳播，以及花粉傳播［3］。由于該病毒的自然寄主在中國廣泛種植，且氣候條件相似，極可能隨著進(jìn)境的種子和昆蟲在國內(nèi)廣泛傳播，對(duì)我國豆科植物生長造成嚴(yán)重威脅。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop－mediated isother mal amplification，LAMP）是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和一個(gè)具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列，具有操作簡單、快速高效、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)［4］。自問世以后，已在動(dòng)物疫病的診斷、動(dòng)物胚胎性別鑒定、植物病毒檢測和轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域逐漸得到推廣應(yīng)用。針對(duì)CPSMV，目前已建立了生物學(xué)測定［5］、DAS－ELISA［5］，RT－PCR［3］，IC－RT real－ti me PCR［7］等方法，但還未建立LA MP檢測方法。本研究根據(jù)CPSMV外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過條件優(yōu)化，建立了CPSMV的RT－LA MP方法，為CPSMV的檢測提供一種新的快速高效、特異、靈敏的檢測方法。

1 材料與方法

1．1 材料

豇豆重花葉病毒（CPSMV）毒源來自美國菌種保藏中心（ATCC）（PV－273）；豇豆花葉病毒（Cowpea mosaic virus，CPMV）、菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）、南瓜花葉病毒（Squash mosaic virus，Sq MV）、安第斯馬鈴薯斑駁病毒（Andean potato mottle vir us，Ap Mo V）陽性對(duì)照樣品購自美國Agdia公司；M－MLV Reverse Transcriptase 購自 Pr omega公司；DreamTaqTMDNA Poly merase、d NTPs和RibolockTMRNase Inhibitor購自Fer ments公司；Bst DNA聚合酶大片段購自NEB公司；Tri Pure Isolation Reagent購自Roche公司；其他生化試劑均為常規(guī)分析純?cè)噭?/p>

1．2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫中CPSMV外殼蛋白基因已知序列，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Pri mer Explore 4．0（http：∥pri merexplorer．jp／ela mp4．0．0／index．ht ml）進(jìn)行RT－LA MP引物設(shè)計(jì)與篩選，由外引物（CPSMV－F3、CPSMV－B3）和內(nèi)引物（CPSMVFIP、CPSMV－BIP）組成，其序列見表1。用于普通RT－PCR擴(kuò)增的引物CPSMVf和CPSMVr，根據(jù)文獻(xiàn)合成［6］。RT－LA MP引物和普通RT－PCR引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 豇豆重花葉病毒（CPSMV）RT－LAMP檢測引物

1．3 總RNA的提取

按照Tri Pure Isolation Reagent使用說明書進(jìn)行病葉總RNA的提取。

1．4 RT－PCR

普通RT－PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及條件參照文獻(xiàn)進(jìn)行［6］。反應(yīng)結(jié)束后，取5．0μL的PCR產(chǎn)物采用2．0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1．5 CPSMV RT－LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

1．5．1 Mg2＋濃度的篩選

分別設(shè)置0、2．0、4．0、6．0、8．0、10．0、12．0、14．0 mmol／L等8個(gè) Mg2＋濃度梯度，進(jìn)行 Mg2＋濃度優(yōu)化。在65℃下反應(yīng)60 min后，取5．0μL的LA MP產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．5．2 d NTP濃度的篩選

Mg2＋濃度篩選后，分別設(shè)置0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4、1．6、1．8 mmol／L 等 10 個(gè)d NTP濃度梯度，對(duì)d NTP濃度進(jìn)行篩選。反應(yīng)條件同上，反應(yīng)結(jié)束后各取5．0μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．5．3 內(nèi)外引物濃度比的篩選

其他條件保持不變，調(diào)整內(nèi)外引物濃度比。外引物和內(nèi)引物的比例分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。反應(yīng)條件同上，反應(yīng)結(jié)束后各取5．0μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．6 RT－LAMP產(chǎn)物檢測

1．6．1 沉淀反應(yīng)檢測

在LA MP反應(yīng)體系中，生成的焦磷酸鹽可與鎂離子結(jié)合而生成白色副產(chǎn)物—焦磷酸鎂沉淀。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)5 000 r／min離心5 min，直接用肉眼觀察PCR管底部是否有白色沉淀。如果產(chǎn)生白色沉淀為陽性反應(yīng)，無白色沉淀則為陰性反應(yīng)。

1．6．2 染色肉眼檢測

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，加入1．0μL SYBR Green I染料，觀察LA MP反應(yīng)液是否發(fā)生顏色變化。如果產(chǎn)生綠色為陽性反應(yīng)，橙色則為陰性反應(yīng)。

1．6．3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

反應(yīng)結(jié)束后，取5．0μL的反應(yīng)產(chǎn)物，于2．0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。

1．7 特異性試驗(yàn)

利用所建立的CPSMV RT－LA MP方法，分別對(duì)BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V等同屬病毒的陽性樣品，以及健康的豇豆、大豆、菜豆等寄主植物的葉片樣品進(jìn)行檢測。

1．8 靈敏性試驗(yàn)

將c DNA模板進(jìn)行10倍系列稀釋，即稀釋成1．0×10－1到1．0×10－8的8個(gè)濃度，分別進(jìn)行 RTLA MP和RT－PCR檢測，對(duì)比兩者之間的檢測靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2．1 RT－LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

以豇豆重花葉病毒c DNA為模板，CPSMV－F3、CPSMV－B3、CPSMV－FIP、CPSMV－BIP為引物，分別對(duì)Mg2＋濃度、d NTP濃度、內(nèi)外引物濃度比例進(jìn)行優(yōu)化，LA MP擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。從Mg2＋濃度試驗(yàn)結(jié)果看，隨著 Mg2＋濃度升高擴(kuò)增的條帶也越來越清晰；當(dāng) Mg2＋濃度達(dá)到8．0 mmol／L后，隨著 Mg2＋濃度升高，條帶亮度沒有明顯變化。因此，最佳的 Mg2＋濃度為8．0 mmol／L（圖1a）。

d NTP濃度試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著d NTP濃度升高擴(kuò)增的條帶也越來越清晰，當(dāng)濃度為0．6～1．0 mmol／L時(shí)，條帶亮度沒有明顯區(qū)別；當(dāng)濃度達(dá)到1．2 mmol／L時(shí)，隨著濃度的提高，條帶亮度逐漸降低；當(dāng)濃度達(dá)到1．6 mmol／L時(shí)，沒有反應(yīng)產(chǎn)生。因此，最佳的d NTP濃度選擇1．0 mmol／L（圖1b）。

內(nèi)外引物濃度試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著內(nèi)外引物濃度比例的逐漸增加擴(kuò)增的條帶也越來越清晰；當(dāng)外引物和內(nèi)引物比例在1∶6到1∶10之間時(shí)，條帶亮度沒有明顯改變。為節(jié)省材料，選擇外引物和內(nèi)引物濃度比例1∶6為最佳濃度比（圖1c）。

綜上所述，所建立CPSMV RT－LA MP檢測方法的最佳反應(yīng)體系為Bst DNA聚合酶（8 U／μL）1．0 μL，10×Bst DNA聚合酶緩沖液2．5μL，c DNA模板2．0μL，MgSO4（100 mmol／L）2．0μL，甜菜堿（betaine）（5 mol／L）4．0μL，d NTP（10．0 mmol／L）2．0μL，10．0μmol／L CPSMV－FIP和BIP各3．0μL，10μmol／L CPSMV－F3和 B3 各0．5μL，加滅菌水補(bǔ)充至25μL。反應(yīng)條件為：65℃溫浴60 min。

此外，包括空白對(duì)照在內(nèi)的各泳道中，均產(chǎn)生小于100 bp的引物二聚體（圖1）。

圖1 CPSMV RT－LAMP檢測反應(yīng)體系優(yōu)化

2．2 RT－LAMP產(chǎn)物檢測

沉淀觀察結(jié)果表明，在CPSMV陽性樣品的反應(yīng)管中生成白色沉淀（白色箭頭所示），而在陰性對(duì)照的反應(yīng)管中沒有生成白色沉淀（如圖2a）。向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1．0μL SYBR Green I染料后，顏色反應(yīng)結(jié)果表明，在CPSMV陽性樣品的反應(yīng)管中產(chǎn)生綠色，而陰性對(duì)照的反應(yīng)管則仍為橙色（如圖2b）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，可以觀察到CPSMV陽性樣品產(chǎn)生典型的梯狀條帶，而陰性樣品則沒有產(chǎn)生梯狀條帶，但產(chǎn)生小于100 bp的引物二聚體（如圖2c）。

圖2 CPSMV RT－LAMP檢測結(jié)果判定

2．3 RT－LAMP的靈敏性試驗(yàn)

將CPSMV c DNA模板進(jìn)行10倍系列稀釋，分別進(jìn)行 RT－LA MP和 RT－PCR 檢測。RT－LA MP試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)濃度稀釋到10－3倍時(shí)，條帶逐漸變淡，直至10－6倍時(shí)仍有清晰的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)；而稀釋到10－7倍時(shí)，沒有產(chǎn)生典型的梯狀條帶（圖3a）。常規(guī)RT－PCR檢測結(jié)果表明，在未稀釋的模板中除了產(chǎn)生約350 bp的特異性條帶外，還產(chǎn)生大于1 500 bp、約900 bp和約230 bp的3條非特異性條帶；隨著模板濃度的逐漸降低，特異性條帶亮度也逐漸變淡，非特異性條帶消失；當(dāng)稀釋到10－6倍時(shí)，沒有任何條帶出現(xiàn)（圖3b）。以上結(jié)果表明，所建立的RT－LAMP檢測方法靈敏度比常規(guī)RT－PCR檢測法高10倍。

圖3 RT－LAMP和RT－PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2．4 RT－LAMP的特異性試驗(yàn)

利用所建立的CPSMV RT－LA MP方法，分別對(duì)BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V 等同屬病毒，以及健康的豇豆、大豆、菜豆等寄主植物進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在同屬的BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V等病毒中均未產(chǎn)生典型的梯狀條帶，CPSMV寄主豇豆、大豆、菜豆等健康植物也未產(chǎn)生典型的梯狀條帶（圖4）。因此，所建立的CPSMV LA MP檢測方法并不會(huì)與同屬的其他病毒及其寄主植物產(chǎn)生交叉反應(yīng)，顯示出良好的特異性。

圖4 RT－LAMP的特異性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

LAMP方法自建立以來，已逐漸在植物病毒的檢測中得到推廣應(yīng)用。目前，已建立了日本山藥花葉病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）［8］、番茄黃曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）［9］、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）［10］、馬鈴薯Y病毒（Potato vir us Y，PVY）［11］、建蘭花葉病毒（Cy mbidiu m mosaic vir us，Cy MV）［12］、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic vir us，T MV）［13］、菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle vir us，BPMV）［14］等多種病毒的LA MP檢測方法。本研究根據(jù)豇豆重花葉病毒外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過條件優(yōu)化，建立了CPSMV的RT－LA MP方法。

LA MP方法具有良好的靈敏度，如聞偉剛等建立的BPMV的RT－LAMP方法的檢測靈敏度比RT－PCR方法高1 000倍［14］。本研究的靈敏度檢測表明，所建立的RT－LA MP檢測靈敏度可以比李彬等建立的常規(guī) RT－PCR［6］靈敏度高10倍。另外，由于該技術(shù)所利用的引物需要識(shí)別靶序列上6個(gè)特異性區(qū)域，而常規(guī)的RT－PCR方法引物只識(shí)別靶序列上2個(gè)特異性區(qū)域，所以在理論上具有更高的特異性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的CPSMV RT－LAMP方法并不會(huì)與同屬的其他病毒、及病毒的寄主植物產(chǎn)生交叉反應(yīng)，顯示出良好的特異性。此外，RT－LA MP方法反轉(zhuǎn)錄和LA MP反應(yīng)均可在水浴鍋（或恒溫孵育器）中完成，且只需要1個(gè)溫度在1 h內(nèi)完成，操作也相對(duì)簡便。RT－LA MP的結(jié)果檢測除了可以利用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳方法，還可以使用DNA染料染色、沉淀觀察等方法進(jìn)行快速檢測。因此，與常規(guī)的RT－PCR方法相比，建立的CPSMV RT－LA MP方法具有更高的靈敏度、良好的特異性，操作也更為簡便、快速。

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