我國不同地區(qū)麥蚜攜帶BYDV－GAV比率的差異

楊 菲， 吳茂森， 陳華民， 田 芳， 曲 玲， 曹雅忠， 何晨陽＊

（1．中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2．寧夏農(nóng)林科學院，國家枸杞工程技術研究中心，銀川 750002）

麥類黃矮病是一種分布廣泛、危害嚴重的禾谷類病毒病，由蚜蟲攜帶大麥黃矮病毒進行傳播。國外于1951年首次報道，發(fā)生在美國加利福尼亞州大麥上［1］。1960年在我國陜西、甘肅的小麥上發(fā)現(xiàn)。1966－1999年間，由于蚜蟲介體的猖獗，在我國北方冬春麥產(chǎn)區(qū)多次造成病毒病流行，損失極大［2－5］。

我國小麥黃矮病以減少蚜蟲數(shù)量和選育推廣抗性品種為主要防治途徑［6］，因此對蚜蟲進行預測預報十分重要。成卓敏等于1992年報道了在實驗室內(nèi)對蚜蟲飼毒，成功進行單頭蚜蟲帶毒檢測的試驗［7］，但目前還沒有對田間蚜蟲帶毒情況進行檢測研究的報道。本研究以我國小麥黃矮病重病區(qū)和非重病區(qū)小麥抽穗期的麥蚜為研究對象，運用RTPCR方法檢測單頭蚜蟲攜帶大麥黃矮病毒的情況，明確我國不同地區(qū)田間蚜蟲帶毒率的差異，為闡明田間蚜蟲帶毒率與小麥黃矮病發(fā)病情況的關系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

蚜蟲樣本分別采自我國小麥主產(chǎn)地山西、甘肅、青海、陜西、河南和河北等地區(qū)黃矮病重病區(qū)和非重病區(qū)小麥田間植株。PCR引物由Invitr ogen公司合成。RNA提取試劑Trizol、Super Script?Ⅲ反轉錄酶購自北京Invitrogen公司，RNase抑制劑、d NTPs購自Ta Ka Ra公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 方法

1．2．1 RNA提取

離心管中放入單頭蚜蟲，在液氮冷凍條件下用玻璃棒研碎，加入400μL Trizol試劑進行萃取，80μL氯仿用于抽提，加入大于上清體積60% 的異丙醇沉淀RNA，沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌風干后，溶于適量DEPC水，立即進行反轉錄或置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 引物設計

根據(jù)GenBank中BYDV－GAV外殼蛋白基因序列比較設計合成一對特異引物，GAVCP 1：5′－AGTTCGGAGAATGGTTGTGG－3′；GAVCP 2：5′－TTGTAACGGTGGTAGGACTTG－3′。

1．2．3 RT－PCR

參照Super Script?反轉錄試劑盒說明書進行總RNA反轉錄，獲得c DNA。

以2μL c DNA為模板，依次加入10×緩沖液2．5μL，d NTPs（2．5 mmol／L）1．0μL，上下游引物（10μmol／L）各0．5μL，Taq酶（2．5 U／μL）0．5μL，dd H2O補足反應體積至25μL。擴增程序為：94℃，3 min；（94℃30 s，61℃30 s，72℃1 min）×32個循環(huán)。

1．2．4 RT－PCR靈敏度測定

為確保檢測結果的靈敏度和可靠性，選擇已知的單頭帶毒蚜蟲c DNA樣品系列稀釋后進行PCR擴增，電泳檢測體系的靈敏度與特異性。

1．2．5 RT－PCR檢測蚜蟲帶毒率

于小麥抽穗期分別從山西、甘肅、青海、陜西、河南和河北等地麥田采集BYDV－GAV介體蚜蟲麥二叉蚜及麥長管蚜，每個采樣點取蚜蟲200頭，分別提取RNA，參照1．2．3的方法進行 RT－PCR分析，計算蚜蟲帶毒率。

2 結果與分析

2．1 檢測體系靈敏度測定

對單頭帶毒蚜蟲c DNA樣品系列稀釋后的PCR結果進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果表明（圖1），c DNA模板稀釋200倍時，仍可見清晰的特異擴增條帶，并且為唯一擴增產(chǎn)物，經(jīng)序列測定，確定與GAV外殼蛋白基因序列一致。表明所建立的檢測體系具有較高的靈敏度和特異性，測定樣本用量可少至1／200頭蚜蟲。

圖1 RT－PCR靈敏度檢測結果

2．2 蚜蟲帶毒率測定

對采自不同麥區(qū)的蚜蟲樣本進行RT－PCR檢測，從圖2的瓊脂糖凝膠電泳結果可見，蚜蟲樣本PCR擴增條帶清晰特異，與陽性對照大小一致。蚜蟲帶毒率測定的統(tǒng)計結果表明，不同地區(qū)麥田蚜蟲帶毒率存在明顯差異（表1），采集自重病區(qū)小麥田的蚜蟲具有較高的帶毒率，山西汾陽和甘肅渭源的發(fā)病麥田蚜蟲的帶毒率達到了90%以上；發(fā)病稍輕的陜西楊凌麥田蚜蟲帶毒率也達到了56%；其他重病區(qū)麥田蚜蟲帶毒率均在70%以上。對非重病區(qū)的河南和河北小麥田蚜蟲檢測結果，帶毒率顯著較低，表明小麥田間蚜蟲帶毒率與小麥黃矮病發(fā)生嚴重度具有直接的相關性。

圖2 各地區(qū)蚜蟲帶毒情況檢測結果

表1 各地區(qū)蚜蟲帶毒率統(tǒng)計結果

3 結論與討論

本研究通過設計BYDV－GAV特異引物，建立了田間單頭蚜蟲攜帶小麥黃矮病病毒的RT－PCR檢測方法。該方法具有較高的靈敏度和特異性，測定樣本用量可少至1／200頭蚜蟲。與成卓敏等人測定樣本用量少至1／20頭蚜蟲［7］相比，本方法具有更高的靈敏度。

為明確我國不同地區(qū)麥蚜攜帶BYDV－GAV比率的差異，本研究利用上述方法對采自不同麥區(qū)的小麥蚜蟲攜帶小麥黃矮病病毒的情況進行了檢測。發(fā)現(xiàn)采自重病區(qū)的麥蚜帶毒率高，而非重病區(qū)則帶毒率低。因此，蚜蟲帶毒率的高低與當?shù)匦←滭S矮病發(fā)生嚴重度呈正相關性。此檢測體系可成功應用于田間蚜蟲攜帶小麥黃矮病病毒的檢測，并可進一步用于田間蚜蟲群體帶毒率與黃矮病發(fā)病率關系的定量分析。由于除氣象因素外，越冬和早春蚜蟲數(shù)量及有蚜株率也都是黃矮病流行與否的關鍵因素［8］，因此可將此體系應用于對越冬和早春田間蚜蟲樣本攜帶大麥黃矮病毒的檢測，從而為小麥黃矮病的預測預報提供科學依據(jù)。

在本研究工作的基礎上，后續(xù)試驗正在利用RT－Q－PCR技術，定量檢測單頭蚜蟲攜帶的病毒量、不同飼毒時間蚜蟲帶毒量的變化，闡明單頭蚜蟲帶毒量與成功傳毒的關系。

［1］ Oswald J W，Houston B R．A new virus disease of cereals trans mitted by aphid［J］．Plant Disease Report，1951，35：471－475．

［2］ 周廣和，成卓敏，張向才，等．麥類病毒病及其防治［M］．上海：上海科學技術出版社，1987：8．

［3］ 張鴻杰，徐建兵．1999年小麥黃矮病流行原因及其防治對策［J］．小麥研究，2000，21（3）：33－35．

［4］ 趙多長．天水市1999年小麥黃矮病流行原因分析與綜防對策［J］．甘肅農(nóng)業(yè)科技，2000（4）：38－39．

［5］ 王小明．秦安縣1999年小麥黃矮病發(fā)生情況調(diào)查［J］．甘肅農(nóng)業(yè)科技，2000（5）：35－36．

［6］ 謝皓，陳孝．我國抗黃矮病小麥研究進展［J］．北京農(nóng)學院學報，1999，14（2）：55－57．

［7］ 成卓敏，Waterhouse P M，王立陽，等．應用聚合酶鏈式反應方法檢測攜帶大麥黃矮病毒的單頭蚜蟲［J］．病毒學報，1992，8（1）：80－84．

［8］ 相建業(yè)，馮崇川．小麥黃矮病預測預報［J］．植物保護學報，1994，21（1）：73－78．