116個小麥品種（系）抗葉銹基因Lr9－Lr26、Lr19－Lr20的復合PCR檢測

任曉利， 劉太國， 劉 博， 高 利， 陳萬權

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

小麥葉銹病是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一，在世界各小麥種植區(qū)域均有分布。我國小麥葉銹病以西南、長江流域麥區(qū)發(fā)生較重，華北、東北麥區(qū)曾造成嚴重損失，成為生產(chǎn)上一個重要問題［1－2］。篩選和培育抗病品種是防治小麥葉銹病最為經(jīng)濟、安全和有效的方法。然而，由于抗葉銹品種的單一化種植和小麥葉銹菌新毒性的產(chǎn)生，經(jīng)常導致品種抗銹性的“喪失”。因此，深入研究小麥葉銹病抗源及抗性基因是抗病育種的基礎［3］。

截至2010年，小麥中已發(fā)現(xiàn)近100多個抗葉銹基因，其中72個被正式命名，67個被定位，39個抗病基因被標記［4］。來源于黑麥的Lr26與抗條銹基因Yr 9、抗稈銹基因Sr31、抗白粉基因Pm8連鎖，廣泛用于我國小麥抗病育種中，該基因與其他抗性基因復合存在可提高抗病性［5］。Lr20發(fā)現(xiàn)于普通小麥中，定位于染色體7 AL上，是抗白粉病基因Pm1和抗稈銹病基因Sr15基因簇的一部分。Lr20低溫下對溫度反應不敏感，表現(xiàn)有效的抗葉銹性，但當溫度高于30．5℃時，完全失去抗銹作用［5］。Lr9 和Lr 19至今在我國表現(xiàn)很好的抗葉銹性，仍是有效的抗葉銹基因，在生產(chǎn)上有很大的利用價值［6］。

Lr9［7－8］、Lr19［9－10］、Lr20［11］、Lr26［12－14］等 17 個 抗葉銹病基因的RFLP、RAPD、AFLP標記已轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定簡便的STS（sequence tagged site，STS）、SCAR（sequence characterized amplified regions，SCAR）等標記，可以應用于分子輔助鑒定，為基因檢測開辟了簡捷可靠的途徑。1988年Chamberian［15］等率先提出了多重PCR（multiplex poly merase chain reaction，MPCR）檢測技術，即在同一反應體系中加入一對以上的引物，針對幾個靶位點同時進行特異性擴增的PCR快速檢測技術［16］。與單一基因分子標記的PCR相比，多重PCR在一次PCR中就可檢測幾個目標基因，同時該技術快速、簡便、靈敏、可靠，從而使工作效率顯著提高，成本明顯降低。Procunier［17］構建了小麥抗葉銹基因Lr29－Lr25的復合PCR體系，可以在一次PCR中同時檢測小麥品系中是否含有Lr29和Lr25。Su míková等［18］構建了小麥抗葉銹病基因Lr26－Lr37的復合PCR體系，檢測了21個冬小麥品種，結(jié)果表明Lr37存在于4個品種中，一個品種含有Lr26，3個品種同時含有Lr26和Lr 37。孟顥光［19］等利用小麥條銹菌和葉銹菌的特異性SCAR標記引物，進行小麥銹菌的復合PCR檢測，可準確區(qū)分小麥條銹菌和葉銹菌，提高檢測效率。Ma W等［20］利用3對特異性引物構建了多重PCR反應體系，可以在一個PCR反應中檢測3個小麥高分子量麥谷蛋白基因Glu－A1的Ax2＊亞基、Glu－B1的Bx7和Bx17亞基和Glu－D1的Dx5亞基4種基因型。而目前小麥抗葉銹病基因Lr9－Lr26、Lr19－Lr20的復合PCR檢測體系尚未見報道。傳統(tǒng)的抗病基因推導耗時、低效、需銹菌培養(yǎng)與接種鑒定，無法滿足育種家對抗病育種要求，因此，利用已知小麥抗葉銹病基因分子標記，開發(fā)簡單、快速和有效的多重PCR技術對加快其在抗病育種上的應用，縮短育種年限，加快后代抗病品種準確選擇，促進小麥抗葉銹病分子標記輔助育種的實用化具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料

以春小麥‘Thatcher’為背景的28個已知抗葉銹病小麥近等基因系和16個已知基因載體品系中，Lr14a引自美國農(nóng)業(yè)部禾谷類銹病室，Lr37引自法國，Lr38的載體品系為‘Zhong＃4’（A inter mediu m）［21］，其余均由國際玉米小麥改良中心（CI MMYT）提供。

供試的116個待測小麥品種（系）絕大多數(shù)屬中國目前小麥主產(chǎn)區(qū)（16個省、市、自治區(qū)）大面積種植的生產(chǎn)品種和2004年、2005年通過國家小麥品種審定委員會審定的品種及一些新育成品種，如蘭天系和中梁系品種（系）（表1）。

1．2 STS分析

參照Gill等［22］提供的CTAB法提取小麥苗基因組DNA，并經(jīng)改進。根據(jù)已報道Lr9和Lr26的STS標記序列（表2），由上海生工生物工程有限公司合成引物。擴增試驗均獨立重復2次。

PCR反應體系為10μL，含5μL 2×Taq Plus PCR Master Mix，每條引物（5μmol／L）0．5μL，模板DNA 100 ng。PCR反應程序為94℃，3 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色，用伯樂公司Gene－Doc凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增結(jié)果。

Lr9－Lr26復合 PCR反應體系為20μL，含10μL 2×Taq Pl us PCR Master Mix，Lr26 每條引物（5μmol／L）0．5μL，Lr9 每條引物（5μmol／L）1μL，模板DNA 100 ng；Lr19－Lr20 復合PCR反應體系為20μL，含10μL 2×Taq Plus PCR Master－Mix，Lr20 每條引物（5μmol／L）0．5μL，Lr19 每條引物（5μmol／L）1μL，模板 DNA 100 ng。PCR反應程序為94℃，3 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增結(jié)果。

表1 供試116個小麥品種（系）的名稱和系譜

續(xù)表1

表2 用于抗葉銹基因鑒定的STS分子標記

2 結(jié)果與分析

2．1 STS標記的特異性檢測

用以春小麥‘Thatcher’為背景的28個近等基因系和16個已知基因載體品系材料對Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的STS標記進行特異性檢測，Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的STS標記成功地從近等基因系Tc Lr9、Tc Lr26、Tc Lr19和Tc Lr20中擴增出1 000、210、130 bp和542 bp DNA條帶，與報道片段大小相同（表2），在其他43個小麥材料（包括近等基因系輪回親本‘Thatcher’）中未擴增出特異性DNA片段，證明標記STSLr9、STSLr26、STSLr19和STSLr20具有選擇特異性（圖1～4）。

2．2 供試小麥品種的PCR檢測

各供試小麥品種基因組DNA 重復擴增STS 2次，結(jié)果表明116個小麥品種中47個品種：‘石4185’（L4，表1第4號，下同）、‘邯6172’（L8）、‘邯4564’（L11）、‘綿陽28’（L16）、‘小偃22’（L18）、‘京東8號’（L20）、‘淮麥20’（L23）、‘濰麥8號’（L25）、‘魯麥1號’（L34）、‘陜229’（L35）、‘高優(yōu)503’（L37）、‘鄭麥98’（L38）、‘綿農(nóng)4號’（L40）、‘衡95觀26’（L41）、‘蘭天10號’（L42）、‘周麥16’（L45）、‘山農(nóng)664’（L46）、‘宛麥369’（L47）、‘GS鄭麥004’（L56）、‘周麥17’（L57）、‘冀麥21’（L59）、‘衡5229’（L61）、‘連麥2號’（L68）、‘周麥18’（L70）、‘泛麥5號’（L71）、‘百農(nóng) AK58’（L72）、‘許麥29’（L79）、‘衡7228’（L80）、‘河東 TX－006’（L81）、‘蘭天11’（L83）、‘蘭天14’（L85）、‘蘭天20’（L90）、‘蘭天21’（L91）、‘蘭天22’（L92）、‘中梁22’（L94）、‘中梁24’（L95）、‘中梁9589’（L100）、‘A3－5’（L101）、‘天9633－5’（L102）、‘輪選987’（L105）、‘徐856’（L106）、‘石家莊8號’（L107）、‘花培5號’（L108）、‘項麥986’（L110）、‘鄭麥9694’（L113）、‘洛麥21’（L114）和‘04中3604’（L115）可擴增出1條210 bp的Lr26特異性DNA條帶，而其他品種中未檢測到該條帶（圖5）；‘中梁26’可擴增出1條130 bp的Lr19特異性DNA片段（圖6），116個品種中未擴增出與近等基因系材料Tc Lr 9和Tc Lr 20特異性目的DNA片段相同的產(chǎn)物（圖7和圖8）。

圖5 116個供試小麥品種Lr26 STS標記擴增結(jié)果（1～116為品種編號，名稱見表1）

2．3 供試小麥品種的Lr9－Lr26和Lr19－Lr20的復合PCR檢測

化PCR反應體系和循環(huán)條件，構建Lr9－Lr26和Lr 19－Lr20的復合PCR體系。結(jié)果表明，引物組合A：（Lr9 J13／1，Lr9 J13／2）和（Lr26F：IB，Lr26 R：IB）可以專一性擴增出抗葉銹基因Lr9和Lr 26的1 000 bp和210 bp特異性DNA片段（圖9）；引物組合 B：（Lr19Gb F，Lr19Gb R）和 （Lr20STS638－L，Lr20STS638－R）可以專一性擴增出抗葉銹基因Lr19和Lr20的130 bp和542 bp特異性DNA片段（圖10）；Lr19、Lr20和Lr26的特異性DNA序列見圖11－圖13。供試小麥品種Lr9－Lr26和Lr19－Lr20的復合PCR檢測（圖略），擴增結(jié)果與單個Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的PCR檢測的結(jié)果一致。

圖13 Lr26特異片段序列（圖中下劃線字母為引物序列）

3 討論

多重PCR較單個PCR高效、靈敏、特異且易區(qū)分，具有實際應用價值。但其對試驗條件要求比較嚴格，如何提高多重PCR的穩(wěn)定性和重復性是該技術能否大規(guī)模應用于分子育種輔助選擇的關鍵。引物的特異性是PCR擴增成功的關鍵，而MPCR反應條件的優(yōu)化則是多重PCR擴增成功的關鍵，基于常規(guī)循環(huán)量下，模板、各引物濃度及適宜退火溫度起了決定作用。初次進行多重反應時，首先選擇引物退火溫度相近，引物間二聚體較少的組合；本試驗根據(jù)引物組合A和B中的各個引物的退火溫度設定了從52～67℃的12個退火溫度梯度，并且各種引物按相等的摩爾數(shù)添加，模板也按相等的摩爾數(shù)添加，摸索出最適的退火溫度；然后根據(jù)要增加“弱”基因的引物量，而要減少“強”基因的引物量的原則，改變反應中各種引物的比例；復合PCR的程序仍舊遵循單個PCR的程序。

對于建立在PCR技術上的特異性引物分子標記，只需極少的DNA樣品即可快速、可靠、便捷地檢測和追蹤，不受環(huán)境影響，因而成為首選的檢測方法；尤其是與抗病基因緊密連鎖的單一位點有無的STS標記，可直接在PCR管中加入溴化乙錠，通過在紫外燈下觀察有無熒光來判斷有無擴增產(chǎn)物，比較DNA間的差異，省略電泳步驟，使檢測方法變得方便、快速地檢測大量個體。而在一次擴增中獲得兩個或多個STS標記的多重PCR無疑較單個PCR具有更高的擴增效率，較低的成本，節(jié)約試驗樣品，可獲得更為豐富的信息。因此，在更多與抗病基因緊密連鎖特異性分子標記開發(fā)的基礎上，復合PCR技術應用于抗病育種的分子標記輔助選擇具有廣泛的應用前景。

1971年，我國從羅馬尼亞引進了以‘洛夫林’為代表的小麥－黑麥的1BL／1RS易位系新種質(zhì)，當時因其綜合性狀較好能抗3種銹病和白粉病，被育種家廣泛利用，選育出一大批新品種，導致目前我國小麥品種中含有Lr26和Yr9的頻率很高。周陽等報道［23］，北 方 冬 麥 區(qū) 1BL／1RS 易 位 系 出 現(xiàn) 頻 率 為59%，黃淮冬麥區(qū)頻率42%。在供試的116個品種中，利用分子標記檢測出47個品種中含有Lr26（40．5%），與利用Yr 9進行分子檢測結(jié)果一致（文章未發(fā)表）。在利用28個具有不同毒性（組合）的小麥葉銹菌單孢分離物對所供試品種進行基因推導時，推導出43個品種含有Lr26，與分子檢測結(jié)果一致，其中‘綿陽28’（L16）、‘小偃22’（L18）、‘高優(yōu)503’（L37）和‘徐麥29’（L79）雖PCR檢測含有Lr26，但未推導出其含有Lr26，可能不同菌系的鑒別力會受到環(huán)境條件的微觀作用，這4個品種中也可能存在對Lr26的抑制基因；或者發(fā)生了遺傳重組；或者1B／1R代換系或易位系存在有抗病基因Lr26丟失的情況。對小麥抗葉銹病基因Lr26的抑制性尚未見相關文獻報道，有待進一步研究。

通過系譜分析，‘衡5229’（L61）、‘泛麥5號’（L71）和‘衡 7228’（L80）的 Lr26 可能源于‘冀5418’［25－26］；‘百 農(nóng) AK58’（L72）和 ‘04 中 3604’（L115）的Lr26 可能源于‘周麥11’［26－27］；‘石4185’（L4）、‘京東8號’（L20）、‘淮麥20’（L23）、‘魯麥1號’（L34）、‘陜229’（L35）、‘GS鄭麥004’（L56）、‘河東 TX－006’（L81）和‘A3－5（L101）’的Lr26 分別來自‘洛夫林10’、‘洛夫林13’、‘山前麥’和‘牛朱特’等?！?185’（L4）、‘邯6172’（L45）、‘周麥16’（L45）、‘周麥18’（L70）、‘百農(nóng) AK58’（L72）和‘蘭天14’（L85）這6個品種含有Lr26 與 Li［27］推導出的結(jié)果一致。

通過分子檢測‘中梁26’可能含有抗葉銹基因Lr19，‘中梁26’在苗期對所有測試的28個小麥葉銹菌致病類型均表現(xiàn)高抗，其親本組合中，‘Ciemenp’抗條銹、葉銹和稈銹，且抗白粉［28］，而‘8 W5015’為抗條銹品種，其他材料均不抗?。ㄋ谓s，私人交流），因此Lr19基因可能來自于‘Ciemenp’。

關于Lr9的STS標記，已發(fā)表文獻中有兩種觀點，一種是其可擴增出1 000 bp，如本研究Lr9 STS標記可從近等基因系Tc Lr 9擴增出1 000 bp DNA條帶，與劉志勇等［29］和 Urbanovich等［30］報道片段大小相同；而另一種觀點認為可擴增出1 100 bp特異性DNA條帶，如Schacher mayr等［9］和 Tyryshkin 等［31］，圖中雖可明確其大小與其他泳道中擴增的條帶如Lr25有所不同，但仍需測序明確其準確數(shù)值。

4 結(jié)論

本研究構建的2個多重PCR體系穩(wěn)定、可靠，能方便、準確地應用于分子標記輔助選擇育種。任何育種目標都不僅僅是對單一性狀的篩選，如果同時利用多種性狀的分子標記輔助育種，如抗病基因和品質(zhì)基因的分子標記輔助選擇，可加快育種進程、縮短育種年限，提高效率，同時降低DNA提取的成本和工作量，從而使分子標記輔助選擇（MAS）真正成為一種快速、有效、經(jīng)濟的育種方法。

［1］ 李振岐，曾士邁．中國小麥銹病［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：184．

［2］ Kol mer J A．Genetics of resistance to wheat leaf rust［J］．Annual Reviews of Phytopat hology，1996，34：435－455．

［3］ 陳萬權，王劍雄．76個小麥種質(zhì)資源抗葉銹及稈銹基因初步分析［J］．作物學報，1997，23（6）：655－663．

［4］ McIntosh R A，Dubcovsky V，Rogers W J，et al．Catalogue of gene sy mbols for wheat：2010 supplement［J／OL］．http：∥www．shigen．nig．a(chǎn)c．jp／wheat／komugi／genes／macgene／supplement2010．pdf［2011－04－19］．

［5］ 楊文香，劉大群．小麥抗葉銹基因的定位及分子標記研究進展［J］．中國農(nóng)業(yè)科學，2004，37（1）：65－71．

［6］ 閆紅飛，楊文香，陳云芳，等．偃麥草屬E染色體組特異SCAR標記對Lr19的特異性和穩(wěn)定性研究［J］．植物病理學報，2009，39（1）：76－81．

［7］ Gupta S K，Char pe A，Koul S P，et al．Develop ment and validation of molecular mar kers linked to an Aegilops u mbell ul ataderived leaf－r ust－resistance gene Lr9 for mar ker－assisted selection in bread wheat［J］．Geno me，2005，48：823－830．

［8］ Schacher mayr G，Siedler H，Gale M D，et al．Identification and localization of molecular mar kers linked to the Lr9 leaf rust resistance gene of wheat［J］．Theoretical and Applied Genetics，1994，88：110－115．

［9］ Gupta S K，Char pe A，Prabhu K V，et al．Identification and validation of molecular mar kers linked to the leaf r ust resistance gene Lr19 in wheat［J］．Theoretical and Applied Genetics，2006，113：1027－1036．

［10］Prins R，Gr oenewald J，Marais G，et al．AFLP and STS tagging of Lr19，a gene conferring resistance to leaf r ust in wheat［J］．Theoretical and Applied Genetics，2001，103（4）：618－624．

［11］Neu C，Stein N，Keller B．Genetic mapping of the Lr20－Pm1 resistance locus reveals suppressed recombination on chromoso me ar m 7 AL in hexaploid wheat［J］．Geno me，2002，45：737－744．

［12］Chai J F，Zhou R H，Jia J Z，et al．Develop ment and application of a new co－do minant PCR mar ker for detecting 1BL·1RS wheat－rye chro mosome translocations［J］．Plant Breeding，2006，125：302－304．

［13］Froid mont D．A co－do minant mar ker for the 1BL／1 RS wheatr ye translocation via multiplex PCR［J］．Jour nal of Cereal Sci－ence，1998，27：229－232．

［14］Mago R，Spiel meyer W，Lawrence G，et al．Identification and mapping of molecular mar kers linked to r ust resistance genes located on chr o moso me 1RS of r ye using wheat－rye translocation lines［J］．Theoretical and Applied Genetics，2002，104（8）：1317－1324．

［15］Cha mbefian J S，Gibbs R A，Ranier J E，et al．Deletion screening of the Duchenne muscular dystr ophy locus via multiplex DNA amplification［J］．Nucleic Acids Research，1988，16：1141－1156

［16］Vandevelde C．Fast mutiplex poly merase chain reaction on boiled clinical sa mples for rapid viral diagnosis［J］．Jour nal of Virological Methods，1990，30：215－228．

［17］Procunier J D．Disease resistance．Leaf rust resistance Lr29－Lr25．wheat CAP［EB／OL］．http：∥maswheat．ucdavis．edu／protocols／Lr29／index．ht m［2011－04－19］．

［18］Su míkováT，HanzalováA．Multiplex PCR assay to detect r ust resistance genes Lr 26 and Lr 37 in Wheat［J］．Czech J Genet Plant Breed，2010，46（2）：85－89．

［19］孟顥光，曹麗華，宗憲昭，等．小麥條銹菌和葉銹菌的復合PCR檢測［J］．河南農(nóng)業(yè)大學學報，2010，44（1）：74－77，90．

［20］Ma W，Zhang W，Gale K R．Multiplex－PCR typing of high molecular weight glutenin alleles in wheat［J］．Euphytica，2003，134（1）：51－60．

［21］陳萬權，秦慶明．國際上已知小麥抗葉銹病基因在中國的可利用性研究［J］．中國農(nóng)業(yè)科學，2002，35（7）：794－801．

［22］Gill K S，Lubbers E L，Raupp W J，et al．A genetic linkage map of Triticu m tauschii（DD）and its relationship to the D genome of bread wheat（AABBDD）［J］．Genome，1991，34：362－374．

［23］周陽，何中虎，張改生，等．1BL／1 RS易位系在我國小麥育種中的應用［J］．作物學報，2004，30（6）：531－535．

［24］郭愛國，劉穎超，朱之堉．河北省21個小麥品種抗葉銹基因的推導［J］．河北農(nóng)業(yè)大學學報，1993，16（1）：59，62．

［25］袁軍海，劉太國，陳萬權．中國47個小麥新品種（系）苗期抗葉銹基因推導［J］．中國農(nóng)業(yè)科學，2007，40（9）：1925－1935．

［26］陳萬權，秦慶明，陳揚林，等．我國40個小麥品種抗葉銹性研究［J］．植物病理學報，2001，31（1）：16－25．

［27］Li Z F，Xia X C，He Z H，et al．Seedling and slow r usting resistance to leaf r ust in Chinese wheat cultivars［J］．Plant Disease，2010，94：45－53．

［28］廖文孝．抗條銹病冬小麥新品種中梁17的選育特點及育種展望［J］．麥類作物，1997，17（5）：21－22，45．

［29］劉志勇，王曉玲，倪中福，等．小麥抗葉銹基因Lr9、Lr24的分子標記輔助選擇研究［J］．農(nóng)業(yè)生物技術學報，2000，8（1）：13－16．

［30］Ur banovich O Y，Malyshev S，Dol matovich T，et al．Identification of leaf r ust resistance genes in wheat（Triticu m aestivu m L．）cultivars using molecular mar kers［J］．Russian Jour nal of Genetics，2006，42（5）：546－554．

［31］Tyryshkin L，Gul’tyaeva E，Al pat’eva N，et al．Identification of effective leaf－r ust resistance genes in wheat（Triticu m aestivu m）using STS mar kers［J］，Russian Jour nal of Genetics．2006，42（6）：662－666．