尿足細胞標志蛋白Podocalyxin檢測在糖尿病腎臟損害程度評估中的意義

程 亮，俞偉男，洪 兵，胡 文，郝海榮

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy，DN)是糖尿病 (diabetes mellitus，DM)的主要慢性微血管并發(fā)癥之一，其具體的發(fā)病機制目前尚未完全明確。近年來的研究提示腎小球足細胞損傷和脫落在DN腎小球濾過屏障通透性的改變及蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的作用［1］。因此，檢測尿液中的足細胞及足細胞相關蛋白在DN的診斷中有重要意義。Podocalyxin(PCX)是腎小球足細胞足突頂端膜區(qū)的主要跨膜蛋白之一，也是足細胞表面特異性標志蛋白分子之一，在足細胞的成熟過程中固定于腎小球足細胞頂膜，參與維持腎小球的正常結構和濾過屏障。本研究通過檢測腎小球足細胞PCX在2型糖尿病不同腎臟病變程度的患者尿液中的水平，評估PCX檢測在DN診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年6月—2011年5月在我科病房住院的2型糖尿病患者97例，其中男45例，女52例;年齡18～70歲;均符合1999年世界衛(wèi)生組織 (WHO)糖尿病診斷標準;排除心、肝、腎臟疾病及各種感染性疾病，且近期未發(fā)生酮癥酸中毒。按照24 h尿清蛋白排泄率 (urine albumin excretion rate，UAER)及血清肌酐 (SCr)水平將2型糖尿病患者分為4組: Ⅰ組，UAER＜30 mg/24 h，SCr≤135 μmol/L，27例，平均年齡 (53.19±8.15)歲;Ⅱ組，UAER為30～299 mg/24 h，SCr≤135 μmol/L，29例，平均年齡 (53.77±7.29) 歲; Ⅲ組，UAER≥300 mg/24 h，SCr≤135 μmol/L，22例，平均年齡 (54.31±7.93)歲;Ⅳ組，UAER≥300 mg/24 h，SCr＞135 μmol/L，19例，平均年齡 (54.27±8.63)歲。另選取2011年3—5月在我院體檢的健康者30例作為正常對照組，其中男15例，女15例;平均年齡 (52.69±7.52)歲;均排除心、肝、腎等重要臟器疾病。各組受檢者的性別構成及年齡間有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 所有受檢者留取清晨第一次尿液10 ml(中段尿)，2 000 r/min離心10 min，棄上清，留取尿沉渣約200 μl，－20℃保存?zhèn)溆?，用于尿液PCX定量測定;同一天開始留取24 h尿液，用于UAER和24 h尿蛋白定量的測定。

1.2.2 尿液PCX檢測 用PCX單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的PCX與單抗結合，加入酶標抗體，形成免疫復合物連接在板上，加入酶底物TMB，出現(xiàn)藍色，加終止液，顏色變黃，用Varioskan Flash酶標檢測儀在450 nm處測定吸光度，PCX濃度與吸光度呈正比，可求出樣品中待測蛋白濃度。人足細胞標記蛋白PCX定量ELISA試劑盒由上海越研生物科技有限公司生產。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。計量資料以 ()表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。相關性分析采用Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組受檢者一般情況及觀察指標比較 與正常對照組比較，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組患者糖化血紅蛋白 (HbA1c)、PCX、UAER均顯著增加 (P＜0.05)，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組患者SCr、尿蛋白亦顯著增加 (P＜0.05);與Ⅰ組比較，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組患者糖尿病病程、PCX、UAER、尿蛋白顯著增加(P＜0.05)，Ⅳ組患者HbA1c亦顯著增加 (P＜0.05);與Ⅱ組比較，Ⅲ組、Ⅳ組患者糖尿病病程、PCX、UAER、尿蛋白均顯著增加 (P＜0.05)，Ⅳ組患者 HbA1c亦顯著增加 (P＜0.05);與Ⅲ組比較，Ⅳ組患者SCr顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 糖尿病患者24 h UAER、24 h尿蛋白定量與尿液中PCX的關系 Spearman相關性分析顯示，UAER與尿中PCX水平呈正相關 (r=0.78，P＜0.01，見圖1);尿液中PCX與尿蛋白定量亦呈正相關 (r=0.58，P＜0.01)。

3 討論

DN早期表現(xiàn)為腎小球內高壓、高灌注、高濾過，進而出現(xiàn)腎小球毛細血管袢基底膜增厚和系膜基質增多，最后發(fā)展為腎小球硬化。臨床預防DN患者腎功能惡化的關鍵在于強調早期發(fā)現(xiàn)、早期治療。然而，臨床用來評價腎臟損傷的指標如尿蛋白、SCr、微球蛋白、尿微量清蛋白等都有各自的局限性，并且這些指標受生理狀態(tài)、病理狀態(tài)、藥物以及人為因素的干擾，影響其反映腎臟損傷的真實性［2］。

足細胞是高度分化的細胞，緊貼于腎小球基膜 (glomerular basement membrane，GBM)外疏松層，參與構成GBM的濾過屏障，是各種腎小球炎癥及非炎癥損傷的靶位［3］。目前，足細胞損傷在DN發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關注，足細胞的結構和功能蛋白也逐漸被人們所認識，其中PCX作為足細胞分化成熟的標志性蛋白最早被發(fā)現(xiàn)。PCX是CD34相關性唾液黏蛋白，由腎小球內皮細胞和足細胞合成，在足細胞成熟過程中固定于足細胞頂膜［4］。PCX通過 Na/H交換調控因子(NHERF2)/ezrin復合物對足細胞骨架形成和維持起重要作用;PCX同時也是腎小球主要帶負電荷的蛋白分子，參與構成GBM的電荷屏障，通過電荷的排斥作用來維持足突間的空間結構，調節(jié)腎小球濾過屏障;并且，PCX還可阻止壁層細胞對足細胞的黏附［5］。正常腎小球通過分子屏障和電荷屏障幾乎可以完全阻止血漿清蛋白分子的濾過，而足細胞PCX表達的減少將直接導致腎小球電荷屏障的陰離子分布減少，使得清蛋白更容易濾過;并且，PCX減少也影響足細胞裂隙隔膜正常結構的維持［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，腎臟損傷后，尿液中檢測到的PCX水平增加，同時伴隨腎小球基底膜的損傷，足細胞頂膜區(qū)的PCX表達相應增加［7］。Hara等［7］研究證實腎臟損傷后，尿液中增加的PCX來源于足細胞頂膜區(qū)，而非脫落的足細胞碎片，表明尿液中PCX水平增加在腎臟損傷早期，早于足細胞從基底膜脫落以及足細胞損傷后活化的細胞膜脫落。

表1 糖尿病各組及正常對照組受檢者臨床資料比較 ()Table 1 Comparison of clinical data between DM groups and normal control group

表1 糖尿病各組及正常對照組受檢者臨床資料比較 ()Table 1 Comparison of clinical data between DM groups and normal control group

注:HbA1c=糖化血紅蛋白，SCr=血清肌酐，PCX=足細胞標志蛋白podocalyxin，UAER=尿清蛋白排泄率;與正常對照組比較，*P＜0.05;與Ⅰ組比較，△P＜0.05;與Ⅱ組比較，▲P＜0.05;與Ⅲ組比較，☆P＜0.05

組別 例數(shù) 男/女 糖尿病病史(年) HbA1c(%) SCr(μmol/L) PCX(μg/L) UAER(mg/24 h) 尿蛋白(g/24 h)正常對照組 30 15/15 0 4.91±0.46 66.1±16.0 3.1± 0.5 11.3± 5.5 0.10±0.02Ⅰ組 27 15/12 3.52±2.66 9.17±1.81* 76.2±22.3 5.8± 1.0* 18.0± 8.6* 0.11±0.03Ⅱ組 29 13/16 7.57±1.97△ 9.37±1.51* 81.0±26.1* 15.3± 4.3＊△ 167.3± 76.9＊△ 1.71±0.96＊△Ⅲ組 22 10/12 8.92±1.43△▲ 8.93±1.38* 88.7±28.1* 28.9± 9.0＊△▲ 1 297.9±424.4＊△▲ 3.19±1.32＊△▲Ⅳ組 19 10/9 9.76±1.26△▲ 8.15±1.46＊△▲ 201.6±73.5＊△▲☆ 23.3±10.6＊△▲ 1 035.6±581.2＊△▲ 2.87±1.67＊△▲F 值0.17 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 4.26 47.60 59.72 51.14 85.31 107.57 56.84 P值

圖1 糖尿病患者尿液中PCX與UAER的相關性Figure 1 Correlation between PCX and UAER in DM patients

本研究檢測糖尿病患者與健康者尿液中PCX水平，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者尿液中PCX水平顯著高于健康者，表明足細胞表面PCX丟失可能與糖尿病腎臟損傷有關。按照UAER結果，將97例糖尿病患者分為4組，發(fā)現(xiàn)Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組患者尿液PCX水平逐漸升高，說明PCX水平隨著糖尿病腎臟病變的進展有逐漸上升趨勢，提示PCX水平與糖尿病腎臟病變進展相平行;然而，本研究發(fā)現(xiàn)PCX水平在Ⅳ組即DN發(fā)展后期出現(xiàn)下降趨勢，考慮原因與DN發(fā)展后期腎小球足細胞大部分脫落，其殘存足細胞明顯減少，而且腎臟大部分腎小球硬化有關，提示PCX水平可反映腎臟損傷的程度，并可作為評估腎小球損傷的早期指標之一。UAER是反映DN早期腎損害的金標準，尿蛋白是公認的與腎臟疾病進展相關的獨立因素，尿液中PCX水平與UAER及24 h尿蛋白定量均呈正相關，表明尿液中PCX水平可以間接反映DN患者腎臟損害的進展程度。

綜上所述，腎小球足細胞表面標志蛋白PCX是判斷糖尿病患者腎臟早期損傷的一項較為理想的指標，對于早期發(fā)現(xiàn)DN、評估腎臟損傷程度、監(jiān)測DN進展和指導臨床治療有著重要的意義。

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4 Nielsen JS，Mcnagny KM.The role of podocalyxin in health and disease［J］ .Journal of the American Society of Nephrology，2009，20(8):1626－1634.

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7 Hara M，Yanagihare T，Kihara I，et al.Apical cell membranes are shed into urine from injured podocytes:a novel phenomenon of podocyte injure ［J］ .J Am Soc Nephrol，2005，16(2):408 －416.