• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    優(yōu)化的反向PCR結(jié)合TAIL-PCR法克隆棉花線粒體atpA雙拷貝基因及其側(cè)翼序列

    2012-02-26 13:20:38張曉張銳孫國清史計孟志剛周燾侯思宇梁成真于源華郭三堆
    生物工程學(xué)報 2012年1期

    張曉,張銳,孫國清,史計,孟志剛,周燾,侯思宇,梁成真,于源華,郭三堆

    1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程,北京 100081

    2 長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春 130022

    在分子生物學(xué)中,為更好地研究某個基因的結(jié)構(gòu)和功能,往往需要克隆其側(cè)翼序列。目前,已有多種技術(shù)用于擴(kuò)增基因的側(cè)翼序列[1-10]。但雙拷貝基因側(cè)翼序列的克隆仍是一個難點,因為難以確定所克隆到的序列是屬于2個拷貝中的哪一個。以往要克隆雙拷貝基因的側(cè)翼序列,往往需要建立基因文庫,然后篩選陽性克隆子進(jìn)行測序,但這種方法費時費力。

    棉花 Gossypium hirsutum L. 線粒體基因組中 atpA基因以雙拷貝形式存在,該基因編碼線粒體ATP酶復(fù)合體F1因子中的α亞基。研究發(fā)現(xiàn),atpA基因在棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育 (CMS) 系和保持系之間,以及棉花A、D基因組二倍體之間都存在明顯的限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)[11-15],這說明該基因是棉花線粒體基因組中的一個重組活躍位點,并很可能與棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)。鞏養(yǎng)倉[11]利用外源接頭介導(dǎo)PCR法克隆到哈克尼西棉 CMS系及其保持系atpA基因的部分側(cè)翼序列,但未能將棉花 atpA基因的2個拷貝區(qū)分開并加以詳細(xì)解析。

    為了克隆棉花雙拷貝 atpA基因側(cè)翼序列,我們將iPCR方法進(jìn)行優(yōu)化,并與TAIL-PCR相結(jié)合,摸索出一套高效簡便的克隆雙拷貝基因側(cè)翼序列的方法。利用該方法,我們將 atpA兩個拷貝進(jìn)行了明確區(qū)分,并且獲得的單條完整片段長達(dá)12 kb。結(jié)合實驗結(jié)果,對該方法在擴(kuò)增雙拷貝甚至多拷貝基因側(cè)翼序列中的應(yīng)用進(jìn)行了討論。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料

    陸地棉CMS不育系P30A (不育胞質(zhì))、保持系P30B (可育胞質(zhì))、三系雜交種“銀棉2號” (不育胞質(zhì))。P30A和P30B是同核異質(zhì)系;P30A與“銀棉2號”具有相同胞質(zhì)。

    1.1.2 菌株與質(zhì)粒

    大腸桿菌Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德生物技術(shù)公司;pGEMT-easy載體購自Promega公司。

    1.1.3 試劑

    Southern blotting檢測試劑盒 (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ)購自 Roche公司;尼龍膜 Hybond-N+購自Amersham公司;凝膠回收試劑盒購自 Axygene公司;限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自北京天根生物公司;LA-Taq酶購自 TaKaRa公司;DNA ladder 0331購自Fermentas公司;其他化學(xué)試劑購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司,均為分析純。引物合成及DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。iPCR和TAIL-PCR所用引物如表1所示。

    1.2 方法

    1.2.1 棉花總DNA提取

    使用改良CTAB法[16]提取棉花CMS系、保持系、雜交種葉片總DNA。

    1.2.2 棉花材料的Southern blotting分析

    Southern blotting分析參考王教瑜等[17]的方法。

    1.2.3 反向PCR (iPCR) 擴(kuò)增atpA基因EcoRⅠ限制片段

    參考Kim等[18]的方法并加以修改:取10 μg棉花總 DNA,在 200 μL酶切體系 (含 50 U EcoRⅠ酶) 中,37 ℃酶切6 h;用等體積苯酚:氯仿進(jìn)行抽提,然后用無水乙醇沉淀。將 DNA用3 U的T4 DNA連接酶在300 μL體系中16 ℃連接24 h。然后,自連產(chǎn)物用等體積苯酚:氯仿進(jìn)行抽提,然后用無水乙醇沉淀,20 μL雙蒸水重溶。從中取500 ng DNA作為模板,用LA-Taq酶在50 μL體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃,1 min;60 ℃,1 min;72 ℃,2 min,共35個循環(huán);然后72 ℃延伸10 min。后續(xù)實驗步驟參照分子克隆實驗手冊[19]。擴(kuò)增產(chǎn)物用 0.9%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,回收純化目的片段,連接到pGEMT-easy載體,然后轉(zhuǎn)化E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞,將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測序。

    1.2.4 TAIL-PCR擴(kuò)增atpA基因Hind Ⅲ限制片段

    具體方法參見文獻(xiàn)[20]。簡并引物選用AD10 (表1);采用50 μL PCR體系;從第一步 (Primary)和第二步 (Secondary) 反應(yīng)液中取 0.5 μL作為各自下一步的模板。具體反應(yīng)步驟如表2所示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 atpA基因在陸地棉CMS不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)間存在明顯的RFLPs

    以atpA核心編碼區(qū) (引物為P1和P2,圖3所示) 為探針,對陸地棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A、保持系P30B、三系雜交種“銀棉2號”進(jìn)行Southern blotting分析。結(jié)果表明,可育胞質(zhì) (保持系) 和不育胞質(zhì) (不育系和雜交種) 間存在明顯的RFLP多態(tài)性:用EcoRⅠ酶切時,可育胞質(zhì)出現(xiàn)2.2 kb和5.1 kb兩條雜交帶,而不育胞質(zhì)的雜交帶是2.2 kb和3.3 kb;用Hind Ⅲ酶切時,可育胞質(zhì)出現(xiàn)8.5 kb和11.6 kb兩條雜交帶,而不育胞質(zhì)的雜交帶是9.1 kb和11.6 kb。這表明,陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)在 atpA位點存在明顯差異。所以,如果能克隆到 atpA基因所在的EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制片段,對研究棉花胞質(zhì)雄性不育機(jī)理將很有意義。

    表1 本實驗所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

    表2 TAIL-PCR反應(yīng)條件Table 2 Cycling conditions of TAIL-PCR

    圖1 atpA基因為探針的Southern blotting雜交結(jié)果Fig. 1 Southern blotting analysis of total DNA from CMS line P30A (1), maintainer line P30B (2) and hybrid cultivar “Yinmian 2” (3) hybridized with atpA probe. Polymorphic bands between the fertile cytoplasm (2) and sterile cytoplasm (1, 3) are indicated by arrows.

    2.2 iPCR法擴(kuò)增atpA基因EcoRⅠ限制片段

    根據(jù)atpA基因編碼序列設(shè)計iPCR所需的兩對反向引物:P4和P5,P3和P6。P4和P5分別對應(yīng)atpA編碼區(qū)的258~285 bp和1 098~1 125 bp,二者相距812 bp;P3和P6分別對應(yīng)atpA編碼區(qū)的140~167 bp和1 183~1 210 bp,相距1 015 bp (表1和圖3)。首先按照常規(guī)的iPCR方法:先用P4和P5為引物,以100 ng自連產(chǎn)物為模板進(jìn)行一次iPCR (1st iPCR),然后用P3和P6為引物,以“1st iPCR”產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢式PCR (“2nd iPCR”)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在P30A中“1st iPCR”可以擴(kuò)增出相應(yīng)條帶,但亮度很弱;“2nd iPCR”時目的條帶未獲得富集反而亮度更淡。在 P30B中,“1st iPCR”可以將2.2 kb Southern blotting雜交片段所對應(yīng)的條帶擴(kuò)增出來,但無法擴(kuò)增出5.1 kb雜交片段所對應(yīng)的條帶;“2nd iPCR”時目的條帶未獲得富集反而亮度更淡 (圖 2B)。然后,我們參照Kim等的方法[18],將自連條件改為37 ℃,2 h,PCR模板量增大到500 ng進(jìn)行iPCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以將圖2A中雜交片段所對應(yīng)的條帶都擴(kuò)增出來,但是亮度偏弱 (圖 2C),很難進(jìn)行回收克隆,這說明連接時間太短會明顯降低環(huán)化效果。

    所以,我們對iPCR技術(shù)在2個方面進(jìn)行了優(yōu)化,以保證通過一次PCR反應(yīng)就能獲得足夠的目的產(chǎn)物。一是自連時間延長到 24 h以上(16 ℃),以獲得足夠的目的環(huán)化 DNA;二是將PCR的起始模板量增大到500 ng,以保證目標(biāo)產(chǎn)物獲得高效擴(kuò)增。結(jié)果從不育胞質(zhì)線粒體基因組中擴(kuò)增出1.2 kb和2.3 kb兩條帶,分別對應(yīng)2.2 kb和3.3 kb EcoRⅠ限制片段;從可育胞質(zhì)線粒體基因組中擴(kuò)增出1.2 kb和4.1 kb兩條帶,分別對應(yīng)2.2 kb和5.1 kb EcoRⅠ限制片段 (圖2 D)。

    將上述片段分別克隆測序后與 atpA基因核心保守序列進(jìn)行拼接還原,發(fā)現(xiàn) atpA基因在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)線粒體基因組中各有兩個不同的拷貝,如圖3所示。

    可育胞質(zhì)中2條EcoRⅠ限制片段的長度是2 225 bp和5 083 bp,分別命名為N-1和N-2,二者5′端的EcoRⅠ位點相同,都是位于atpA基因編碼序列的第4 bp處 (ATGG AATTC)。N-1中含有完整atpA基因 (需要加上EcoRⅠ酶切位點上游的4個堿基ATGG),長度1 524 bp,編碼507 aa。N-2中含有截短型atpA基因,截斷位點位于編碼區(qū)第1 352 bp處。不育胞質(zhì)中相應(yīng)的兩條EcoRⅠ限制片段分別命名為S-1 (2 194 bp)和S-2 (3 297 bp)。S-1中含有完整atpA基因;S-2中含有3′截短型基因,截斷位點位于編碼區(qū)第1 336 bp處。

    iPCR結(jié)果中,可育胞質(zhì)除1.2 kb和4.1 kb兩條目的帶之外,還存在一條 2.5 kb和一條0.3 kb的條帶。克隆測序結(jié)果表明,二者分別由N-2中3 599 bp處 (GAATT T) 和1 327 bp處(A AATTC) 的 EcoRⅠ星號活性產(chǎn)生。同樣,不育胞質(zhì)0.35 kb條帶是由S-2中1 369 bp處(GAATT T) 的星號活性產(chǎn)生。

    為驗證所克隆到的 EcoRⅠ限制片段是否正確,我們根據(jù)片段兩端序列設(shè)計引物:P7結(jié)合P8擴(kuò)增N-1和S-1,P7結(jié)合P9和P10來分別擴(kuò)增 N-2和 S-2。結(jié)果擴(kuò)增出與 Southern blotting結(jié)果相符的條帶 (圖4)。證明iPCR法成功將棉花線粒體atpA基因2個不同拷貝進(jìn)行正確區(qū)分。

    2.3 TAIL-PCR擴(kuò)增atpA Hind Ⅲ限制片段

    atpA基因EcoR Ⅰ限制片段的大小在2.2~ 5.1 kb之間,Hind Ⅲ限制片段的大小在8.5~11.6 kb之間,這說明前者總體上只是后者的一部分。為進(jìn)一步解析后者的多態(tài)性,我們在前者的基礎(chǔ)上,采用TAIL-PCR方法,進(jìn)一步克隆atpA的側(cè)翼序列。分析發(fā)現(xiàn),前者4條片段中只在N-2的第4 143 bp處發(fā)現(xiàn)一個Hind Ⅲ位點。所以,要獲得后者的4條片段,需要以前者片段為核心,分別向上、下游進(jìn)行基因組步移 (TAIL-PCR),理論上共需要向7個方向進(jìn)行,即:N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游和N-1、S-1、S-2片段的3′下游。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)4條EcoR Ⅰ限制片段的5′末端都是相同的,且先前對atpA基因 5′上游進(jìn)行TAIL-PCR時發(fā)現(xiàn),兩種胞質(zhì)TAIL-PCR擴(kuò)增條帶是相同的,這說明兩種胞質(zhì)atpA基因的 5′上游序列基本一致。所以,“N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游”這四者的基因組步移工作可以簡化成其中之一。同樣,“N-1、S-1片段的3′下游”這兩者的基因組步移工作也簡化成其中之一。這樣,7個步移任務(wù)簡化成 3個:S-1片段的 5′上游和 3′下游、S-2片段的3′下游。

    圖2 atpA基因的Southern blotting (EcoR Ⅰ酶切) 及反向PCR結(jié)果Fig. 2 Southern blotting and iPCR results of atpA gene. (A) Southern blotting analysis of atpA probe (EcoR I digested). (B, C, D) Results of iPCR with atpA-specific primer pairs. M: DNA marker; S: P30A; N: P30B; asterisks (*) indicate the bands resulted from star activity of EcoR I.

    圖3 陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中atpA基因EcoRⅠ限制片段示意圖Fig. 3 Schematic structures of all EcoR Ⅰ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm. The atpA coding sequences are indicated by gray boxes. The 3′ identical noncoding regions in N-1 and S-1 are represented by open bars. The deletion of the sequences at the SSR loci located downstream of the full-length atpA gene in S-1 is shown in hatched bars. The truncated regions of N-2 and S-2 are indicated by different cross-hatched bars. The 3′identical regions in N-2 and S-2 following the truncated regions are represented by hatched bars. P1 and P2 indicate the primers used for amplifying the core sequence of atpA for Southern blotting. P3-P6 indicate the primers used for inverse PCR. P7-P10 indicate the primer used for amplifying the EcoR Ⅰ restriction fragments ofatpA. Pentagrams indicate the sites that show star activity of EcoRⅠ.

    圖4 克隆片段的PCR鑒定Fig. 4 Identification of the cloning fragments by PCR. M: generuler 0331 marker; four primer pairs (P7/P8, P7/P8, P7/P10, and P7/P9) were used to amplify fragments of S-1, N-1, S-2, and N-2, respectively.

    2.3.1 atpA基因5′上游區(qū)的基因組步移

    我們以P30A總DNA為模板,向atpA 5′上游進(jìn)行了兩輪 TAIL-PCR (圖 5A),第Ⅰ輪TAIL-PCR的3步反應(yīng)中使用的特異引物分別為R1、R2、R3;第Ⅱ輪使用的引物分別為R4、R5、R6 (表1,圖6)。通過兩輪PCR反應(yīng),共獲得了4 837 bp的側(cè)翼序列,在atpA起始密碼子5′上游4 351 bp處發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ酶切位點。

    為驗證這段4 351 bp序列是否為4個片段(N-1、S-1、N-2、S-2) 所共有,我們在該序列的5′端設(shè)計引物P11,在全長atpA編碼區(qū)3′末端設(shè)計引物P12,在N-2和S-2 atpA編碼區(qū)截短位點后分別設(shè)計引物P13 和P14 (表1,圖6),分別以P30A或P30B總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了與預(yù)期相符的條帶 (數(shù)據(jù)未顯示),測序結(jié)果證明該序列是4個片段所共有。

    2.3.2 atpA全長拷貝3′下游區(qū)的基因組步移

    以P30A總DNA為模板,向S-1 3′下游進(jìn)行了兩輪TAIL-PCR (圖5 B),兩輪反應(yīng)所使用的特異引物分別是F1、F2、F3; F4、F5、F6 (表1,圖6)。結(jié)果共獲得5 509 bp側(cè)翼序列,其中在S-1下游5 109 bp處發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ位點。為驗證所獲序列是否正確,我們在全長 atpA編碼區(qū)3′末端設(shè)計引物P15,在5 509 bp序列3′端設(shè)計引物P16,分別以P30A或P30B總DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,結(jié)果獲得了與預(yù)期相符的條帶(數(shù)據(jù)未顯示),測序結(jié)果證明該序列是S-1和N-1所共有。

    2.3.3 不育胞質(zhì)截短型 atpA拷貝 (S-2) 3′下游區(qū)的基因組步移

    以P30A總DNA為模板,以SF1、SF2、SF3 (表1,圖6) 為特異引物,向S-2下游進(jìn)行了一輪TAIL-PCR (圖5 C),獲得了3 369 bp側(cè)翼序列,其中在第1 482 bp處,發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ位點。為驗證正確與否,我們在S-2 atpA編碼區(qū)截短位點及所獲序列 3′末端處分別設(shè)計引物 P17和 P18 (表1,圖6),以P30A總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果獲得了與預(yù)期相符的條帶 (圖片未顯示)。

    圖5 不育胞質(zhì)atpA基因側(cè)翼序列 TAIL-PCR結(jié)果Fig. 5 TAIL-PCR results of flanking sequences of atpA in CMS line. (A) TAIL-PCR results of 5′ flanking sequences of atpA in CMS line. (B) TAIL-PCR results of 3′ flanking sequences of intact atpA gene in CMS line. (C) TAIL-PCR results of 3′flanking sequences of truncated atpA gene in CMS line. M: generuler 0331 marker; 1, 2, and 3 indicate the primary, secondary and tertiary reaction of TAIL-PCR (Table 2); I and II indicate the first and second round of TAIL-PCR.

    圖6 棉花可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中atpA基因Hind Ⅲ限制片段示意圖Fig. 6 Schematic structures of all Hind Ⅲ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm of cotton. The 5′ identical regions in N-1, N-2, S-1 and S-2 are represented by dotted bars. The 3′ identical regions in N-1 and S-1 following the atpA coding regions are represented by open bars. The differential sequences near 3′ Hind Ⅲ sites in N-2 and S-2 are indicated by different hatched bars. F1-F6, R1-R6, SF1-SF3 indicate the primers used for TAIL-PCR. P11-P14 indicate the primers used for amplifying 5′ flanking and coding regions of atpA; P15-P18 indicate the primers used for amplifying 3′ flanking regions of atpA.

    通過以上TAIL-PCR反應(yīng),獲得了棉花線粒體atpA基因EcoR Ⅰ與Hind Ⅲ酶切位點之間的序列 (圖6),發(fā)現(xiàn)了兩種胞質(zhì)間新的差異序列,并確定了可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中兩條Hind Ⅲ限制片段長度分別是11 689 bp和8 501 bp;11 658 bp和9 139 bp。

    綜上所述,通過iPCR和TAIL-PCR相結(jié)合的方法,我們獲得了陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)atpA基因所有的EcoR Ⅰ限制片段和Hind Ⅲ限制片段,將該基因的2個拷貝進(jìn)行了明確區(qū)分,確定了導(dǎo)致RFLP多態(tài)性的序列,在兩種胞質(zhì)中各獲得了超過20 kb的線粒體DNA序列,這些序列將有助于研究棉花 CMS機(jī)理及開發(fā) CMS相關(guān)分子標(biāo)記。

    3 討論

    通過優(yōu)化的iPCR和TAIL-PCR相結(jié)合的方法,我們獲得了陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)線粒體雙拷貝 atpA基因每個拷貝各自的側(cè)翼序列,證明可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中各有一個全長拷貝和一個3′截短型拷貝,但3′截斷的位置不同。分析發(fā)現(xiàn),在atpA編碼區(qū)存在一個BamH Ⅰ位點(圖3),這解釋了為何在BamH Ⅰ酶切產(chǎn)物中atpA顯示出4條雜交條帶[14]。將我們的結(jié)果與鞏養(yǎng)倉的結(jié)果[11]進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),鞏養(yǎng)倉所獲得的 atpA側(cè)翼序列屬于 3′截短型拷貝。iPCR方法具有較高的靈敏性,我們不只擴(kuò)增出目的條帶,同時也擴(kuò)增出由 EcoRⅠ酶星號活性所產(chǎn)生的條帶。我們在對atpA基因進(jìn)行Southern blotting實驗過程中發(fā)現(xiàn),如果酶切產(chǎn)物上樣量較大,就很容易出現(xiàn)一些弱雜交帶。通過iPCR方法便明確了這些弱雜交帶通常是由內(nèi)切酶的星號活性產(chǎn)生的。所以,iPCR技術(shù)還可以用來鑒別某個基因Southern blotting的雜交信號中哪些是真拷貝,哪些是假拷貝。

    iPCR在擴(kuò)增基因側(cè)翼序列方面的優(yōu)勢就是它可以通過一個PCR反應(yīng)同時擴(kuò)增出5′和3′側(cè)翼序列,并且它可以在一個反應(yīng)中擴(kuò)增出多拷貝基因的側(cè)翼序列并加以區(qū)分,這是其他染色體步移方法很難做到的。傳統(tǒng)的iPCR需要連續(xù)進(jìn)行二步PCR反應(yīng),我們用一步PCR就擴(kuò)增出信號很強(qiáng)的條帶,關(guān)鍵因素之一就是加大iPCR反應(yīng)的起始模板量,本實驗所用的模板量在500 ng以上。自連效率是iPCR成功的關(guān)鍵因素,由于連接體系中要求DNA濃度不能太高,為獲得產(chǎn)量較高的自連產(chǎn)物,需要適當(dāng)加大自連體系,并延長連接時間。我們利用優(yōu)化的 iPCR方法還成功克隆到棉花線粒體atp9、nad6、nad7基因的側(cè)翼序列 (未發(fā)表),表明該方法重復(fù)性較好。利用獲得的差異序列,我們已將棉花可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)之間的RFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR和SSR標(biāo)記,說明該方法在分子標(biāo)記開發(fā)中也具有很大的潛力。

    從圖2可看出,優(yōu)化后的iPCR法不僅可以擴(kuò)增出目的條帶,而且可以將星號活性位點產(chǎn)生的片段也擴(kuò)增出來:在P30A中,共擴(kuò)增出了3條帶;在P30B中,共擴(kuò)增出了4條帶。這說明只要酶切產(chǎn)生的線性片段具有互補的粘性末端,并且長度不是過長 (超過5 kb),就可以自連環(huán)化并進(jìn)而被有效擴(kuò)增。所以,優(yōu)化后的iPCR方法不僅可以克隆雙拷貝基因的側(cè)翼序列,而且也可以擴(kuò)增多拷貝基因的側(cè)翼序列。

    iPCR法對于片段自連效果要求高,如果一個限制片段很長,就很難有效連接并擴(kuò)增。一般來說,在進(jìn)行iPCR反應(yīng)之前,先要進(jìn)行Southern blotting分析,以確定一種能獲得合適長度雜交片段的限制性內(nèi)切酶。棉花atpA/EcoRⅠ限制片段的大小是2.2~5.1 kb,長度比較合適。但是Hind Ⅲ限制片段長達(dá)11.7 kb,需要借助TAIL-PCR方法。TAIL-PCR方法不受限制片段長度的束縛,只要控制好方向,它理論上可以無限地往側(cè)翼方向擴(kuò)增延伸。在進(jìn)行TAIL-PCR實驗時,我們使用了LA-Taq酶,該酶具有很強(qiáng)的擴(kuò)增能力,我們進(jìn)行了多輪TAIL-PCR反應(yīng),基本上每輪都能獲得2~3 kb的目的條帶。

    [1] Ochman H, Ajioka JW, Garza D, et al. Inverse polymerase chain reaction. Nat Biotechnol, 1990, 8(8): 759?760.

    [2] Liu YG, Whittier RF. Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics, 1995, 25(3): 674?681.

    [3] Shyamala V, Ames GFL. Genome walking by single-specific-primer polymerase chain reaction: SSP-PCR. Gene, 1990, 84(1): 1?8.

    [4] Jones DH, Winistorfer SC. Sequence specific generation of a DNA panhandle permits PCR amplification of unknown flanking DNA. Nucleic Acids Res, 1992, 20(3): 595?600.

    [5] Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, et al. Alu polymerase chain reaction: a method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(17): 6686?6690.

    [6] Kim YJ, Kwak CI, Gu YY, et al. Annealing control primer system for identification of differentially expressed genes on agarose gels. Biotechniques, 2004, 36(3): 424?426.

    [7] Rosenthal A, Jones DSC. Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res, 1990, 18(10): 3095?3096.

    [8] Parker JD, Rabinovitch PS, Burmer GC. Targeted gene walking polymerase chain reaction. Nucleic Acid Res, 1991, 19(11): 3055?3060.

    [9] Sarkar G, Turner RT, Bolander ME. Restriction-site PCR: a direct method of unknown sequence retrieval adjacent to a known locus by using universal primers. PCR Methods Appl, 1993, 2(4): 318?322.

    [10] Liang CZ, Zhang R, Guo SD. Progress of chromosome walking. Biotechnol Bull, 2009(10): 75?82, 87.梁成真, 張銳, 郭三堆. 染色體步移技術(shù)研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報, 2009(10): 75?82, 87.

    [11] Gong YC. Screening of mitochondrial genes associated with cytoplasmic male sterility in cotton[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2008.鞏養(yǎng)倉. 棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)線粒體基因篩選[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2008.

    [12] Feng CD, Guo JH, Nie YC, et al. Cytoplasmic-nuclear male sterility in cotton: comparative RFLP analysis of mitochondrial DNA. San Antonio: Proceedings of the Beltwide Cotton Conferences, 2000, 1: 511?512.

    [13] Wang F, Feng CD, O’Connell MA, et al. RFLP analysis of mitochondrial DNA in two cytoplasmic male sterility systems (CMS-D2 and CMS-D8) of cotton. Euphytica, 2010, 172(1): 93?99.

    [14] Small RL, Wendel JF. The mitochondrial genome of allotetraploid cotton (Gossypium L.). J Hered, 1999, 90(1): 251?253.

    [15] Wu JY, Gong YC, Cui MH, et al. Molecular characterization of cytoplasmic male sterility conditioned by Gossypium harknessii cytoplasm (CMS-D2) in upland cotton. Euphytica, 2011, 181(1): 17?29.

    [16] Huang J, Ge X, Sun M. Modified CTAB protocol using a silica matrix for isolation of plant genomic DNA. Biotechnique, 2000, 28(3): 432?434.

    [17] Wang JY, Zhang Z, Du XF, et al. Dual screening for targeted gene replacement mutant in Magnaporthe oryzae with GUS as negative marker. Chin J Biotech, 2009, 25(1): 129?138.王教瑜, 張震, 杜新法, 等. GUS為負(fù)標(biāo)記的稻瘟病菌目標(biāo)基因替換突變體雙篩選體系. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(1): 129?138.

    [18] Kim DH, Kim BD. The organization of mitochondrial atp6 gene region in male fertile and CMS lines of pepper (Capsicum annuum L.). Curr Genet, 2006, 49(1): 59?67.

    [19] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 20?25.

    [20] Liang CZ, Zhang R, Sun GQ, et al. Cloning of stress-related transcription factors gene from cotton by optimized TAIL-PCR. Cott Sci, 2010, 22(3): 195?201.梁成真, 張銳, 孫國清, 等. 優(yōu)化TAIL-PCR方法克隆棉花抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因. 棉花學(xué)報, 2010, 22(3): 195?201.

    九草在线视频观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产在线免费精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产免费视频播放在线视频| 日日撸夜夜添| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品不卡视频一区二区| 婷婷色av中文字幕| 国产在视频线精品| 国产av国产精品国产| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产免费福利视频在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 丝袜在线中文字幕| 啦啦啦啦在线视频资源| 免费av中文字幕在线| 日韩中文字幕视频在线看片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 一级毛片久久久久久久久女| 综合色丁香网| 国产成人a∨麻豆精品| 久久青草综合色| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩制服骚丝袜av| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲一区二区三区欧美精品| 波野结衣二区三区在线| 国产午夜精品一二区理论片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 啦啦啦啦在线视频资源| 成年人午夜在线观看视频| 黄色毛片三级朝国网站 | 日本黄色片子视频| 亚洲高清免费不卡视频| 日韩强制内射视频| 十分钟在线观看高清视频www | 亚州av有码| av福利片在线| 久久久久久久久久久久大奶| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产黄片美女视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 天天操日日干夜夜撸| 黄色一级大片看看| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 国产在线免费精品| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲性久久影院| 久久久欧美国产精品| 久久久精品免费免费高清| 久久久a久久爽久久v久久| 国产深夜福利视频在线观看| 香蕉精品网在线| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美3d第一页| 97精品久久久久久久久久精品| 免费观看的影片在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲欧美清纯卡通| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲情色 制服丝袜| 高清av免费在线| 2018国产大陆天天弄谢| 精品午夜福利在线看| 日韩三级伦理在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 极品人妻少妇av视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| 不卡视频在线观看欧美| 久热这里只有精品99| 在线观看人妻少妇| 少妇的逼水好多| 尾随美女入室| 午夜免费观看性视频| 少妇精品久久久久久久| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲三级黄色毛片| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| h日本视频在线播放| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产 精品1| 99热这里只有精品一区| 精品亚洲成国产av| 欧美激情国产日韩精品一区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日韩伦理黄色片| 免费观看a级毛片全部| 久久99精品国语久久久| 美女大奶头黄色视频| 全区人妻精品视频| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩欧美一区视频在线观看 | av网站免费在线观看视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产极品天堂在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产成人精品久久久久久| 一边亲一边摸免费视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产永久视频网站| 国产精品一区二区性色av| 精品国产露脸久久av麻豆| 黄色日韩在线| 亚洲中文av在线| 日本黄色日本黄色录像| 麻豆成人av视频| 午夜福利,免费看| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产成人freesex在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久婷婷青草| 久久久国产欧美日韩av| 欧美日韩av久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 一区二区三区四区激情视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美性感艳星| 我要看日韩黄色一级片| 精品久久国产蜜桃| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲av综合色区一区| 婷婷色av中文字幕| 亚洲av综合色区一区| a级毛色黄片| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品456在线播放app| 美女视频免费永久观看网站| 晚上一个人看的免费电影| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 中文字幕免费在线视频6| 内地一区二区视频在线| 涩涩av久久男人的天堂| 老女人水多毛片| 久久久a久久爽久久v久久| 观看免费一级毛片| 丁香六月天网| 午夜影院在线不卡| 午夜免费观看性视频| 国产在线男女| 中文资源天堂在线| 欧美人与善性xxx| 亚洲久久久国产精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲,欧美,日韩| 免费大片黄手机在线观看| 伦理电影大哥的女人| 大香蕉久久网| 九九在线视频观看精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩一本色道免费dvd| 国产黄色免费在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品福利在线免费观看| 日韩精品有码人妻一区| 一本色道久久久久久精品综合| 丰满乱子伦码专区| 人人澡人人妻人| 精品国产国语对白av| 一级毛片我不卡| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产亚洲一区二区精品| 久久精品国产a三级三级三级| 免费人成在线观看视频色| 久久av网站| 亚洲成人av在线免费| 久久99一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日本色播在线视频| 色吧在线观看| 国产视频首页在线观看| videossex国产| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美 日韩 精品 国产| 在线观看一区二区三区激情| 赤兔流量卡办理| 日本黄色日本黄色录像| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美三级亚洲精品| 久久99精品国语久久久| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产一区二区三区综合在线观看 | 大片免费播放器 马上看| 2021少妇久久久久久久久久久| 免费黄色在线免费观看| 久热久热在线精品观看| 成人美女网站在线观看视频| .国产精品久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 极品人妻少妇av视频| 免费av中文字幕在线| 国产高清有码在线观看视频| 女人久久www免费人成看片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲电影在线观看av| 婷婷色麻豆天堂久久| 深夜a级毛片| 精品午夜福利在线看| 久久久久久久精品精品| 在现免费观看毛片| 丝袜在线中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| 黄色欧美视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 久久免费观看电影| 视频区图区小说| 国产男女内射视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 国内精品宾馆在线| 三级国产精品片| 在线观看一区二区三区激情| 大香蕉久久网| 婷婷色麻豆天堂久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲av不卡在线观看| 另类精品久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 一个人看视频在线观看www免费| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| av福利片在线观看| 日本午夜av视频| av一本久久久久| 老司机亚洲免费影院| 中文字幕制服av| 亚洲无线观看免费| 久久久久久久久久久久大奶| 一本色道久久久久久精品综合| 六月丁香七月| 欧美 日韩 精品 国产| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av日韩在线播放| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 99久国产av精品国产电影| 国产在线一区二区三区精| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品三级大全| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲成人一二三区av| 免费人成在线观看视频色| 色网站视频免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 一级a做视频免费观看| 亚洲综合精品二区| 亚洲成人一二三区av| 男人添女人高潮全过程视频| 少妇高潮的动态图| 日日啪夜夜撸| 欧美精品国产亚洲| 国产成人a∨麻豆精品| 色视频www国产| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 热re99久久精品国产66热6| 成人美女网站在线观看视频| 看免费成人av毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 女性被躁到高潮视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久免费观看电影| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久午夜福利片| 美女视频免费永久观看网站| 国产午夜精品一二区理论片| 久久人妻熟女aⅴ| 看非洲黑人一级黄片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 简卡轻食公司| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产欧美亚洲国产| 人人妻人人澡人人看| 欧美性感艳星| 三级国产精品片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 三级国产精品欧美在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 久久久久久久久久久丰满| 亚洲性久久影院| 免费人妻精品一区二区三区视频| 黑人高潮一二区| 好男人视频免费观看在线| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲,欧美,日韩| 久久99蜜桃精品久久| 免费av中文字幕在线| 亚洲四区av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久国产网址| 久久99精品国语久久久| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av不卡在线播放| 久久婷婷青草| 国产成人精品久久久久久| 久久久久久伊人网av| 最后的刺客免费高清国语| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 制服丝袜香蕉在线| 国产精品免费大片| 大香蕉97超碰在线| 亚洲不卡免费看| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本av免费视频播放| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲综合精品二区| 久久久久久久久久久丰满| 三级经典国产精品| 亚洲天堂av无毛| 国产视频首页在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 两个人免费观看高清视频 | 一区二区三区四区激情视频| 秋霞在线观看毛片| 国产午夜精品一二区理论片| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲精品国产成人久久av| 51国产日韩欧美| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日本欧美国产在线视频| 亚洲图色成人| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲天堂av无毛| 欧美国产精品一级二级三级 | 高清视频免费观看一区二区| 日本av免费视频播放| 久久久久久久精品精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产av一区二区精品久久| 日韩av不卡免费在线播放| 成人特级av手机在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 黄色配什么色好看| 美女主播在线视频| 免费观看无遮挡的男女| 欧美日韩亚洲高清精品| 十八禁网站网址无遮挡 | av女优亚洲男人天堂| 久久这里有精品视频免费| 男人舔奶头视频| 久久影院123| 丰满饥渴人妻一区二区三| 蜜桃在线观看..| av免费观看日本| 好男人视频免费观看在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美高清成人免费视频www| 亚洲天堂av无毛| 午夜福利视频精品| 老熟女久久久| 男女免费视频国产| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| www.av在线官网国产| 亚洲国产av新网站| 高清欧美精品videossex| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久99精品国语久久久| 免费观看性生交大片5| av在线app专区| 亚洲电影在线观看av| 97在线视频观看| 妹子高潮喷水视频| 久久鲁丝午夜福利片| 久久久久久久久大av| 简卡轻食公司| 三级经典国产精品| 国产精品人妻久久久影院| 免费看av在线观看网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 高清av免费在线| 另类精品久久| 女人久久www免费人成看片| 视频区图区小说| 美女cb高潮喷水在线观看| 99久久精品一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产高清有码在线观看视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美国产精品一级二级三级 | 免费观看av网站的网址| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 91久久精品国产一区二区三区| 国产69精品久久久久777片| 国产成人精品福利久久| 亚洲自偷自拍三级| 少妇熟女欧美另类| 伦理电影大哥的女人| 国产一区二区在线观看日韩| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 热re99久久国产66热| 免费少妇av软件| 欧美精品一区二区免费开放| 午夜老司机福利剧场| 99久久精品一区二区三区| 午夜av观看不卡| 好男人视频免费观看在线| 日本欧美视频一区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日日爽夜夜爽网站| 午夜影院在线不卡| 只有这里有精品99| 最近手机中文字幕大全| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产精品专区欧美| 国产淫片久久久久久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久久久伊人网av| 少妇 在线观看| 九草在线视频观看| 日韩三级伦理在线观看| 日韩一区二区三区影片| 伦理电影大哥的女人| 久久久国产一区二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 免费观看av网站的网址| 久久6这里有精品| 中文资源天堂在线| 视频区图区小说| 三级国产精品片| 久久久久久久久久成人| 日韩大片免费观看网站| 一级av片app| 久久99一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄色视频在线播放观看不卡| 内射极品少妇av片p| 欧美国产精品一级二级三级 | 18禁在线播放成人免费| 午夜精品国产一区二区电影| 永久免费av网站大全| 国产黄片视频在线免费观看| 在线观看一区二区三区激情| 中文欧美无线码| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲国产精品专区欧美| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产熟女欧美一区二区| 18禁在线播放成人免费| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲怡红院男人天堂| 免费在线观看成人毛片| 九九在线视频观看精品| 久久影院123| 精品亚洲成a人片在线观看| av播播在线观看一区| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产在线免费精品| 丰满乱子伦码专区| 一个人免费看片子| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99精国产麻豆久久婷婷| 色视频在线一区二区三区| h视频一区二区三区| 美女国产视频在线观看| 亚洲av综合色区一区| 久久久久久久久久久久大奶| 好男人视频免费观看在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产黄片视频在线免费观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 中文在线观看免费www的网站| 欧美日韩在线观看h| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品酒店卫生间| 久久精品久久精品一区二区三区| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产亚洲91精品色在线| 自线自在国产av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产在线免费精品| 一级二级三级毛片免费看| 国产色婷婷99| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品少妇内射三级| 国产成人一区二区在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美成人午夜免费资源| 在线观看免费日韩欧美大片 | 18禁在线无遮挡免费观看视频| 人妻一区二区av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲国产精品国产精品| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产色爽女视频免费观看| 日本午夜av视频| 久久人人爽人人片av| 久久国产精品大桥未久av | 欧美一级a爱片免费观看看| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产免费福利视频在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲,欧美,日韩| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜影院在线不卡| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品人妻久久久影院| 伦精品一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99热这里只有精品一区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 天堂8中文在线网| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲电影在线观看av| av天堂久久9| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| a级毛片在线看网站| 丰满少妇做爰视频| 国产伦在线观看视频一区| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费大片18禁| av在线app专区| 最后的刺客免费高清国语| 狂野欧美激情性bbbbbb| kizo精华| 观看免费一级毛片| 精品国产露脸久久av麻豆| 97超视频在线观看视频| 成年人午夜在线观看视频| 日韩视频在线欧美| 日韩av不卡免费在线播放| 久久青草综合色| 精品久久久噜噜| 日韩欧美 国产精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 婷婷色av中文字幕| 亚洲成色77777| 国产一区亚洲一区在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 一个人看视频在线观看www免费| 成人国产麻豆网| 国产片特级美女逼逼视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲综合色惰| 久久精品久久久久久久性| 日本免费在线观看一区| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲第一av免费看| 人人妻人人澡人人看| 人妻系列 视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲av福利一区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 99九九线精品视频在线观看视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲真实伦在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美人与善性xxx| 国产精品免费大片| 国产在线一区二区三区精| 2022亚洲国产成人精品| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲成人av在线免费| 亚洲国产精品一区三区| tube8黄色片| av福利片在线| 国产视频内射| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 2022亚洲国产成人精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲久久久国产精品| 一级片'在线观看视频| 极品教师在线视频| 久久久午夜欧美精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美日本中文国产一区发布| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看|