優(yōu)化的反向PCR結(jié)合TAIL-PCR法克隆棉花線粒體atpA雙拷貝基因及其側(cè)翼序列

張曉，張銳，孫國(guó)清，史計(jì)，孟志剛，周燾，侯思宇，梁成真，于源華，郭三堆

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 國(guó)家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程，北京 100081

2 長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022

在分子生物學(xué)中，為更好地研究某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)和功能，往往需要克隆其側(cè)翼序列。目前，已有多種技術(shù)用于擴(kuò)增基因的側(cè)翼序列[1-10]。但雙拷貝基因側(cè)翼序列的克隆仍是一個(gè)難點(diǎn)，因?yàn)殡y以確定所克隆到的序列是屬于2個(gè)拷貝中的哪一個(gè)。以往要克隆雙拷貝基因的側(cè)翼序列，往往需要建立基因文庫(kù)，然后篩選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序，但這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

棉花 Gossypium hirsutum L. 線粒體基因組中 atpA基因以雙拷貝形式存在，該基因編碼線粒體ATP酶復(fù)合體F1因子中的α亞基。研究發(fā)現(xiàn)，atpA基因在棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育 (CMS) 系和保持系之間，以及棉花A、D基因組二倍體之間都存在明顯的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPs)[11-15]，這說明該基因是棉花線粒體基因組中的一個(gè)重組活躍位點(diǎn)，并很可能與棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)。鞏養(yǎng)倉(cāng)[11]利用外源接頭介導(dǎo)PCR法克隆到哈克尼西棉 CMS系及其保持系atpA基因的部分側(cè)翼序列，但未能將棉花 atpA基因的2個(gè)拷貝區(qū)分開并加以詳細(xì)解析。

為了克隆棉花雙拷貝 atpA基因側(cè)翼序列，我們將iPCR方法進(jìn)行優(yōu)化，并與TAIL-PCR相結(jié)合，摸索出一套高效簡(jiǎn)便的克隆雙拷貝基因側(cè)翼序列的方法。利用該方法，我們將 atpA兩個(gè)拷貝進(jìn)行了明確區(qū)分，并且獲得的單條完整片段長(zhǎng)達(dá)12 kb。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)該方法在擴(kuò)增雙拷貝甚至多拷貝基因側(cè)翼序列中的應(yīng)用進(jìn)行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

陸地棉CMS不育系P30A (不育胞質(zhì))、保持系P30B (可育胞質(zhì))、三系雜交種“銀棉2號(hào)” (不育胞質(zhì))。P30A和P30B是同核異質(zhì)系；P30A與“銀棉2號(hào)”具有相同胞質(zhì)。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)公司；pGEMT-easy載體購(gòu)自Promega公司。

1.1.3 試劑

Southern blotting檢測(cè)試劑盒 (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ)購(gòu)自 Roche公司；尼龍膜 Hybond-N+購(gòu)自Amersham公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自 Axygene公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京天根生物公司；LA-Taq酶購(gòu)自 TaKaRa公司；DNA ladder 0331購(gòu)自Fermentas公司；其他化學(xué)試劑購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)公司，均為分析純。引物合成及DNA測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。iPCR和TAIL-PCR所用引物如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 棉花總DNA提取

使用改良CTAB法[16]提取棉花CMS系、保持系、雜交種葉片總DNA。

1.2.2 棉花材料的Southern blotting分析

Southern blotting分析參考王教瑜等[17]的方法。

1.2.3 反向PCR (iPCR) 擴(kuò)增atpA基因EcoRⅠ限制片段

參考Kim等[18]的方法并加以修改：取10 μg棉花總 DNA，在 200 μL酶切體系 (含 50 U EcoRⅠ酶) 中，37 ℃酶切6 h；用等體積苯酚：氯仿進(jìn)行抽提，然后用無(wú)水乙醇沉淀。將 DNA用3 U的T4 DNA連接酶在300 μL體系中16 ℃連接24 h。然后，自連產(chǎn)物用等體積苯酚：氯仿進(jìn)行抽提，然后用無(wú)水乙醇沉淀，20 μL雙蒸水重溶。從中取500 ng DNA作為模板，用LA-Taq酶在50 μL體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，2 min，共35個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[19]。擴(kuò)增產(chǎn)物用 0.9%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，回收純化目的片段，連接到pGEMT-easy載體，然后轉(zhuǎn)化E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。

1.2.4 TAIL-PCR擴(kuò)增atpA基因Hind Ⅲ限制片段

具體方法參見文獻(xiàn)[20]。簡(jiǎn)并引物選用AD10 (表1)；采用50 μL PCR體系；從第一步 (Primary)和第二步 (Secondary) 反應(yīng)液中取 0.5 μL作為各自下一步的模板。具體反應(yīng)步驟如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 atpA基因在陸地棉CMS不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)間存在明顯的RFLPs

以atpA核心編碼區(qū) (引物為P1和P2，圖3所示) 為探針，對(duì)陸地棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A、保持系P30B、三系雜交種“銀棉2號(hào)”進(jìn)行Southern blotting分析。結(jié)果表明，可育胞質(zhì) (保持系) 和不育胞質(zhì) (不育系和雜交種) 間存在明顯的RFLP多態(tài)性：用EcoRⅠ酶切時(shí)，可育胞質(zhì)出現(xiàn)2.2 kb和5.1 kb兩條雜交帶，而不育胞質(zhì)的雜交帶是2.2 kb和3.3 kb；用Hind Ⅲ酶切時(shí)，可育胞質(zhì)出現(xiàn)8.5 kb和11.6 kb兩條雜交帶，而不育胞質(zhì)的雜交帶是9.1 kb和11.6 kb。這表明，陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)在 atpA位點(diǎn)存在明顯差異。所以，如果能克隆到 atpA基因所在的EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制片段，對(duì)研究棉花胞質(zhì)雄性不育機(jī)理將很有意義。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

表2 TAIL-PCR反應(yīng)條件Table 2 Cycling conditions of TAIL-PCR

圖1 atpA基因?yàn)樘结樀腟outhern blotting雜交結(jié)果Fig. 1 Southern blotting analysis of total DNA from CMS line P30A (1), maintainer line P30B (2) and hybrid cultivar “Yinmian 2” (3) hybridized with atpA probe. Polymorphic bands between the fertile cytoplasm (2) and sterile cytoplasm (1, 3) are indicated by arrows.

2.2 iPCR法擴(kuò)增atpA基因EcoRⅠ限制片段

根據(jù)atpA基因編碼序列設(shè)計(jì)iPCR所需的兩對(duì)反向引物：P4和P5，P3和P6。P4和P5分別對(duì)應(yīng)atpA編碼區(qū)的258~285 bp和1 098~1 125 bp，二者相距812 bp；P3和P6分別對(duì)應(yīng)atpA編碼區(qū)的140~167 bp和1 183~1 210 bp，相距1 015 bp (表1和圖3)。首先按照常規(guī)的iPCR方法：先用P4和P5為引物，以100 ng自連產(chǎn)物為模板進(jìn)行一次iPCR (1st iPCR)，然后用P3和P6為引物，以“1st iPCR”產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢式PCR (“2nd iPCR”)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在P30A中“1st iPCR”可以擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，但亮度很弱；“2nd iPCR”時(shí)目的條帶未獲得富集反而亮度更淡。在 P30B中，“1st iPCR”可以將2.2 kb Southern blotting雜交片段所對(duì)應(yīng)的條帶擴(kuò)增出來，但無(wú)法擴(kuò)增出5.1 kb雜交片段所對(duì)應(yīng)的條帶；“2nd iPCR”時(shí)目的條帶未獲得富集反而亮度更淡 (圖 2B)。然后，我們參照Kim等的方法[18]，將自連條件改為37 ℃，2 h，PCR模板量增大到500 ng進(jìn)行iPCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以將圖2A中雜交片段所對(duì)應(yīng)的條帶都擴(kuò)增出來，但是亮度偏弱 (圖 2C)，很難進(jìn)行回收克隆，這說明連接時(shí)間太短會(huì)明顯降低環(huán)化效果。

所以，我們對(duì)iPCR技術(shù)在2個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化，以保證通過一次PCR反應(yīng)就能獲得足夠的目的產(chǎn)物。一是自連時(shí)間延長(zhǎng)到 24 h以上(16 ℃)，以獲得足夠的目的環(huán)化 DNA；二是將PCR的起始模板量增大到500 ng，以保證目標(biāo)產(chǎn)物獲得高效擴(kuò)增。結(jié)果從不育胞質(zhì)線粒體基因組中擴(kuò)增出1.2 kb和2.3 kb兩條帶，分別對(duì)應(yīng)2.2 kb和3.3 kb EcoRⅠ限制片段；從可育胞質(zhì)線粒體基因組中擴(kuò)增出1.2 kb和4.1 kb兩條帶，分別對(duì)應(yīng)2.2 kb和5.1 kb EcoRⅠ限制片段 (圖2 D)。

將上述片段分別克隆測(cè)序后與 atpA基因核心保守序列進(jìn)行拼接還原，發(fā)現(xiàn) atpA基因在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)線粒體基因組中各有兩個(gè)不同的拷貝，如圖3所示。

可育胞質(zhì)中2條EcoRⅠ限制片段的長(zhǎng)度是2 225 bp和5 083 bp，分別命名為N-1和N-2，二者5′端的EcoRⅠ位點(diǎn)相同，都是位于atpA基因編碼序列的第4 bp處 (ATGG AATTC)。N-1中含有完整atpA基因 (需要加上EcoRⅠ酶切位點(diǎn)上游的4個(gè)堿基ATGG)，長(zhǎng)度1 524 bp，編碼507 aa。N-2中含有截短型atpA基因，截?cái)辔稽c(diǎn)位于編碼區(qū)第1 352 bp處。不育胞質(zhì)中相應(yīng)的兩條EcoRⅠ限制片段分別命名為S-1 (2 194 bp)和S-2 (3 297 bp)。S-1中含有完整atpA基因；S-2中含有3′截短型基因，截?cái)辔稽c(diǎn)位于編碼區(qū)第1 336 bp處。

iPCR結(jié)果中，可育胞質(zhì)除1.2 kb和4.1 kb兩條目的帶之外，還存在一條 2.5 kb和一條0.3 kb的條帶?？寺y(cè)序結(jié)果表明，二者分別由N-2中3 599 bp處 (GAATT T) 和1 327 bp處(A AATTC) 的 EcoRⅠ星號(hào)活性產(chǎn)生。同樣，不育胞質(zhì)0.35 kb條帶是由S-2中1 369 bp處(GAATT T) 的星號(hào)活性產(chǎn)生。

為驗(yàn)證所克隆到的 EcoRⅠ限制片段是否正確，我們根據(jù)片段兩端序列設(shè)計(jì)引物：P7結(jié)合P8擴(kuò)增N-1和S-1，P7結(jié)合P9和P10來分別擴(kuò)增 N-2和 S-2。結(jié)果擴(kuò)增出與 Southern blotting結(jié)果相符的條帶 (圖4)。證明iPCR法成功將棉花線粒體atpA基因2個(gè)不同拷貝進(jìn)行正確區(qū)分。

2.3 TAIL-PCR擴(kuò)增atpA Hind Ⅲ限制片段

atpA基因EcoR Ⅰ限制片段的大小在2.2~ 5.1 kb之間，Hind Ⅲ限制片段的大小在8.5~11.6 kb之間，這說明前者總體上只是后者的一部分。為進(jìn)一步解析后者的多態(tài)性，我們?cè)谇罢叩幕A(chǔ)上，采用TAIL-PCR方法，進(jìn)一步克隆atpA的側(cè)翼序列。分析發(fā)現(xiàn)，前者4條片段中只在N-2的第4 143 bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)Hind Ⅲ位點(diǎn)。所以，要獲得后者的4條片段，需要以前者片段為核心，分別向上、下游進(jìn)行基因組步移 (TAIL-PCR)，理論上共需要向7個(gè)方向進(jìn)行，即：N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游和N-1、S-1、S-2片段的3′下游。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)4條EcoR Ⅰ限制片段的5′末端都是相同的，且先前對(duì)atpA基因 5′上游進(jìn)行TAIL-PCR時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩種胞質(zhì)TAIL-PCR擴(kuò)增條帶是相同的，這說明兩種胞質(zhì)atpA基因的 5′上游序列基本一致。所以，“N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游”這四者的基因組步移工作可以簡(jiǎn)化成其中之一。同樣，“N-1、S-1片段的3′下游”這兩者的基因組步移工作也簡(jiǎn)化成其中之一。這樣，7個(gè)步移任務(wù)簡(jiǎn)化成 3個(gè)：S-1片段的 5′上游和 3′下游、S-2片段的3′下游。

圖2 atpA基因的Southern blotting (EcoR Ⅰ酶切) 及反向PCR結(jié)果Fig. 2 Southern blotting and iPCR results of atpA gene. (A) Southern blotting analysis of atpA probe (EcoR I digested). (B, C, D) Results of iPCR with atpA-specific primer pairs. M: DNA marker; S: P30A; N: P30B; asterisks (*) indicate the bands resulted from star activity of EcoR I.

圖3 陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中atpA基因EcoRⅠ限制片段示意圖Fig. 3 Schematic structures of all EcoR Ⅰ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm. The atpA coding sequences are indicated by gray boxes. The 3′ identical noncoding regions in N-1 and S-1 are represented by open bars. The deletion of the sequences at the SSR loci located downstream of the full-length atpA gene in S-1 is shown in hatched bars. The truncated regions of N-2 and S-2 are indicated by different cross-hatched bars. The 3′identical regions in N-2 and S-2 following the truncated regions are represented by hatched bars. P1 and P2 indicate the primers used for amplifying the core sequence of atpA for Southern blotting. P3-P6 indicate the primers used for inverse PCR. P7-P10 indicate the primer used for amplifying the EcoR Ⅰ restriction fragments ofatpA. Pentagrams indicate the sites that show star activity of EcoRⅠ.

圖4 克隆片段的PCR鑒定Fig. 4 Identification of the cloning fragments by PCR. M: generuler 0331 marker; four primer pairs (P7/P8, P7/P8, P7/P10, and P7/P9) were used to amplify fragments of S-1, N-1, S-2, and N-2, respectively.

2.3.1 atpA基因5′上游區(qū)的基因組步移

我們以P30A總DNA為模板，向atpA 5′上游進(jìn)行了兩輪 TAIL-PCR (圖 5A)，第Ⅰ輪TAIL-PCR的3步反應(yīng)中使用的特異引物分別為R1、R2、R3；第Ⅱ輪使用的引物分別為R4、R5、R6 (表1，圖6)。通過兩輪PCR反應(yīng)，共獲得了4 837 bp的側(cè)翼序列，在atpA起始密碼子5′上游4 351 bp處發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

為驗(yàn)證這段4 351 bp序列是否為4個(gè)片段(N-1、S-1、N-2、S-2) 所共有，我們?cè)谠撔蛄械?′端設(shè)計(jì)引物P11，在全長(zhǎng)atpA編碼區(qū)3′末端設(shè)計(jì)引物P12，在N-2和S-2 atpA編碼區(qū)截短位點(diǎn)后分別設(shè)計(jì)引物P13 和P14 (表1，圖6)，分別以P30A或P30B總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期相符的條帶 (數(shù)據(jù)未顯示)，測(cè)序結(jié)果證明該序列是4個(gè)片段所共有。

2.3.2 atpA全長(zhǎng)拷貝3′下游區(qū)的基因組步移

以P30A總DNA為模板，向S-1 3′下游進(jìn)行了兩輪TAIL-PCR (圖5 B)，兩輪反應(yīng)所使用的特異引物分別是F1、F2、F3; F4、F5、F6 (表1，圖6)。結(jié)果共獲得5 509 bp側(cè)翼序列，其中在S-1下游5 109 bp處發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ位點(diǎn)。為驗(yàn)證所獲序列是否正確，我們?cè)谌L(zhǎng) atpA編碼區(qū)3′末端設(shè)計(jì)引物P15，在5 509 bp序列3′端設(shè)計(jì)引物P16，分別以P30A或P30B總DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得了與預(yù)期相符的條帶(數(shù)據(jù)未顯示)，測(cè)序結(jié)果證明該序列是S-1和N-1所共有。

2.3.3 不育胞質(zhì)截短型 atpA拷貝 (S-2) 3′下游區(qū)的基因組步移

以P30A總DNA為模板，以SF1、SF2、SF3 (表1，圖6) 為特異引物，向S-2下游進(jìn)行了一輪TAIL-PCR (圖5 C)，獲得了3 369 bp側(cè)翼序列，其中在第1 482 bp處，發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ位點(diǎn)。為驗(yàn)證正確與否，我們?cè)赟-2 atpA編碼區(qū)截短位點(diǎn)及所獲序列 3′末端處分別設(shè)計(jì)引物 P17和 P18 (表1，圖6)，以P30A總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得了與預(yù)期相符的條帶 (圖片未顯示)。

圖5 不育胞質(zhì)atpA基因側(cè)翼序列 TAIL-PCR結(jié)果Fig. 5 TAIL-PCR results of flanking sequences of atpA in CMS line. (A) TAIL-PCR results of 5′ flanking sequences of atpA in CMS line. (B) TAIL-PCR results of 3′ flanking sequences of intact atpA gene in CMS line. (C) TAIL-PCR results of 3′flanking sequences of truncated atpA gene in CMS line. M: generuler 0331 marker; 1, 2, and 3 indicate the primary, secondary and tertiary reaction of TAIL-PCR (Table 2); I and II indicate the first and second round of TAIL-PCR.

圖6 棉花可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中atpA基因Hind Ⅲ限制片段示意圖Fig. 6 Schematic structures of all Hind Ⅲ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm of cotton. The 5′ identical regions in N-1, N-2, S-1 and S-2 are represented by dotted bars. The 3′ identical regions in N-1 and S-1 following the atpA coding regions are represented by open bars. The differential sequences near 3′ Hind Ⅲ sites in N-2 and S-2 are indicated by different hatched bars. F1-F6, R1-R6, SF1-SF3 indicate the primers used for TAIL-PCR. P11-P14 indicate the primers used for amplifying 5′ flanking and coding regions of atpA; P15-P18 indicate the primers used for amplifying 3′ flanking regions of atpA.

通過以上TAIL-PCR反應(yīng)，獲得了棉花線粒體atpA基因EcoR Ⅰ與Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)之間的序列 (圖6)，發(fā)現(xiàn)了兩種胞質(zhì)間新的差異序列，并確定了可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中兩條Hind Ⅲ限制片段長(zhǎng)度分別是11 689 bp和8 501 bp；11 658 bp和9 139 bp。

綜上所述，通過iPCR和TAIL-PCR相結(jié)合的方法，我們獲得了陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)atpA基因所有的EcoR Ⅰ限制片段和Hind Ⅲ限制片段，將該基因的2個(gè)拷貝進(jìn)行了明確區(qū)分，確定了導(dǎo)致RFLP多態(tài)性的序列，在兩種胞質(zhì)中各獲得了超過20 kb的線粒體DNA序列，這些序列將有助于研究棉花 CMS機(jī)理及開發(fā) CMS相關(guān)分子標(biāo)記。

3 討論

通過優(yōu)化的iPCR和TAIL-PCR相結(jié)合的方法，我們獲得了陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)線粒體雙拷貝 atpA基因每個(gè)拷貝各自的側(cè)翼序列，證明可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中各有一個(gè)全長(zhǎng)拷貝和一個(gè)3′截短型拷貝，但3′截?cái)嗟奈恢貌煌?。分析發(fā)現(xiàn)，在atpA編碼區(qū)存在一個(gè)BamH Ⅰ位點(diǎn)(圖3)，這解釋了為何在BamH Ⅰ酶切產(chǎn)物中atpA顯示出4條雜交條帶[14]。將我們的結(jié)果與鞏養(yǎng)倉(cāng)的結(jié)果[11]進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，鞏養(yǎng)倉(cāng)所獲得的 atpA側(cè)翼序列屬于 3′截短型拷貝。iPCR方法具有較高的靈敏性，我們不只擴(kuò)增出目的條帶，同時(shí)也擴(kuò)增出由 EcoRⅠ酶星號(hào)活性所產(chǎn)生的條帶。我們?cè)趯?duì)atpA基因進(jìn)行Southern blotting實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，如果酶切產(chǎn)物上樣量較大，就很容易出現(xiàn)一些弱雜交帶。通過iPCR方法便明確了這些弱雜交帶通常是由內(nèi)切酶的星號(hào)活性產(chǎn)生的。所以，iPCR技術(shù)還可以用來鑒別某個(gè)基因Southern blotting的雜交信號(hào)中哪些是真拷貝，哪些是假拷貝。

iPCR在擴(kuò)增基因側(cè)翼序列方面的優(yōu)勢(shì)就是它可以通過一個(gè)PCR反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增出5′和3′側(cè)翼序列，并且它可以在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增出多拷貝基因的側(cè)翼序列并加以區(qū)分，這是其他染色體步移方法很難做到的。傳統(tǒng)的iPCR需要連續(xù)進(jìn)行二步PCR反應(yīng)，我們用一步PCR就擴(kuò)增出信號(hào)很強(qiáng)的條帶，關(guān)鍵因素之一就是加大iPCR反應(yīng)的起始模板量，本實(shí)驗(yàn)所用的模板量在500 ng以上。自連效率是iPCR成功的關(guān)鍵因素，由于連接體系中要求DNA濃度不能太高，為獲得產(chǎn)量較高的自連產(chǎn)物，需要適當(dāng)加大自連體系，并延長(zhǎng)連接時(shí)間。我們利用優(yōu)化的 iPCR方法還成功克隆到棉花線粒體atp9、nad6、nad7基因的側(cè)翼序列 (未發(fā)表)，表明該方法重復(fù)性較好。利用獲得的差異序列，我們已將棉花可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)之間的RFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR和SSR標(biāo)記，說明該方法在分子標(biāo)記開發(fā)中也具有很大的潛力。

從圖2可看出，優(yōu)化后的iPCR法不僅可以擴(kuò)增出目的條帶，而且可以將星號(hào)活性位點(diǎn)產(chǎn)生的片段也擴(kuò)增出來：在P30A中，共擴(kuò)增出了3條帶；在P30B中，共擴(kuò)增出了4條帶。這說明只要酶切產(chǎn)生的線性片段具有互補(bǔ)的粘性末端，并且長(zhǎng)度不是過長(zhǎng) (超過5 kb)，就可以自連環(huán)化并進(jìn)而被有效擴(kuò)增。所以，優(yōu)化后的iPCR方法不僅可以克隆雙拷貝基因的側(cè)翼序列，而且也可以擴(kuò)增多拷貝基因的側(cè)翼序列。

iPCR法對(duì)于片段自連效果要求高，如果一個(gè)限制片段很長(zhǎng)，就很難有效連接并擴(kuò)增。一般來說，在進(jìn)行iPCR反應(yīng)之前，先要進(jìn)行Southern blotting分析，以確定一種能獲得合適長(zhǎng)度雜交片段的限制性內(nèi)切酶。棉花atpA/EcoRⅠ限制片段的大小是2.2~5.1 kb，長(zhǎng)度比較合適。但是Hind Ⅲ限制片段長(zhǎng)達(dá)11.7 kb，需要借助TAIL-PCR方法。TAIL-PCR方法不受限制片段長(zhǎng)度的束縛，只要控制好方向，它理論上可以無(wú)限地往側(cè)翼方向擴(kuò)增延伸。在進(jìn)行TAIL-PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們使用了LA-Taq酶，該酶具有很強(qiáng)的擴(kuò)增能力，我們進(jìn)行了多輪TAIL-PCR反應(yīng)，基本上每輪都能獲得2~3 kb的目的條帶。

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