• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    優(yōu)化的反向PCR結(jié)合TAIL-PCR法克隆棉花線粒體atpA雙拷貝基因及其側(cè)翼序列

    2012-02-26 13:20:38張曉張銳孫國(guó)清史計(jì)孟志剛周燾侯思宇梁成真于源華郭三堆
    生物工程學(xué)報(bào) 2012年1期

    張曉,張銳,孫國(guó)清,史計(jì),孟志剛,周燾,侯思宇,梁成真,于源華,郭三堆

    1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 國(guó)家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程,北京 100081

    2 長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130022

    在分子生物學(xué)中,為更好地研究某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)和功能,往往需要克隆其側(cè)翼序列。目前,已有多種技術(shù)用于擴(kuò)增基因的側(cè)翼序列[1-10]。但雙拷貝基因側(cè)翼序列的克隆仍是一個(gè)難點(diǎn),因?yàn)殡y以確定所克隆到的序列是屬于2個(gè)拷貝中的哪一個(gè)。以往要克隆雙拷貝基因的側(cè)翼序列,往往需要建立基因文庫(kù),然后篩選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序,但這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

    棉花 Gossypium hirsutum L. 線粒體基因組中 atpA基因以雙拷貝形式存在,該基因編碼線粒體ATP酶復(fù)合體F1因子中的α亞基。研究發(fā)現(xiàn),atpA基因在棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育 (CMS) 系和保持系之間,以及棉花A、D基因組二倍體之間都存在明顯的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPs)[11-15],這說明該基因是棉花線粒體基因組中的一個(gè)重組活躍位點(diǎn),并很可能與棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)。鞏養(yǎng)倉(cāng)[11]利用外源接頭介導(dǎo)PCR法克隆到哈克尼西棉 CMS系及其保持系atpA基因的部分側(cè)翼序列,但未能將棉花 atpA基因的2個(gè)拷貝區(qū)分開并加以詳細(xì)解析。

    為了克隆棉花雙拷貝 atpA基因側(cè)翼序列,我們將iPCR方法進(jìn)行優(yōu)化,并與TAIL-PCR相結(jié)合,摸索出一套高效簡(jiǎn)便的克隆雙拷貝基因側(cè)翼序列的方法。利用該方法,我們將 atpA兩個(gè)拷貝進(jìn)行了明確區(qū)分,并且獲得的單條完整片段長(zhǎng)達(dá)12 kb。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)該方法在擴(kuò)增雙拷貝甚至多拷貝基因側(cè)翼序列中的應(yīng)用進(jìn)行了討論。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料

    陸地棉CMS不育系P30A (不育胞質(zhì))、保持系P30B (可育胞質(zhì))、三系雜交種“銀棉2號(hào)” (不育胞質(zhì))。P30A和P30B是同核異質(zhì)系;P30A與“銀棉2號(hào)”具有相同胞質(zhì)。

    1.1.2 菌株與質(zhì)粒

    大腸桿菌Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)公司;pGEMT-easy載體購(gòu)自Promega公司。

    1.1.3 試劑

    Southern blotting檢測(cè)試劑盒 (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ)購(gòu)自 Roche公司;尼龍膜 Hybond-N+購(gòu)自Amersham公司;凝膠回收試劑盒購(gòu)自 Axygene公司;限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京天根生物公司;LA-Taq酶購(gòu)自 TaKaRa公司;DNA ladder 0331購(gòu)自Fermentas公司;其他化學(xué)試劑購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)公司,均為分析純。引物合成及DNA測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。iPCR和TAIL-PCR所用引物如表1所示。

    1.2 方法

    1.2.1 棉花總DNA提取

    使用改良CTAB法[16]提取棉花CMS系、保持系、雜交種葉片總DNA。

    1.2.2 棉花材料的Southern blotting分析

    Southern blotting分析參考王教瑜等[17]的方法。

    1.2.3 反向PCR (iPCR) 擴(kuò)增atpA基因EcoRⅠ限制片段

    參考Kim等[18]的方法并加以修改:取10 μg棉花總 DNA,在 200 μL酶切體系 (含 50 U EcoRⅠ酶) 中,37 ℃酶切6 h;用等體積苯酚:氯仿進(jìn)行抽提,然后用無(wú)水乙醇沉淀。將 DNA用3 U的T4 DNA連接酶在300 μL體系中16 ℃連接24 h。然后,自連產(chǎn)物用等體積苯酚:氯仿進(jìn)行抽提,然后用無(wú)水乙醇沉淀,20 μL雙蒸水重溶。從中取500 ng DNA作為模板,用LA-Taq酶在50 μL體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃,1 min;60 ℃,1 min;72 ℃,2 min,共35個(gè)循環(huán);然后72 ℃延伸10 min。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[19]。擴(kuò)增產(chǎn)物用 0.9%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,回收純化目的片段,連接到pGEMT-easy載體,然后轉(zhuǎn)化E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞,將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。

    1.2.4 TAIL-PCR擴(kuò)增atpA基因Hind Ⅲ限制片段

    具體方法參見文獻(xiàn)[20]。簡(jiǎn)并引物選用AD10 (表1);采用50 μL PCR體系;從第一步 (Primary)和第二步 (Secondary) 反應(yīng)液中取 0.5 μL作為各自下一步的模板。具體反應(yīng)步驟如表2所示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 atpA基因在陸地棉CMS不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)間存在明顯的RFLPs

    以atpA核心編碼區(qū) (引物為P1和P2,圖3所示) 為探針,對(duì)陸地棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A、保持系P30B、三系雜交種“銀棉2號(hào)”進(jìn)行Southern blotting分析。結(jié)果表明,可育胞質(zhì) (保持系) 和不育胞質(zhì) (不育系和雜交種) 間存在明顯的RFLP多態(tài)性:用EcoRⅠ酶切時(shí),可育胞質(zhì)出現(xiàn)2.2 kb和5.1 kb兩條雜交帶,而不育胞質(zhì)的雜交帶是2.2 kb和3.3 kb;用Hind Ⅲ酶切時(shí),可育胞質(zhì)出現(xiàn)8.5 kb和11.6 kb兩條雜交帶,而不育胞質(zhì)的雜交帶是9.1 kb和11.6 kb。這表明,陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)在 atpA位點(diǎn)存在明顯差異。所以,如果能克隆到 atpA基因所在的EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制片段,對(duì)研究棉花胞質(zhì)雄性不育機(jī)理將很有意義。

    表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

    表2 TAIL-PCR反應(yīng)條件Table 2 Cycling conditions of TAIL-PCR

    圖1 atpA基因?yàn)樘结樀腟outhern blotting雜交結(jié)果Fig. 1 Southern blotting analysis of total DNA from CMS line P30A (1), maintainer line P30B (2) and hybrid cultivar “Yinmian 2” (3) hybridized with atpA probe. Polymorphic bands between the fertile cytoplasm (2) and sterile cytoplasm (1, 3) are indicated by arrows.

    2.2 iPCR法擴(kuò)增atpA基因EcoRⅠ限制片段

    根據(jù)atpA基因編碼序列設(shè)計(jì)iPCR所需的兩對(duì)反向引物:P4和P5,P3和P6。P4和P5分別對(duì)應(yīng)atpA編碼區(qū)的258~285 bp和1 098~1 125 bp,二者相距812 bp;P3和P6分別對(duì)應(yīng)atpA編碼區(qū)的140~167 bp和1 183~1 210 bp,相距1 015 bp (表1和圖3)。首先按照常規(guī)的iPCR方法:先用P4和P5為引物,以100 ng自連產(chǎn)物為模板進(jìn)行一次iPCR (1st iPCR),然后用P3和P6為引物,以“1st iPCR”產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢式PCR (“2nd iPCR”)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在P30A中“1st iPCR”可以擴(kuò)增出相應(yīng)條帶,但亮度很弱;“2nd iPCR”時(shí)目的條帶未獲得富集反而亮度更淡。在 P30B中,“1st iPCR”可以將2.2 kb Southern blotting雜交片段所對(duì)應(yīng)的條帶擴(kuò)增出來,但無(wú)法擴(kuò)增出5.1 kb雜交片段所對(duì)應(yīng)的條帶;“2nd iPCR”時(shí)目的條帶未獲得富集反而亮度更淡 (圖 2B)。然后,我們參照Kim等的方法[18],將自連條件改為37 ℃,2 h,PCR模板量增大到500 ng進(jìn)行iPCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以將圖2A中雜交片段所對(duì)應(yīng)的條帶都擴(kuò)增出來,但是亮度偏弱 (圖 2C),很難進(jìn)行回收克隆,這說明連接時(shí)間太短會(huì)明顯降低環(huán)化效果。

    所以,我們對(duì)iPCR技術(shù)在2個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化,以保證通過一次PCR反應(yīng)就能獲得足夠的目的產(chǎn)物。一是自連時(shí)間延長(zhǎng)到 24 h以上(16 ℃),以獲得足夠的目的環(huán)化 DNA;二是將PCR的起始模板量增大到500 ng,以保證目標(biāo)產(chǎn)物獲得高效擴(kuò)增。結(jié)果從不育胞質(zhì)線粒體基因組中擴(kuò)增出1.2 kb和2.3 kb兩條帶,分別對(duì)應(yīng)2.2 kb和3.3 kb EcoRⅠ限制片段;從可育胞質(zhì)線粒體基因組中擴(kuò)增出1.2 kb和4.1 kb兩條帶,分別對(duì)應(yīng)2.2 kb和5.1 kb EcoRⅠ限制片段 (圖2 D)。

    將上述片段分別克隆測(cè)序后與 atpA基因核心保守序列進(jìn)行拼接還原,發(fā)現(xiàn) atpA基因在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)線粒體基因組中各有兩個(gè)不同的拷貝,如圖3所示。

    可育胞質(zhì)中2條EcoRⅠ限制片段的長(zhǎng)度是2 225 bp和5 083 bp,分別命名為N-1和N-2,二者5′端的EcoRⅠ位點(diǎn)相同,都是位于atpA基因編碼序列的第4 bp處 (ATGG AATTC)。N-1中含有完整atpA基因 (需要加上EcoRⅠ酶切位點(diǎn)上游的4個(gè)堿基ATGG),長(zhǎng)度1 524 bp,編碼507 aa。N-2中含有截短型atpA基因,截?cái)辔稽c(diǎn)位于編碼區(qū)第1 352 bp處。不育胞質(zhì)中相應(yīng)的兩條EcoRⅠ限制片段分別命名為S-1 (2 194 bp)和S-2 (3 297 bp)。S-1中含有完整atpA基因;S-2中含有3′截短型基因,截?cái)辔稽c(diǎn)位于編碼區(qū)第1 336 bp處。

    iPCR結(jié)果中,可育胞質(zhì)除1.2 kb和4.1 kb兩條目的帶之外,還存在一條 2.5 kb和一條0.3 kb的條帶??寺y(cè)序結(jié)果表明,二者分別由N-2中3 599 bp處 (GAATT T) 和1 327 bp處(A AATTC) 的 EcoRⅠ星號(hào)活性產(chǎn)生。同樣,不育胞質(zhì)0.35 kb條帶是由S-2中1 369 bp處(GAATT T) 的星號(hào)活性產(chǎn)生。

    為驗(yàn)證所克隆到的 EcoRⅠ限制片段是否正確,我們根據(jù)片段兩端序列設(shè)計(jì)引物:P7結(jié)合P8擴(kuò)增N-1和S-1,P7結(jié)合P9和P10來分別擴(kuò)增 N-2和 S-2。結(jié)果擴(kuò)增出與 Southern blotting結(jié)果相符的條帶 (圖4)。證明iPCR法成功將棉花線粒體atpA基因2個(gè)不同拷貝進(jìn)行正確區(qū)分。

    2.3 TAIL-PCR擴(kuò)增atpA Hind Ⅲ限制片段

    atpA基因EcoR Ⅰ限制片段的大小在2.2~ 5.1 kb之間,Hind Ⅲ限制片段的大小在8.5~11.6 kb之間,這說明前者總體上只是后者的一部分。為進(jìn)一步解析后者的多態(tài)性,我們?cè)谇罢叩幕A(chǔ)上,采用TAIL-PCR方法,進(jìn)一步克隆atpA的側(cè)翼序列。分析發(fā)現(xiàn),前者4條片段中只在N-2的第4 143 bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)Hind Ⅲ位點(diǎn)。所以,要獲得后者的4條片段,需要以前者片段為核心,分別向上、下游進(jìn)行基因組步移 (TAIL-PCR),理論上共需要向7個(gè)方向進(jìn)行,即:N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游和N-1、S-1、S-2片段的3′下游。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)4條EcoR Ⅰ限制片段的5′末端都是相同的,且先前對(duì)atpA基因 5′上游進(jìn)行TAIL-PCR時(shí)發(fā)現(xiàn),兩種胞質(zhì)TAIL-PCR擴(kuò)增條帶是相同的,這說明兩種胞質(zhì)atpA基因的 5′上游序列基本一致。所以,“N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游”這四者的基因組步移工作可以簡(jiǎn)化成其中之一。同樣,“N-1、S-1片段的3′下游”這兩者的基因組步移工作也簡(jiǎn)化成其中之一。這樣,7個(gè)步移任務(wù)簡(jiǎn)化成 3個(gè):S-1片段的 5′上游和 3′下游、S-2片段的3′下游。

    圖2 atpA基因的Southern blotting (EcoR Ⅰ酶切) 及反向PCR結(jié)果Fig. 2 Southern blotting and iPCR results of atpA gene. (A) Southern blotting analysis of atpA probe (EcoR I digested). (B, C, D) Results of iPCR with atpA-specific primer pairs. M: DNA marker; S: P30A; N: P30B; asterisks (*) indicate the bands resulted from star activity of EcoR I.

    圖3 陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中atpA基因EcoRⅠ限制片段示意圖Fig. 3 Schematic structures of all EcoR Ⅰ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm. The atpA coding sequences are indicated by gray boxes. The 3′ identical noncoding regions in N-1 and S-1 are represented by open bars. The deletion of the sequences at the SSR loci located downstream of the full-length atpA gene in S-1 is shown in hatched bars. The truncated regions of N-2 and S-2 are indicated by different cross-hatched bars. The 3′identical regions in N-2 and S-2 following the truncated regions are represented by hatched bars. P1 and P2 indicate the primers used for amplifying the core sequence of atpA for Southern blotting. P3-P6 indicate the primers used for inverse PCR. P7-P10 indicate the primer used for amplifying the EcoR Ⅰ restriction fragments ofatpA. Pentagrams indicate the sites that show star activity of EcoRⅠ.

    圖4 克隆片段的PCR鑒定Fig. 4 Identification of the cloning fragments by PCR. M: generuler 0331 marker; four primer pairs (P7/P8, P7/P8, P7/P10, and P7/P9) were used to amplify fragments of S-1, N-1, S-2, and N-2, respectively.

    2.3.1 atpA基因5′上游區(qū)的基因組步移

    我們以P30A總DNA為模板,向atpA 5′上游進(jìn)行了兩輪 TAIL-PCR (圖 5A),第Ⅰ輪TAIL-PCR的3步反應(yīng)中使用的特異引物分別為R1、R2、R3;第Ⅱ輪使用的引物分別為R4、R5、R6 (表1,圖6)。通過兩輪PCR反應(yīng),共獲得了4 837 bp的側(cè)翼序列,在atpA起始密碼子5′上游4 351 bp處發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

    為驗(yàn)證這段4 351 bp序列是否為4個(gè)片段(N-1、S-1、N-2、S-2) 所共有,我們?cè)谠撔蛄械?′端設(shè)計(jì)引物P11,在全長(zhǎng)atpA編碼區(qū)3′末端設(shè)計(jì)引物P12,在N-2和S-2 atpA編碼區(qū)截短位點(diǎn)后分別設(shè)計(jì)引物P13 和P14 (表1,圖6),分別以P30A或P30B總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了與預(yù)期相符的條帶 (數(shù)據(jù)未顯示),測(cè)序結(jié)果證明該序列是4個(gè)片段所共有。

    2.3.2 atpA全長(zhǎng)拷貝3′下游區(qū)的基因組步移

    以P30A總DNA為模板,向S-1 3′下游進(jìn)行了兩輪TAIL-PCR (圖5 B),兩輪反應(yīng)所使用的特異引物分別是F1、F2、F3; F4、F5、F6 (表1,圖6)。結(jié)果共獲得5 509 bp側(cè)翼序列,其中在S-1下游5 109 bp處發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ位點(diǎn)。為驗(yàn)證所獲序列是否正確,我們?cè)谌L(zhǎng) atpA編碼區(qū)3′末端設(shè)計(jì)引物P15,在5 509 bp序列3′端設(shè)計(jì)引物P16,分別以P30A或P30B總DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,結(jié)果獲得了與預(yù)期相符的條帶(數(shù)據(jù)未顯示),測(cè)序結(jié)果證明該序列是S-1和N-1所共有。

    2.3.3 不育胞質(zhì)截短型 atpA拷貝 (S-2) 3′下游區(qū)的基因組步移

    以P30A總DNA為模板,以SF1、SF2、SF3 (表1,圖6) 為特異引物,向S-2下游進(jìn)行了一輪TAIL-PCR (圖5 C),獲得了3 369 bp側(cè)翼序列,其中在第1 482 bp處,發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ位點(diǎn)。為驗(yàn)證正確與否,我們?cè)赟-2 atpA編碼區(qū)截短位點(diǎn)及所獲序列 3′末端處分別設(shè)計(jì)引物 P17和 P18 (表1,圖6),以P30A總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果獲得了與預(yù)期相符的條帶 (圖片未顯示)。

    圖5 不育胞質(zhì)atpA基因側(cè)翼序列 TAIL-PCR結(jié)果Fig. 5 TAIL-PCR results of flanking sequences of atpA in CMS line. (A) TAIL-PCR results of 5′ flanking sequences of atpA in CMS line. (B) TAIL-PCR results of 3′ flanking sequences of intact atpA gene in CMS line. (C) TAIL-PCR results of 3′flanking sequences of truncated atpA gene in CMS line. M: generuler 0331 marker; 1, 2, and 3 indicate the primary, secondary and tertiary reaction of TAIL-PCR (Table 2); I and II indicate the first and second round of TAIL-PCR.

    圖6 棉花可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中atpA基因Hind Ⅲ限制片段示意圖Fig. 6 Schematic structures of all Hind Ⅲ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm of cotton. The 5′ identical regions in N-1, N-2, S-1 and S-2 are represented by dotted bars. The 3′ identical regions in N-1 and S-1 following the atpA coding regions are represented by open bars. The differential sequences near 3′ Hind Ⅲ sites in N-2 and S-2 are indicated by different hatched bars. F1-F6, R1-R6, SF1-SF3 indicate the primers used for TAIL-PCR. P11-P14 indicate the primers used for amplifying 5′ flanking and coding regions of atpA; P15-P18 indicate the primers used for amplifying 3′ flanking regions of atpA.

    通過以上TAIL-PCR反應(yīng),獲得了棉花線粒體atpA基因EcoR Ⅰ與Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)之間的序列 (圖6),發(fā)現(xiàn)了兩種胞質(zhì)間新的差異序列,并確定了可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中兩條Hind Ⅲ限制片段長(zhǎng)度分別是11 689 bp和8 501 bp;11 658 bp和9 139 bp。

    綜上所述,通過iPCR和TAIL-PCR相結(jié)合的方法,我們獲得了陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)atpA基因所有的EcoR Ⅰ限制片段和Hind Ⅲ限制片段,將該基因的2個(gè)拷貝進(jìn)行了明確區(qū)分,確定了導(dǎo)致RFLP多態(tài)性的序列,在兩種胞質(zhì)中各獲得了超過20 kb的線粒體DNA序列,這些序列將有助于研究棉花 CMS機(jī)理及開發(fā) CMS相關(guān)分子標(biāo)記。

    3 討論

    通過優(yōu)化的iPCR和TAIL-PCR相結(jié)合的方法,我們獲得了陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)線粒體雙拷貝 atpA基因每個(gè)拷貝各自的側(cè)翼序列,證明可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中各有一個(gè)全長(zhǎng)拷貝和一個(gè)3′截短型拷貝,但3′截?cái)嗟奈恢貌煌?。分析發(fā)現(xiàn),在atpA編碼區(qū)存在一個(gè)BamH Ⅰ位點(diǎn)(圖3),這解釋了為何在BamH Ⅰ酶切產(chǎn)物中atpA顯示出4條雜交條帶[14]。將我們的結(jié)果與鞏養(yǎng)倉(cāng)的結(jié)果[11]進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),鞏養(yǎng)倉(cāng)所獲得的 atpA側(cè)翼序列屬于 3′截短型拷貝。iPCR方法具有較高的靈敏性,我們不只擴(kuò)增出目的條帶,同時(shí)也擴(kuò)增出由 EcoRⅠ酶星號(hào)活性所產(chǎn)生的條帶。我們?cè)趯?duì)atpA基因進(jìn)行Southern blotting實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),如果酶切產(chǎn)物上樣量較大,就很容易出現(xiàn)一些弱雜交帶。通過iPCR方法便明確了這些弱雜交帶通常是由內(nèi)切酶的星號(hào)活性產(chǎn)生的。所以,iPCR技術(shù)還可以用來鑒別某個(gè)基因Southern blotting的雜交信號(hào)中哪些是真拷貝,哪些是假拷貝。

    iPCR在擴(kuò)增基因側(cè)翼序列方面的優(yōu)勢(shì)就是它可以通過一個(gè)PCR反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增出5′和3′側(cè)翼序列,并且它可以在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增出多拷貝基因的側(cè)翼序列并加以區(qū)分,這是其他染色體步移方法很難做到的。傳統(tǒng)的iPCR需要連續(xù)進(jìn)行二步PCR反應(yīng),我們用一步PCR就擴(kuò)增出信號(hào)很強(qiáng)的條帶,關(guān)鍵因素之一就是加大iPCR反應(yīng)的起始模板量,本實(shí)驗(yàn)所用的模板量在500 ng以上。自連效率是iPCR成功的關(guān)鍵因素,由于連接體系中要求DNA濃度不能太高,為獲得產(chǎn)量較高的自連產(chǎn)物,需要適當(dāng)加大自連體系,并延長(zhǎng)連接時(shí)間。我們利用優(yōu)化的 iPCR方法還成功克隆到棉花線粒體atp9、nad6、nad7基因的側(cè)翼序列 (未發(fā)表),表明該方法重復(fù)性較好。利用獲得的差異序列,我們已將棉花可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)之間的RFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR和SSR標(biāo)記,說明該方法在分子標(biāo)記開發(fā)中也具有很大的潛力。

    從圖2可看出,優(yōu)化后的iPCR法不僅可以擴(kuò)增出目的條帶,而且可以將星號(hào)活性位點(diǎn)產(chǎn)生的片段也擴(kuò)增出來:在P30A中,共擴(kuò)增出了3條帶;在P30B中,共擴(kuò)增出了4條帶。這說明只要酶切產(chǎn)生的線性片段具有互補(bǔ)的粘性末端,并且長(zhǎng)度不是過長(zhǎng) (超過5 kb),就可以自連環(huán)化并進(jìn)而被有效擴(kuò)增。所以,優(yōu)化后的iPCR方法不僅可以克隆雙拷貝基因的側(cè)翼序列,而且也可以擴(kuò)增多拷貝基因的側(cè)翼序列。

    iPCR法對(duì)于片段自連效果要求高,如果一個(gè)限制片段很長(zhǎng),就很難有效連接并擴(kuò)增。一般來說,在進(jìn)行iPCR反應(yīng)之前,先要進(jìn)行Southern blotting分析,以確定一種能獲得合適長(zhǎng)度雜交片段的限制性內(nèi)切酶。棉花atpA/EcoRⅠ限制片段的大小是2.2~5.1 kb,長(zhǎng)度比較合適。但是Hind Ⅲ限制片段長(zhǎng)達(dá)11.7 kb,需要借助TAIL-PCR方法。TAIL-PCR方法不受限制片段長(zhǎng)度的束縛,只要控制好方向,它理論上可以無(wú)限地往側(cè)翼方向擴(kuò)增延伸。在進(jìn)行TAIL-PCR實(shí)驗(yàn)時(shí),我們使用了LA-Taq酶,該酶具有很強(qiáng)的擴(kuò)增能力,我們進(jìn)行了多輪TAIL-PCR反應(yīng),基本上每輪都能獲得2~3 kb的目的條帶。

    [1] Ochman H, Ajioka JW, Garza D, et al. Inverse polymerase chain reaction. Nat Biotechnol, 1990, 8(8): 759?760.

    [2] Liu YG, Whittier RF. Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics, 1995, 25(3): 674?681.

    [3] Shyamala V, Ames GFL. Genome walking by single-specific-primer polymerase chain reaction: SSP-PCR. Gene, 1990, 84(1): 1?8.

    [4] Jones DH, Winistorfer SC. Sequence specific generation of a DNA panhandle permits PCR amplification of unknown flanking DNA. Nucleic Acids Res, 1992, 20(3): 595?600.

    [5] Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, et al. Alu polymerase chain reaction: a method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(17): 6686?6690.

    [6] Kim YJ, Kwak CI, Gu YY, et al. Annealing control primer system for identification of differentially expressed genes on agarose gels. Biotechniques, 2004, 36(3): 424?426.

    [7] Rosenthal A, Jones DSC. Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res, 1990, 18(10): 3095?3096.

    [8] Parker JD, Rabinovitch PS, Burmer GC. Targeted gene walking polymerase chain reaction. Nucleic Acid Res, 1991, 19(11): 3055?3060.

    [9] Sarkar G, Turner RT, Bolander ME. Restriction-site PCR: a direct method of unknown sequence retrieval adjacent to a known locus by using universal primers. PCR Methods Appl, 1993, 2(4): 318?322.

    [10] Liang CZ, Zhang R, Guo SD. Progress of chromosome walking. Biotechnol Bull, 2009(10): 75?82, 87.梁成真, 張銳, 郭三堆. 染色體步移技術(shù)研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2009(10): 75?82, 87.

    [11] Gong YC. Screening of mitochondrial genes associated with cytoplasmic male sterility in cotton[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2008.鞏養(yǎng)倉(cāng). 棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)線粒體基因篩選[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2008.

    [12] Feng CD, Guo JH, Nie YC, et al. Cytoplasmic-nuclear male sterility in cotton: comparative RFLP analysis of mitochondrial DNA. San Antonio: Proceedings of the Beltwide Cotton Conferences, 2000, 1: 511?512.

    [13] Wang F, Feng CD, O’Connell MA, et al. RFLP analysis of mitochondrial DNA in two cytoplasmic male sterility systems (CMS-D2 and CMS-D8) of cotton. Euphytica, 2010, 172(1): 93?99.

    [14] Small RL, Wendel JF. The mitochondrial genome of allotetraploid cotton (Gossypium L.). J Hered, 1999, 90(1): 251?253.

    [15] Wu JY, Gong YC, Cui MH, et al. Molecular characterization of cytoplasmic male sterility conditioned by Gossypium harknessii cytoplasm (CMS-D2) in upland cotton. Euphytica, 2011, 181(1): 17?29.

    [16] Huang J, Ge X, Sun M. Modified CTAB protocol using a silica matrix for isolation of plant genomic DNA. Biotechnique, 2000, 28(3): 432?434.

    [17] Wang JY, Zhang Z, Du XF, et al. Dual screening for targeted gene replacement mutant in Magnaporthe oryzae with GUS as negative marker. Chin J Biotech, 2009, 25(1): 129?138.王教瑜, 張震, 杜新法, 等. GUS為負(fù)標(biāo)記的稻瘟病菌目標(biāo)基因替換突變體雙篩選體系. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(1): 129?138.

    [18] Kim DH, Kim BD. The organization of mitochondrial atp6 gene region in male fertile and CMS lines of pepper (Capsicum annuum L.). Curr Genet, 2006, 49(1): 59?67.

    [19] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 20?25.

    [20] Liang CZ, Zhang R, Sun GQ, et al. Cloning of stress-related transcription factors gene from cotton by optimized TAIL-PCR. Cott Sci, 2010, 22(3): 195?201.梁成真, 張銳, 孫國(guó)清, 等. 優(yōu)化TAIL-PCR方法克隆棉花抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因. 棉花學(xué)報(bào), 2010, 22(3): 195?201.

    尾随美女入室| 久久99精品国语久久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 日本av免费视频播放| 国产av精品麻豆| 亚洲中文av在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 两个人免费观看高清视频 | 亚洲av福利一区| 色视频在线一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看| av视频免费观看在线观看| 永久网站在线| 亚洲精品乱久久久久久| 一本一本综合久久| 国产色婷婷99| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产一区二区在线观看av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 日本wwww免费看| 国产黄片视频在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一级爰片在线观看| www.av在线官网国产| 国产精品无大码| 成人影院久久| 男人狂女人下面高潮的视频| av有码第一页| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久久久久久久免费av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人综合一区亚洲| 亚洲av成人精品一区久久| 精品久久久噜噜| 免费人成在线观看视频色| 日韩,欧美,国产一区二区三区| freevideosex欧美| 亚洲av.av天堂| 99久国产av精品国产电影| av女优亚洲男人天堂| 91精品国产九色| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 精品一区二区三区视频在线| 国产深夜福利视频在线观看| 免费看不卡的av| 亚洲电影在线观看av| 69精品国产乱码久久久| 国产成人91sexporn| 精品久久久久久久久亚洲| 丰满少妇做爰视频| 男男h啪啪无遮挡| 色婷婷久久久亚洲欧美| 热re99久久精品国产66热6| 免费人成在线观看视频色| av天堂中文字幕网| 国产极品天堂在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲精品国产av成人精品| 极品教师在线视频| 午夜精品国产一区二区电影| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美97在线视频| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 成人二区视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费观看a级毛片全部| 日本wwww免费看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 中文欧美无线码| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲国产精品一区三区| 精品久久久精品久久久| 免费黄网站久久成人精品| 久久久国产精品麻豆| 日韩精品有码人妻一区| 男男h啪啪无遮挡| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久国产一区二区| 99久国产av精品国产电影| 黄色欧美视频在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 国产爽快片一区二区三区| h日本视频在线播放| 99热网站在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 97超碰精品成人国产| 黄片无遮挡物在线观看| 精品少妇内射三级| 国产淫语在线视频| 亚洲精品视频女| 国产精品一区二区在线不卡| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久女婷五月综合色啪小说| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产一区二区在线观看av| 国产在视频线精品| 精品一品国产午夜福利视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 嫩草影院新地址| 亚洲不卡免费看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品乱久久久久久| 久久99热6这里只有精品| 亚洲久久久国产精品| 看非洲黑人一级黄片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 99久久精品一区二区三区| 2022亚洲国产成人精品| 好男人视频免费观看在线| 国产高清三级在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲精品久久午夜乱码| av线在线观看网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产成人a∨麻豆精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 中国国产av一级| 亚洲精品456在线播放app| 伊人久久精品亚洲午夜| 日日撸夜夜添| 下体分泌物呈黄色| 国产成人一区二区在线| 日韩大片免费观看网站| 色视频www国产| 国产在线免费精品| av免费在线看不卡| 国产成人aa在线观看| 国产成人一区二区在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 人妻少妇偷人精品九色| 精品酒店卫生间| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 丝袜脚勾引网站| 亚洲无线观看免费| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国内精品宾馆在线| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产视频内射| 欧美高清成人免费视频www| 国产伦理片在线播放av一区| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲成人手机| 日韩免费高清中文字幕av| 老司机影院成人| 丰满饥渴人妻一区二区三| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 大香蕉久久网| 久久热精品热| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久人人爽人人片av| 丁香六月天网| 国产精品.久久久| 只有这里有精品99| 多毛熟女@视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久久久久人妻| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲伊人久久精品综合| 国产综合精华液| 欧美成人精品欧美一级黄| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲内射少妇av| 91精品国产九色| 免费观看av网站的网址| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 成人美女网站在线观看视频| 精品久久久久久久久亚洲| 大香蕉97超碰在线| 欧美激情国产日韩精品一区| xxx大片免费视频| 性色av一级| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 大话2 男鬼变身卡| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日本av手机在线免费观看| 大香蕉久久网| 三级国产精品欧美在线观看| 精品国产一区二区久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品一区二区三区视频在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲精品日韩av片在线观看| av天堂久久9| 少妇 在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国精品久久久久久国模美| 99热这里只有是精品在线观看| h视频一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 久久久久网色| 亚洲国产精品999| 成人国产麻豆网| 精品国产国语对白av| av黄色大香蕉| 一区在线观看完整版| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产毛片在线视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 午夜激情福利司机影院| h日本视频在线播放| 一级毛片电影观看| 国产成人精品一,二区| 日本色播在线视频| 乱系列少妇在线播放| 久久久国产精品麻豆| 成人特级av手机在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲国产精品999| 亚洲精品乱久久久久久| 老熟女久久久| 国产熟女午夜一区二区三区 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 中文天堂在线官网| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲性久久影院| 国产精品人妻久久久影院| 老司机影院成人| 欧美日韩av久久| 99热这里只有是精品在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品99久久久久久久久| 我的老师免费观看完整版| 亚洲av男天堂| av国产久精品久网站免费入址| 久久精品国产a三级三级三级| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产 一区精品| 精品少妇久久久久久888优播| 精品亚洲成a人片在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲成人一二三区av| 精品熟女少妇av免费看| 国模一区二区三区四区视频| 欧美日本中文国产一区发布| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲av.av天堂| 亚洲精品456在线播放app| 交换朋友夫妻互换小说| 美女福利国产在线| 国产爽快片一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av.av天堂| 嘟嘟电影网在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| av国产久精品久网站免费入址| 欧美+日韩+精品| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 伊人久久国产一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 51国产日韩欧美| 国产有黄有色有爽视频| videossex国产| 国产成人freesex在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久精品国产亚洲av天美| 国产亚洲5aaaaa淫片| 五月天丁香电影| 国产在线视频一区二区| 欧美性感艳星| 日韩电影二区| av免费观看日本| 精品卡一卡二卡四卡免费| 极品教师在线视频| 在线播放无遮挡| 这个男人来自地球电影免费观看 | 少妇人妻一区二区三区视频| 国产av国产精品国产| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美日韩视频精品一区| 国产69精品久久久久777片| 国产精品一区二区性色av| 一区二区三区四区激情视频| 免费看光身美女| 国产精品免费大片| 午夜影院在线不卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久99蜜桃精品久久| a 毛片基地| 久久久久久久精品精品| 国产毛片在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| videos熟女内射| 日本色播在线视频| 妹子高潮喷水视频| 国产一区二区三区av在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国内精品宾馆在线| 国产成人精品久久久久久| 国模一区二区三区四区视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 免费观看无遮挡的男女| 黄色配什么色好看| 亚洲,一卡二卡三卡| 色5月婷婷丁香| 91久久精品国产一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 十分钟在线观看高清视频www | 一区二区三区精品91| 国产成人aa在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一本大道久久a久久精品| 大香蕉久久网| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 久久久久人妻精品一区果冻| 熟女av电影| 亚洲精品国产成人久久av| 国产淫语在线视频| 多毛熟女@视频| 久久狼人影院| 多毛熟女@视频| 日韩电影二区| 七月丁香在线播放| 国产亚洲精品久久久com| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲美女视频黄频| 99久久人妻综合| 成人国产麻豆网| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲美女黄色视频免费看| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 国产av码专区亚洲av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美区成人在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 五月开心婷婷网| 黄色怎么调成土黄色| 欧美+日韩+精品| 天堂8中文在线网| 中国美白少妇内射xxxbb| 日韩强制内射视频| 人妻一区二区av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 蜜桃在线观看..| 久久ye,这里只有精品| 赤兔流量卡办理| 成人特级av手机在线观看| 两个人免费观看高清视频 | 97超碰精品成人国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲伊人久久精品综合| 97在线人人人人妻| 国产一区亚洲一区在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 国产成人精品婷婷| 赤兔流量卡办理| 欧美国产精品一级二级三级 | 中文字幕av电影在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 一区二区三区四区激情视频| 波野结衣二区三区在线| 高清欧美精品videossex| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一本一本综合久久| 91久久精品电影网| 免费黄色在线免费观看| 国产一区二区三区av在线| 美女视频免费永久观看网站| 视频区图区小说| 亚洲图色成人| 久久久久视频综合| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产高清国产精品国产三级| 国产成人freesex在线| 高清不卡的av网站| 欧美区成人在线视频| 婷婷色综合www| 国产免费福利视频在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产黄色免费在线视频| 性色av一级| 少妇人妻一区二区三区视频| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 丁香六月天网| 一级a做视频免费观看| 一级爰片在线观看| 草草在线视频免费看| 丝袜在线中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲精品色激情综合| 日韩电影二区| 99九九线精品视频在线观看视频| 黄色一级大片看看| 99九九在线精品视频 | 最近2019中文字幕mv第一页| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久热久热在线精品观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 丝瓜视频免费看黄片| 99久久中文字幕三级久久日本| 黄色欧美视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 少妇 在线观看| 国产精品成人在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日本vs欧美在线观看视频 | 搡老乐熟女国产| 十八禁网站网址无遮挡 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 99久国产av精品国产电影| 天天操日日干夜夜撸| 久久精品夜色国产| 精品久久久久久久久亚洲| 久久久久久久久久久丰满| 大码成人一级视频| av视频免费观看在线观看| 免费大片18禁| 黄色日韩在线| 久久久久网色| 欧美精品一区二区免费开放| 免费黄网站久久成人精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 免费人成在线观看视频色| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | av.在线天堂| 亚洲国产色片| 久久99蜜桃精品久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲综合色惰| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久ye,这里只有精品| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 最近中文字幕高清免费大全6| 内地一区二区视频在线| 欧美日韩在线观看h| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产成人精品久久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 国产黄片美女视频| 久久97久久精品| 久久久久久久久久成人| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久这里有精品视频免费| 午夜激情久久久久久久| 中文在线观看免费www的网站| 草草在线视频免费看| 久久久久久久国产电影| 街头女战士在线观看网站| 免费在线观看成人毛片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 丝袜脚勾引网站| 一本大道久久a久久精品| 欧美日本中文国产一区发布| 青春草亚洲视频在线观看| 人妻一区二区av| 美女内射精品一级片tv| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品蜜桃在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产av一区二区精品久久| av国产精品久久久久影院| 插逼视频在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 伊人久久国产一区二区| 免费av中文字幕在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 男人和女人高潮做爰伦理| 日本与韩国留学比较| 乱人伦中国视频| 国产精品免费大片| 久久鲁丝午夜福利片| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲美女搞黄在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| av黄色大香蕉| 国产成人免费观看mmmm| 九九爱精品视频在线观看| 日韩中字成人| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 精品久久久精品久久久| 五月开心婷婷网| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 女人久久www免费人成看片| 最后的刺客免费高清国语| 日韩av在线免费看完整版不卡| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲在久久综合| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品国产三级专区第一集| 国产在线一区二区三区精| 免费av中文字幕在线| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久国产网址| 男人和女人高潮做爰伦理| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人美女网站在线观看视频| 嫩草影院新地址| 亚洲av日韩在线播放| 一级av片app| 亚洲国产欧美在线一区| 不卡视频在线观看欧美| 精品久久久精品久久久| 亚洲真实伦在线观看| 丁香六月天网| 国产综合精华液| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲成人一二三区av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 尾随美女入室| av不卡在线播放| 一区在线观看完整版| 国产色婷婷99| 久久 成人 亚洲| 久久免费观看电影| 老熟女久久久| 在线观看国产h片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 性色av一级| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 热99国产精品久久久久久7| av免费观看日本| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久热精品热| 高清在线视频一区二区三区| 9色porny在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲欧洲日产国产| 国产男女超爽视频在线观看| a级毛色黄片| 97超视频在线观看视频| 不卡视频在线观看欧美| 丝袜脚勾引网站| 亚洲国产av新网站| 中文资源天堂在线| 热99国产精品久久久久久7| 精品久久久久久久久亚洲| a级一级毛片免费在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品偷伦视频观看了| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产日韩欧美亚洲二区| 色视频在线一区二区三区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲人成网站在线播| 少妇的逼好多水| 国产精品一区二区在线观看99| av女优亚洲男人天堂| 精品久久久久久电影网| 国产成人一区二区在线| 成年人午夜在线观看视频| 一区二区av电影网| 国产av一区二区精品久久| 午夜福利影视在线免费观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲色图综合在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 91成人精品电影| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久6这里有精品| 日日啪夜夜撸| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲美女黄色视频免费看| 在线观看免费视频网站a站| 最后的刺客免费高清国语| 日本午夜av视频| 国产av一区二区精品久久| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久亚洲国产成人精品v| 一区二区三区乱码不卡18| 3wmmmm亚洲av在线观看| kizo精华|