來源于青霉XMZ-9兩個(gè)低溫脂肪酶的基因克隆、原核表達(dá)與性質(zhì)測(cè)定

鄭小梅，伍寧豐，范云六

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 是一類重要的工業(yè)用酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中[1]。與動(dòng)、植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有底物廣譜性，并且具有更廣的pH與溫度作用范圍，更適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，從而使微生物脂肪酶成為工業(yè)用脂肪酶的重要來源[2]。

低溫脂肪酶在低溫下仍具有較高活性，使其成為近年來研究的熱點(diǎn)[3]。這類酶進(jìn)化出了更高的結(jié)構(gòu)柔韌性，尤其是在活性位點(diǎn)附近，往往使其具有較低的活化能，從而酶在低溫環(huán)境下更容易發(fā)揮催化作用，提高對(duì)底物的利用率[4]。此外，低溫脂肪酶的結(jié)構(gòu)柔韌性使其在高溫條件下的熱穩(wěn)定性相對(duì)于中溫酶要差一些[3]。但正是這些特點(diǎn)使低溫脂肪酶在食品添加劑、洗滌添加劑及有機(jī)合成等產(chǎn)業(yè)中具有非常獨(dú)特的應(yīng)用前景[5-7]。在食品行業(yè)，可作為低溫添加劑改善食品的風(fēng)味；在洗滌行業(yè)，可在冷水中仍具有較好的去油污的效果等等[8-10]。低溫脂肪酶往往存在于那些常年生活在如冰川、深海、南極甚至冰箱等低溫環(huán)境中的低溫微生物中[10-14]。目前，低溫脂肪酶多來源于細(xì)菌與酵母，來源于真菌的還非常少見[3]。

本研究從冰川土樣中分離獲得一株具有較高脂肪酶酶活的青霉菌Penicillium sp. XMZ-9。利用TAIL-PCR等方法從Penicillium sp. XMZ-9基因組中克隆到 2個(gè)完整的脂肪酶相關(guān)基因：LipA與LipB；并將兩基因的cDNA序列在大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3) 中得到了高效表達(dá)。經(jīng)體外復(fù)性或親和純化等方法純化后，對(duì)2個(gè)重組酶進(jìn)行溫度適應(yīng)性測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

青霉菌Penicillium sp. XMZ-9由本實(shí)驗(yàn)室從冰川土壤中分離并鑒定；E. coli Top10、E. coli BL21 (DE3) 與表達(dá)質(zhì)粒 pET30a (+) 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆質(zhì)粒pEASY-T3載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 工具酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、染色體步移試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒與RNA prep pure植物 (真菌) 總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司；Ni-NTA樹脂購(gòu)自QIAGEN公司；丙烯酰胺、N, N￠-亞甲叉丙烯酰胺、IPTG購(gòu)自Sigma公司；酵母提取物、蛋白胨購(gòu)自 Oxford公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

我們從新疆冰川低溫土樣中進(jìn)行了低溫微生物的富集培養(yǎng)與分離鑒定。用富集培養(yǎng)基(1% (V/V) 橄欖油，0.5% (W/V) 蛋白胨與0.5% (W/V) NaCl) 對(duì)土樣在25 ℃下低溫富集培養(yǎng)后，將過夜培養(yǎng)物稀釋后涂布于含有 1% (V/V) 橄欖油的瓊脂平板中。將劃線后的單菌落在含有1% (V/V) 三丁酸甘油酯與維多利亞藍(lán)的脂肪酶篩選平板上進(jìn)行產(chǎn)脂肪酶活性的定性檢測(cè)。根據(jù)降解透明圈的大小，我們選取了產(chǎn)脂肪酶真菌XMZ-9進(jìn)行后續(xù)研究。通過菌落形態(tài)與18S rDNA的分子鑒定來鑒定真菌XMZ-9的種屬分類。

1.2.2 青霉菌基因組DNA與RNA的提取

青霉菌基因組 DNA的提取按照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行；其總RNA的提取則按照RNA prep pure植物(真菌) 總RNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.3 青霉菌脂肪酶基因及cDNA序列的克隆

從 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載不同真菌脂肪酶的蛋白序列，使用 ClustalW 軟件[16]進(jìn)行多序列比對(duì)分析確定真菌脂肪酶的保守區(qū) (FHGGG與GFSAGG)。依據(jù)所得的保守區(qū)與青霉菌密碼子的偏愛性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物lipPF與lipPR (表1)。以Penicillium sp. XMZ-9基因組DNA為模板，利用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行降落PCR，擴(kuò)增兩保守區(qū)之間的基因序列。降落PCR的條件為：首先94 ℃預(yù)變性5 min；然后20個(gè)降落循環(huán)：94 ℃ 變性30 s，退火溫度從65℃開始，此后每個(gè)循環(huán)降落0.5 ℃，至55℃，72 ℃延伸30 s；再次20個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物回收后連接到pEASY-T3載體進(jìn)行序列測(cè)定與分析。

為獲得完整的基因全長(zhǎng)，以已知序列為模板向上下游方向分別設(shè)計(jì) 3個(gè)嵌套的特異引物(表 1)，然后用染色體步移試劑盒進(jìn)行染色體步移。針對(duì) LipA基因的上游序列克隆所用引物為lipAFsp1、lipAFsp2、lipAFsp3；針對(duì)LipA基因的上游序列克隆所用引物為 lipARsp1、lipARsp2、lipARsp3；針對(duì)LipB基因的上游序列克隆所用引物為 lipBFsp1、lipBFsp2、lipBFsp3；針對(duì) LipB基因的上游序列克隆所用引物為 lipBRsp1、

lipBRsp2、lipBRsp3。將所得的各個(gè)基因的上下游片段與已知序列用 Vector NTI Suite 9.0 (InforMax, Gaithersburg, MD, USA) 軟件進(jìn)行拼接。全基因序列在 NCBI網(wǎng)站利用 BLAST X (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 進(jìn)行相似性比對(duì)研究。用DS Gene軟件預(yù)測(cè)完整的開放閱讀框，并利用 Gene Finder軟件 (http://www. bioscience.org/urllists/genefind.html) 分析基因中的外顯子與內(nèi)含子。

表1 基因克隆與表達(dá)所用引物Table 1 Primers used for gene cloning and expression in this study

以5 μg總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶Rever Tra Ace和引物Oligo-dT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA的第一鏈。以lipAFm (含EcoRⅠ酶切位點(diǎn))與 lipARm (含 NotⅠ酶切位點(diǎn)) 及 lipBFm (含SacⅠ酶切位點(diǎn)) 與lipBRm (含XhoⅠ酶切位點(diǎn))為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增兩基因帶酶切位點(diǎn)修飾的全長(zhǎng)cDNA。PCR產(chǎn)物回收后連接到pEASY-T3載體進(jìn)行序列測(cè)定與分析。

1.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

用相應(yīng)的限制酶酶切測(cè)序正確的pEASY-T3重組質(zhì)粒，將目的基因的酶切片段與同樣酶切處理的表達(dá)質(zhì)粒pET30a (+) 進(jìn)行連接。將驗(yàn)證正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-lipA、pET-lipB及空表達(dá)質(zhì)粒pET30a (+) 分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)。將轉(zhuǎn)化菌株過夜活化后，以1%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)約2 h，當(dāng)OD600達(dá)到0.6后，加入20 μL l mol/L IPTG在16 ℃下進(jìn)行低溫過夜誘導(dǎo)表達(dá)。將50 mL菌液高速離心棄上清，菌體用5 mL 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液重懸，加入PMSF (終濃度為0.1 mmol/L)，進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞，15 000 r/min離心20 min，破碎后的上清液為破碎上清即可溶性的重組酶液，沉淀為包涵體的粗提物。分別加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴 5 min，進(jìn)行濃度為 12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.5 重組蛋白的親和純化

首先用 10 mL平衡緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，10 %甘油與0.5 mol/L NaCl)平衡親和層析樹脂Ni-NTA柱，然后加入破碎上清的樣品，再分別加入10 mL 含有0、20、100、200 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫并收集相應(yīng)洗脫液。取 50 μL穿透峰及各洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。收集純度較好的洗脫液在50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 中進(jìn)行過夜透析，除去洗脫液中的咪唑。

1.2.6 包涵體蛋白的變性與復(fù)性

用1 mL 50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 緩沖液洗滌包涵體的粗提物2次，然后分別用1 mL 2 mol/L與4 mol/L尿素洗滌沉淀，除掉可能的雜蛋白，最后將沉淀重溶于500 μL 8 mol/L 尿素變性液，37 ℃過夜孵育使沉淀充分溶解。變性后的蛋白用復(fù)性緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，10%甘油與1%甘氨酸) 進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，4 ℃孵育12 h，進(jìn)行稀釋復(fù)性并摸索合適的稀釋倍數(shù)。

1.2.7 重組脂肪酶的活性測(cè)定

脂肪酶活性檢測(cè)采用分光光度計(jì)比色法檢測(cè)對(duì)硝基酚的生成量[17]。底物母液為500 μmol/L對(duì)硝基辛酸酯的乙醇溶液。標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件為100 μL的底物母液溶于 1.8 mL 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 中，35 ℃預(yù)熱5 min后再加入100 μL檢測(cè)酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，然后加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，再加入0.5 mL 10%碳酸鈉溶液顯色。高速離心去除沉淀后，410 nm下測(cè)定脂肪酶酶催化產(chǎn)生的對(duì)硝基酚的光吸收值。一個(gè)脂肪酶酶活單位 (1 U) 定義為在pH 8.0，35 ℃條件下，每分鐘釋放1 μmol/L對(duì)硝基酚所需的酶量。對(duì)照反應(yīng)為在相同條件下加入等量已滅活的酶液。每個(gè)反應(yīng)均做3個(gè)平行樣，取平均值作為最終酶活值。

1.2.8 脂肪酶溫度適應(yīng)性的測(cè)定

在50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 緩沖液和不同溫度 (0~60 ℃) 下測(cè)定脂肪酶活性，根據(jù)相對(duì)酶活值來確定最適溫度。將酶液先在40 ℃、50 ℃與60 ℃下處理不同的時(shí)間梯度2、5、10、20、40、60、80、100 min，再測(cè)定殘留酶活值以檢測(cè)酶蛋白的溫度穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

通過富集培養(yǎng)從新疆冰川低溫土樣中分離到5株低溫真菌。根據(jù)降解透明圈的大小，選取了產(chǎn)脂肪酶活性最高的真菌XMZ-9進(jìn)行后續(xù)研究。菌落形態(tài)與 18S rDNA的分子鑒定表明XMZ-9為青霉屬 Penicillium。其18S rDNA在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)為FJ973461。

2.2 青霉菌脂肪酶基因及 cDNA序列的克隆與分析

以Penicillium sp. XMZ-9基因組DNA為模板，利用簡(jiǎn)并引物 (lipPF與lipPR) 降落PCR，擴(kuò)增到一個(gè)大小約為220 bp的片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定與比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其包括2段相似性為60%且大小相差6 bp的基因片段。用BLAST X進(jìn)行序列比對(duì)表明其中一個(gè)基因片段與來源于棒曲霉Aspergillus clavatus NRRL 1的脂肪酶相似性為79%；另一基因片段與來源于費(fèi)氏新薩托Neosartorya fischeri NRRL 181的酯酶相似性為86%。

根據(jù)已獲得的兩段基因片段設(shè)計(jì)了向上、下游方向的特異引物 (表1)，利用染色體步移試劑盒擴(kuò)增獲得了兩基因片段的側(cè)翼序列 (圖1)。經(jīng)基因拼接與序列分析表明已獲得2個(gè)編碼脂肪酶的完整基因，分別記為 LipA與 LipB (GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)分別為FJ973462與FJ973463)。隨后，利用RT-PCR從Penicillium sp. XMZ-9總 RNA中擴(kuò)增到2個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

脂肪酶結(jié)構(gòu)基因LipA全長(zhǎng)1 014 bp，無內(nèi)含子，編碼337個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子，成熟蛋白理論分子量38.39 kDa。蛋白序列比對(duì)結(jié)果表明與黑曲霉Aspergillus niger strain CBS 513.8脂肪酶LipP (GenBank Accession No. A2Q8U6)的一致性最高為68%。用SignalP 3.0 Server信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明其1~22 aa為信號(hào)肽。而脂肪酶結(jié)構(gòu)基因LipB全長(zhǎng)1 232 bp，cDNA長(zhǎng)1 122 bp，含有2個(gè)內(nèi)含子，分別為位于+538~+598 (61 bp)的內(nèi)含子序列與位于+917~+966 (49 bp) 的內(nèi)含子序列。該基因編碼373個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子，成熟蛋白理論分子量41.63 kDa。蛋白序列比對(duì)結(jié)果表明與N. fischeri NRRL 181的酯酶(GenBank Accession No. A1DL68) 的一致性最高為75%。用SignalP 3.0 Server信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明其無信號(hào)肽。

2.3 青霉菌脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá)

以cDNA為模板，以lipAFm與lipARm為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增到目的基因LipA；以lipBFm與 lipBRm為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增到目的基因LipB。測(cè)序無誤后，分別克隆至表達(dá)載體pET30a (+)，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒 pET-lipA與pET-lipB。在E. coli BL21 (DE3) 中的誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，基因lipA基本表達(dá)為不可溶的包涵體 (40 kDa，圖2，Lane 2)；而基因lipB則大部分表達(dá)為可溶的蛋白形式 (43 kDa，圖2，Lane 5)。

2.4 活性重組酶LipA與LipB的獲得

由于重組酶LipA大部分表達(dá)為不可溶的包涵體，因此采用了尿素變性與稀釋復(fù)性的方法來獲得其活性脂肪酶。經(jīng) 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、2 mol/L與4 mol/L尿素洗滌沉淀去除雜蛋白后，用8 mol/L 尿素可將包涵體完全變性。變性后的樣品可達(dá)到電泳純的純度，如圖3A所示。通過不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋復(fù)性發(fā)現(xiàn)稀釋50倍時(shí)，其酶活可達(dá)到15.72 U/mL。

圖1 青霉菌脂肪酶染色體步移電泳圖Fig. 1 Genome walking results of Penicillium lipases. (A) genome walking results of LipA. (B) genome walking results of LipB. M: 1 kb standard protein molecular weight markers; 1,3,5,7: the 2nd PCR results in genome walking processes; 2,4,6,8: the 3rd PCR results in genome walking processes; 1,2,5,6: the PCR results using No.2 AD primer; 3,4,7,8: the PCR results using No.4 AD primer.

圖2 SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組青霉菌脂肪酶LipA與LipB在大腸桿菌中的表達(dá)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant LipA and LipB expressed in E. coli. M: standard protein molecular weight markers; 1,2: lysate supernatant (1) and cell pellet (2) of transformed bacteria harboring pET-lipA; 3,4: lysate supernatant (3) and cell pellet (4) of transformed bacteria harbouring empty vector pET30a(+); 5,6: lysate supernatant (5) and cell pellet (6) of transformed bacteria harboring pET-lipB.

相對(duì)而言，重組酶LipB大部分表達(dá)為可溶的形式，利用Qiagen的His-標(biāo)簽蛋白親合層析柱進(jìn)行了純化，含有100 mmol/L與200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫效果較好，透析濃縮后，可達(dá)到電泳純，如圖3B所示；純化的LipB酶活可達(dá)到7.34 U/mL。

2.5 重組脂肪酶酶LipA與LipB的溫度適應(yīng)性

圖3 純化的重組青霉菌脂肪酶LipA與LipB SDS- PAGE電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant LipA and LipB. (A) the recombinant LipA protein, expressed in E. coli and dissolved in 8 mol/L urea, was analyzed by SDS-PAGE. M: standard protein molecular-weight markers; 1: purified inclusion body containing LipA; 2: cell pellet of transformed bacteria harboring pET-lipA. (B) the recombinant LipB protein, recovered at various points in the purification process, was analyzed by SDS-PAGE. M: standard protein molecular weight markers; 1: lysate supernatant of transformed bacteria harboring pET-lipB; 2: purified LipB after dialysis and concentration.

重組酶LipA與LipB最適溫度的酶活性測(cè)定結(jié)果表明，兩者水解對(duì)硝基辛酸酯的最適反應(yīng)溫度分別為30 ℃與40 ℃ (圖4)。LipA在溫度低于30 ℃時(shí)，隨著溫度升高酶的活性逐步上升，在10 ℃與 20 ℃時(shí)相對(duì)酶活性達(dá)到 28.18%與60.11%；高于30 ℃酶活力下降，到60 ℃只有最大活力的37.23%；在20 ℃到50 ℃的條件下仍具有50%以上的酶活。LipB在溫度低于40 ℃時(shí)，隨著溫度升高酶的活性逐步上升，在10 ℃與 20 ℃時(shí)相對(duì)酶活性可分別達(dá)到 31.27%與56.99%；高于40 ℃酶活力迅速下降，到60 ℃時(shí)只有最大活力的18.91%；在20 ℃到50 ℃的條件也保持有50%以上的酶活。

熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，酶活性測(cè)定結(jié)果表明，重組酶LipA與LipB的熱穩(wěn)定性都不是很好，但相對(duì)而言，LipA的熱穩(wěn)定性略好于LipB (圖5)。在低溫條件40 ℃下，LipA與LipB 保溫100 min后相對(duì)酶活仍具有85.26%與79.03%。但隨溫度的提高，脂肪酶的活性下降較為明顯。在50 ℃下，LipA與LipB 保溫100 min后相對(duì)酶活分別只具有30.85%與23.57%。在60 ℃下，LipA與 LipB 保溫 10 min后相對(duì)酶活明顯下降至23.32%與31.55%。保溫100 min后相對(duì)酶活分別只具有11.66%與6.09%。

圖5 重組脂肪酶LipA與LipB酶反應(yīng)熱穩(wěn)定性Fig. 5 Thermostability of purified LipA (filled) and LipB (empty). The recombinant LipA and LipB were incubated in 50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 8.0) at 40 °C (square), 50 °C (triangle), and 60 °C (downwardpointing triangle) for the indicated periods of time, and enzymatic activity was measured using p-NP decanoate as substrate.

3 討論

圖4 重組脂肪酶LipA與LipB酶反應(yīng)最適溫度Fig. 4 Influence of temperature on lipase activity. Activity of LipA (filled square) and LipB (filled triangle) was assayed at pH 8.0 and a range of different temperatures using p-NP decanoate as substrate.

低溫微生物主要分布于冰川、高山及南極等終年保持低溫的環(huán)境中。產(chǎn)脂肪酶低溫微生物多為細(xì)菌與酵母，產(chǎn)脂肪酶低溫真菌中還非常少見[2]。早在1961年，Alford與Pierce[18]就從冷凍的食物樣品中分離到一些嗜冷真菌如解脂假絲酵母 Candida lipolytica、白地霉 Geotrichum candidum與婁地青霉Pencillium roqueforti能產(chǎn)生低溫脂肪酶，但未進(jìn)行深入的研究。Mayordomo等[19]從構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans WG312中純化了一低溫脂肪酶，其最適溫度為40 ℃，但其產(chǎn)量有限，限制了其應(yīng)用，此外并未進(jìn)行基因克隆與表達(dá)研究。本文從冰川土樣中分離得到菌株P(guān)enicillium sp. XMZ-9。利用低溫微生物可特異性地表達(dá)分泌低溫酶的特性[20]，在25 ℃下富集培養(yǎng)，并通過三丁酸甘油酯與維多利亞藍(lán)的篩選平板上的降解圈篩選出了具有較高脂肪水解活性的Penicillium sp. XMZ-9。

從自然界中篩選得到的脂肪酶產(chǎn)生菌中，脂肪酶基因受到較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控，因此脂肪酶的生產(chǎn)量較少，即使通過誘變發(fā)酵后也難以滿足市場(chǎng)的需求[21]。利用基因工程技術(shù)，從脂肪酶產(chǎn)生菌中克隆脂肪酶基因并進(jìn)行異源或同源重組表達(dá)是有效的解決辦法[21]。本文中通過對(duì)已有真菌脂肪酶的多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)真菌源脂肪酶的保守區(qū)：氧陰離子洞 FHGGG與催化活性位點(diǎn)G(F/S)S(A/V)GG。設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用降落PCR，直接從基因組中克隆到了2個(gè)相似性較低的脂肪酶基因片段。隨后通過染色體步移的方法成功克隆了2個(gè)脂肪酶基因。由此可見，采用這一策略是行之有效的獲得完整未知基因方法[22]。

真菌脂肪酶基因中內(nèi)含子的數(shù)目各不相同，對(duì)于有內(nèi)含子的脂肪酶基因的內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)和剪接位置與已確定的絲狀真菌都非常類似[15]，例如長(zhǎng)度一般小于 100 bp，5￠-剪接位點(diǎn)為GTRNGT，3￠-剪接位點(diǎn)為YAG (R：嘌呤堿核苷酸，Y：嘧啶堿核苷酸，N：任意核苷酸)。Penicillium sp. XMZ-9的基因lipA沒有內(nèi)含子，但lipB中存在2個(gè)內(nèi)含子，分別為61 bp與49 bp的內(nèi)含子序列，在其末端都具有內(nèi)含子典型的剪接位點(diǎn)序列5￠-GTGAGT-3￠與5￠-TAG-3￠。

pET表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最為廣泛的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但其表達(dá)產(chǎn)物往往形成無活性的包涵體，如來源于黑曲霉 A. niger F044的脂肪酶Anl[23]。本文中來源于Penicillium sp. XMZ-9的2個(gè)脂肪酶在 pET表達(dá)系統(tǒng)中，一個(gè)表達(dá)為包涵體，一個(gè)則正常表達(dá)為可溶的蛋白，可推斷是否表達(dá)為包涵體可能更取決于目的基因的本身。

低溫脂肪酶是指最適催化反應(yīng)溫度在30 ℃左右，在低溫下仍具有一定活性的脂肪酶[20]。經(jīng)最適溫度與溫度穩(wěn)定性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)重組脂肪酶LipA與LipB的反應(yīng)最適溫度在30℃~40 ℃之間，在20 ℃時(shí)相對(duì)酶活均超過50%，并且在高溫下溫度穩(wěn)定性不好，這都與低溫脂肪酶的基本特征相一致?？沙醪脚卸ǖ玫降?個(gè)基因?yàn)榈蜏刂久富?，這也是與菌株的原始生長(zhǎng)環(huán)境相一致。

低溫脂肪酶以其獨(dú)特性質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景。本文從同一青霉菌中克隆獲得2個(gè)相似性較低的脂肪酶基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)與純化。溫度適應(yīng)性測(cè)定表明2個(gè)重組酶為低溫脂肪酶。本實(shí)驗(yàn)室也繼續(xù)探索采用酵母或黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行分泌表達(dá)，期望獲得更好的低溫脂肪酶表達(dá)工程菌，為下一步的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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