以D-果糖為原料利用新型異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿洛糖

柏瑋，朱玥明，門燕，李曉波，何森健，孫媛霞

天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

在碳水化合物研究領(lǐng)域中，稀少糖是一類重要的研究內(nèi)容。國際糖協(xié)會(huì) (ISRS) 對(duì)稀少糖(Rare sugar) 的定義為“在自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物”[1]。這類糖大多可作為一種低熱量、低吸收的甜味劑，并具有獨(dú)特的生理學(xué)功能，在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域中發(fā)揮著非常重要的功能。例如，D-阿洛酮糖可以改善腸道菌群、降低血糖、抗齲齒等[2-4]，D-阿洛糖具有抑制活性氧、抑制癌細(xì)胞增殖等功能等[5]。

日本的研究學(xué)者Izumori[6]于2002年建立了稀少糖的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)策略，即Izumoring方法。該方法中利用酮糖差相異構(gòu)酶 (Ketose epimerase)、醛糖異構(gòu)酶 (Aldose isomerases) 和多元醇脫氫酶 (Poly dehydrogenase) 進(jìn)行所有單糖及糖醇之間的相互轉(zhuǎn)化。該策略提示給我們一種利用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)稀少糖的方法，即利用天然植物成分或食品工業(yè)中加工副產(chǎn)物淀粉、乳糖為原料經(jīng)過現(xiàn)有成熟工藝獲得木糖、果糖、半乳糖，再通過各種酶的作用獲得稀少糖。在 Izumoring策略中，以天然原料為切入點(diǎn)，有一條關(guān)鍵的切入途徑。即：淀粉→果糖→D-阿洛酮糖。

D-阿洛酮糖是 D-果糖的 C-3差相異構(gòu)體。生物催化轉(zhuǎn)化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖，可以利用的酶包括：D-塔格糖-3-差相異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase，縮寫為 DTE) 和D-阿洛酮糖-3-差相異構(gòu)酶 (D-psicose 3-epimerase，縮寫為DPE)[7-9]。其中，DTE的最適底物是D-塔格糖，而DPE則在底物是D-阿洛酮糖時(shí)發(fā)揮最大的催化活力。目前為止被發(fā)現(xiàn)并表征的D-阿洛酮糖生產(chǎn)酶只有兩種DTE[7,15]和兩種DPE[8,14]。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，來源于C. cellulolyticum H10的DPE基因與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的根癌農(nóng)桿菌 Agrobacterium tumefaciens的DPE基因具有60%的相似性。因此，C. cellulolyticum DPE有潛力成為生產(chǎn)D-阿洛酮糖的第5種C-3-差相異構(gòu)酶。

D-阿洛酮糖與 D-阿洛糖之間的相互轉(zhuǎn)化，是一個(gè)醛酮異構(gòu)反應(yīng)。1998年，Bhuivan等首次利用基因工程獲得的假單胞菌 Pseudomonas stutzeri的 L-鼠李糖異構(gòu)酶 (L-rhamnose isomerase，縮寫為 L-RhI) 進(jìn)行酶固定化和循環(huán)轉(zhuǎn)化生產(chǎn) D-阿洛糖。將 L-RhI固定在殼聚糖BCW-2603珠載體上，加入20% D-阿洛酮糖溶液在40 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，最終約40%轉(zhuǎn)化為D-阿洛糖[10]。然而，L-RhI的最適底物并不是D-阿洛酮糖，而是 L-鼠李糖。大部分的 L-RhI因此并不具備催化生產(chǎn) D-阿洛糖的能力，比如Escherichia coli L-RhI[11]、蒼白芽胞桿菌Bacillus halodurans L-RhI[12]以及海棲熱袍菌Thermotoga maritime L-RhI[13]。開發(fā)新的L-RhI，并研究不同來源的L-RhI催化生產(chǎn)D-阿洛糖的機(jī)理，因此變成一個(gè)十分有趣的課題。

本文克隆了來源于C. cellulolyticum H10的DPE基因以及來源于 Bacillus subtilis 168的L-RhI基因，并分別使其在宿主菌 B. subtilis及E. coli BL21 (DE3) 中得到了表達(dá)。接著，對(duì)表達(dá)后的DPE及L-RhI進(jìn)行了純化。最后對(duì)兩種重組蛋白的催化轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行了試驗(yàn)。打通了以D-果糖為原料轉(zhuǎn)化生產(chǎn) D-阿洛酮糖，最后得到D-阿洛糖的工藝路徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生化試劑

D-果糖、D-阿洛酮糖、D-塔格糖、D-山梨糖、D-阿洛糖等稀少糖均為分析純?cè)噭?，購自Sigma Aldrich。蛋白胨、酵母粉、瓊脂及其他試劑均為分析純。

1.1.2 菌種與質(zhì)粒

對(duì)于DPE基因的克隆來說，質(zhì)粒與宿主菌分別為pMA5 (2) 及B. subtilis WB600。

對(duì)于L-RhI基因的克隆來說，質(zhì)粒與宿主菌分別為pET-21a (+) 與E. coli BL21 (DE3)。

B. subtilis及 E. coli的培養(yǎng)基都是 Luria–Bertani (LB) 培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 DPE基因在B. subtilis中的克隆與表達(dá)

根據(jù)C. cellulolyticum H10的DPE基因序列設(shè)計(jì)引物：上游引物pDPEF和下游引物pDPER。上下游引5￠端分別引入Nde Ⅰ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn) (表1)。并在C端插入了一段6×His標(biāo)簽，以簡化其純化步驟。

DPE的PCR基因片段和表達(dá)載體pMA5用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切反應(yīng)?；厥蘸蟮哪康钠闻c載體用 T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物pMA-DPE轉(zhuǎn)化至B. subtilis WB600中進(jìn)行克隆，PCR篩選陽性克隆，并用雙酶切鑒定，挑取陽性轉(zhuǎn)化子。

插入 pMA-DPE 的重組菌接入 LB-kanamycin培養(yǎng)基 (kanamycin終濃度50 mg/L)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h。

1.2.2 重組DPE蛋白的純化

來源于C. cellulolyticum H10的DPE基因通過基因重組在B. subtilis WB600中表達(dá)，經(jīng)過3個(gè)步驟對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終達(dá)到了電泳純：

1) 粗提取：離心收集重組菌10 min (4 ℃，6 000×g)，棄去上清，并用ddH2O洗滌菌體2次，離心20 min (4 ℃，12 000 r/min)，棄去上清，用破碎緩沖液 (25 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑，pH 8.0) 懸浮，并在冰上超聲破碎細(xì)胞，離心20 min (12 000 r/min，4 ℃)。

表1 PCR引物列表Table 1 PCR primers used in this study

2) 鎳離子親和層析：將上步所得離心上清經(jīng)0.45 μm的膜過濾后，上樣His-Trap鎳離子螯合柱(平衡緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH 8.0)，以高咪唑含量的緩沖液進(jìn)行線性洗脫 (25 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0)。收集目的蛋白。

3) 離子交換色譜：將上步所得溶液經(jīng)超濾脫鹽后，上樣 Source 15Q陰離子交換柱 (GE Healthcare Biosciences) (平衡緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 6.5)，以高NaCl濃度的緩沖液進(jìn)行線性洗脫 (20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 6.5)。收集目的蛋白洗脫峰。

最后用20 mmol/L HEPES (pH 8.0) 的緩沖液將酶溶液超濾脫鹽，并低溫保存。

1.2.3 L-RhI基因在E. coli BL21中的克隆與表達(dá)

根據(jù)B. subtilis 168的L-RhI基因序列設(shè)計(jì)引物：上游引物pRHIF 和下游引物pRHIR。上下游引物5￠端分別引入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。并在C端插入了一段6×His標(biāo)簽，以簡化其純化步驟。

L-RhI的PCR基因片段和表達(dá)載體pET-21a (+) 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和 XhoⅠ進(jìn)行酶切反應(yīng)?；厥蘸蟮哪康钠闻c載體用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物pET-21a-L-RhI轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)中進(jìn)行克隆，PCR篩選陽性克隆，并用雙酶切鑒定，挑取陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入E. coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

插入 pET-21a-L-RhI的重組菌接入 LB-ampicillin培養(yǎng)基 (ampicillin終濃度 100 mg/L)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h。

1.2.4 重組L-RhI蛋白的純化

經(jīng)過3個(gè)步驟對(duì)重組L-RhI表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終達(dá)到了電泳純：

1) 粗提?。弘x心收集重組菌10 min (4 ℃，6 000×g)，棄去上清，并用ddH2O洗滌菌體2次，離心20 min (4 ℃，12 000 r/min)，棄去上清，用破碎緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，0.5%甘油，pH 8.0) 懸浮，并在冰上超聲破碎細(xì)胞，離心20 min (12 000 r/min，4 ℃)。

2) 鎳離子親和層析：將上步所得離心上清經(jīng)0.45 μm的膜過濾后，上樣 His-Trap鎳離子螯合柱 (平衡緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，0.5%甘油，pH 8.0)，以高咪唑含量的緩沖液進(jìn)行線性洗脫 (20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，0.5%甘油，200 mmol/L咪唑pH 8.0)。收集目的蛋白。

3) 離子交換色譜：將上步所得溶液經(jīng)超濾脫鹽后，上樣DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱 (GE Healthcare Biosciences) (平衡緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 6.0)，以高NaCl濃度的緩沖液進(jìn)行線性洗脫 (20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 6.0)。收集目的蛋白洗脫峰。

最后用50 mmol/L Glycine-NaOH (pH 9.0)的緩沖液將酶溶液超濾脫鹽，并低溫保存。

本文所有純化步驟所用系統(tǒng)均為 ?KTA PurifierTM 100 (GE Healthcare Biosciences)。

1.2.5 DPE催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖

底物溶液的配制：在 20 mmol/L HEPE (pH 8.0) 的緩沖液中，加入 D-果糖，配成終濃度10 g/L的溶液。

在500 μL的底物溶液中加入2.5 μg純化后的DPE，于50 ℃的金屬浴中反應(yīng)。在100 ℃的沸水浴中加熱5 min終止反應(yīng)。

1.2.6 L-RhI催化D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛糖

底物溶液的配制：在50 mmol/L Glycine- NaOH (pH 9.0) 的緩沖液中，加入1 mmol/L MnCl2，再加入D-阿洛酮糖，配成終濃度10 g/L的溶液。

在1 mL的底物溶液中加入49.0 μg純化后的L-RhI酶液，于 60 ℃的金屬浴中反應(yīng)。終止反應(yīng)時(shí)加入100 μL三氯乙酸 (10%)。

1.2.7 糖的檢測(cè)

儀器為安捷倫高效液相色譜儀 1200，分析柱：安捷倫 Zorbax 糖分析柱，流動(dòng)相：75%乙腈 (以D-果糖為底物生成D-阿洛酮糖) 或78%乙腈 (以D-阿洛酮糖為底物生成D-阿洛糖)，流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。以Sigma公司生產(chǎn)的D-果糖、D-阿洛酮糖和 D-阿洛糖純品為標(biāo)準(zhǔn)品，將上例得到的樣品進(jìn)行分析，上樣量為5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPE基因的表達(dá)與純化

已有研究報(bào)道了來源于 C. cellulolyticum H10的DPE基因在E. coli中的表達(dá)[11]。然而結(jié)果表明，DPE在E. coli中的表達(dá)量有限，并且表達(dá)產(chǎn)物大部分是包涵體，不能直接用于糖反應(yīng)。這對(duì)DPE基因的表達(dá)體系提出了一個(gè)新的挑戰(zhàn)。用枯草芽胞桿菌作宿主菌，有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1) 枯草芽胞桿菌表達(dá)體系不需要誘導(dǎo)物的加入，一方面節(jié)約了成本，另一方面免去某些誘導(dǎo)物對(duì)人體的毒害；2) 利用枯草芽胞桿菌，可以構(gòu)建分泌型的表達(dá)系統(tǒng)，將目的蛋白分泌到細(xì)胞外部，從而不再需要細(xì)胞的破碎步驟，簡化了操作流程；3) 枯草芽胞桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌，其細(xì)胞膜不均有內(nèi)毒素，對(duì)人體無害，是一種公認(rèn)的食品級(jí)微生物。

本文以枯草芽胞桿菌為宿主菌，對(duì)DPE基因進(jìn)行了表達(dá)。由于DPE基因在組成型表達(dá)啟動(dòng)子HpaⅡ的調(diào)控之下，故不需要外源誘導(dǎo)物的加入。如圖1所示，與空載體對(duì)照，有明顯的目的蛋白條帶 (33 kDa)，且有大量的可溶性蛋白。

圖1 DPE基因在B. subtilis中表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of DPE expressed in B. subtilis. M: protein marker; 1: total cell lysate obtained from a non-expression control of B. subtilis transformed with pMA5; 2: total cell lysate obtained from B. subtilis transformed with pMA5-DPE; 3: the soluble supernatant of B. subtilis transformed with pMA5; 4: the soluble supernatant of B. subtilis transformed with pMA5-DPE.

重組DPE蛋白經(jīng)過His TrapHP親和色譜以及Source15Q陰離子交換色譜之后，純度達(dá)到了電泳純，如圖2所示。重組DPE蛋白的理論分子量約 33 kDa，聚丙烯酰胺凝膠電泳 (12% SDS-PAGE) 的結(jié)果顯示，目的蛋白條帶大小符合預(yù)期。

2.2 L-RhI基因的表達(dá)與純化

將空載體pET-21a (+) 轉(zhuǎn)化到E. coli BL21中，作為對(duì)照與B. subtilis pET-21a-L-RhI同批培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)。由圖 3可知，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)，pET-21a-L-RhI有明顯的目的蛋白條帶 (49 kDa)。將菌體破碎后，分別取上清及沉淀進(jìn)行蛋白電泳后發(fā)現(xiàn)，表達(dá)產(chǎn)物大量為可溶性蛋白，包涵體較少。

重組L-RhI蛋白經(jīng)過His TrapHP親和色譜以及DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜之后，純度達(dá)到了電泳純，如圖4所示。重組DPE蛋白的理論分子量約49 kDa，聚丙烯酰胺凝膠電泳 (12% SDS-PAGE) 的結(jié)果顯示，目的蛋白條帶大小符合預(yù)期。

圖2 重組DPE蛋白的純化Fig. 2 Purification of the recombinant DPE expressed in B. subtilis. M: protein marker; 1: the soluble supernatant of B. subtilis transformed with pMA5-DPE; 2: recombinant DPE purified through Ni column; 3: recombinant DPE purified through Source 15Q column.

圖3 L-RhI基因在E. coli中表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of DPE expressed in E. coli. M: protein marker; 1: total cell lysate obtained from a non-expression control of E. coli BL21 transformed with pET-21a (+); 2: total cell lysate obtained from E. coli BL21 transformed with pET-21a-L-RhI; 3: the soluble supernatant of E. coli BL21 transformed with pET-21a-L-RhI; 4: the inclusion body of E. coli BL21 transformed with pET-21a-L-RhI.

圖4 重組L-RhI蛋白的純化Fig. 4 Purification of the recombinant L-RhI expressed in E. coli. M: protein markers; 1: the soluble supernatant of E. coli transformed with pET-21a-L-RhI; 2: recombinant L-RhI purified through Ni column; 3: recombinant L-RhI purified through DEAE Sepharose Fast Flow column.

2.3 以D-果糖為底物催化生產(chǎn)D-阿洛糖

D-阿洛酮糖是 D-果糖的 C-3差相異構(gòu)體。D-阿洛糖與D-阿洛酮糖互為醛酮異構(gòu)體。從D-果糖到 D-阿洛糖的轉(zhuǎn)化，需經(jīng)過兩步異構(gòu)化反應(yīng) (圖5)。自從2002年Izumoring策略揭示出了以廉價(jià)的果糖生產(chǎn) D-阿洛糖的可能性，許多的研究都致力于找到合適的異構(gòu)酶來完成這兩步轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

圖5 D-果糖、D-阿洛酮糖與 D-阿洛糖間的轉(zhuǎn)化方程式Fig. 5 Reaction scheme among D-fructose, D-psicose and D-allose.

2.3.1 DPE催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖

來源于C. cellulolyticum H10的DPE具備催化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的催化活力 (圖6)。在50 ℃反應(yīng)1 h后，反應(yīng)即達(dá)到了平衡。此時(shí)，D-果糖的轉(zhuǎn)化率為 27.34%。本文還試驗(yàn)了大批量地生產(chǎn)D-阿洛酮糖，在底物溶液中加入了500 g/L的 D-果糖，反應(yīng)的最終轉(zhuǎn)化率也可以達(dá)到24.83%。

實(shí)驗(yàn)證明，重組C. cellulolyticum DPE適用于 D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。其一，其催化反應(yīng)速率高，能短時(shí)間達(dá)到反應(yīng)平衡；其二，其表達(dá)宿主菌是枯草芽胞桿菌，符合食品生產(chǎn)的安全需求。

圖6 以D-果糖為底物反應(yīng)1 h后反應(yīng)液的液相色譜圖Fig. 6 HPLC of the reactants after 1 hour’s reaction using D-fructose as the substrate.

圖7 催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的反應(yīng)過程曲線Fig. 7 Bioconversion of D-fructose into D-psicose using the purified DPE.

2.3.2 L-RhI催化D-阿洛酮糖生產(chǎn)D-阿洛糖

L-RhI是一種醛酮異構(gòu)酸，它可以催化D-阿洛酮糖生產(chǎn)D-阿洛糖。但不是所有來源的L-RhI都具備這種催化活力，它的最適底物是 L-鼠李糖。目前為止，以D-阿洛酮糖為底物生產(chǎn)D-阿洛糖的L-RhI都源自假單胞菌P. stutzeri。

來源于 B. subtilis 168的 L-RhI (GenBank Accession No. AL009126.3) 與P. stutzeri L-RhI (GenBank Accession No. AB121136.1) 的氨基序列相似度不高，只有 17.23%。然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B. subtilis 168 L-RhI具有一定的催化生產(chǎn)D-阿洛糖的能力。如圖 8所示，在 60 ℃反應(yīng)24 h后，有明顯的產(chǎn)物峰D-allose生成，此時(shí)并無其他明顯的產(chǎn)物峰，D-psicose的轉(zhuǎn)化率為34.64%。反應(yīng)48 h后達(dá)到了平衡，此時(shí)底物轉(zhuǎn)化率為37.51% (圖9)。

圖8 以D-阿洛酮糖反應(yīng)24 h后反應(yīng)液的液相圖Fig. 8 HPLC of the reactants after 24hs’ reaction using D-psicose as the substrate.

圖9 催化 D-阿洛酮糖生成 D-阿洛糖的反應(yīng)過程曲線Fig. 9 Bioconversion of D-psicose into D-allose using the purified L-RhI.

3 結(jié)論

本研究將來源于 C. cellulolyticum H10的DPE基因克隆到了宿主菌B. subtilis中，沒有添加任何的外源誘導(dǎo)物，即實(shí)現(xiàn)了重組 DPE蛋白的高效表達(dá)。表達(dá)后的重組 DPE蛋白經(jīng)過鎳親和層析和陰離子交換色譜等方法純化，純度達(dá)到了電泳純。純化后的DPE能高效地催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖，反應(yīng)1 h即可達(dá)到轉(zhuǎn)化率27.34%的反應(yīng)平衡。

研究還克隆了來源于Bacillus subtilis 168的L-RhI基因，并使其在宿主菌E. coli BL21 (DE3)中得到了表達(dá)。純化后的重組L-RhI達(dá)到了電泳純，并具有催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖的催化活力。

實(shí)驗(yàn)證明，利用DPE和L-RhI可以將來源豐富的D-果糖經(jīng)過D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化生成D-阿洛糖，實(shí)現(xiàn)了稀少糖的生物轉(zhuǎn)化。

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