融合酶的設(shè)計(jì)和應(yīng)用研究進(jìn)展

黃子亮，張翀，吳希，蘇楠，邢新會(huì)

清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084

酶是一類能在溫和條件下催化化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì) (絕大部分為蛋白質(zhì))，具有高底物特異性、高產(chǎn)物特異性和高催化效率等特點(diǎn)。酶不但在各種生命活動(dòng)中扮演著重要的角色，而且隨著人類對(duì)各種酶特性的認(rèn)識(shí)加深，其功能被廣泛應(yīng)用于人類生活、醫(yī)藥、環(huán)保和工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域[1]。生命科學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，使人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)不再停留在簡單的應(yīng)用研究上，開始從微觀上探究酶的分子結(jié)構(gòu)、催化特性和機(jī)理，并積累了豐富的酶學(xué)數(shù)據(jù)，如BRENDA數(shù)據(jù)庫目前已經(jīng)收錄了 5 536種酶的催化特性數(shù)據(jù)， PDB數(shù)據(jù)庫收錄了38 315條酶立體結(jié)構(gòu)相關(guān)的記錄。同時(shí)，隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程和分子酶工程、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及宏基因組學(xué)等技術(shù)發(fā)展，不僅大大提高了人們發(fā)現(xiàn)新酶 (特別是挖掘具有工業(yè)應(yīng)用潛力的新酶)的能力[2-3]，而且也提供了更多的改造酶功能的工具，使酶在清潔工業(yè)中的應(yīng)用也進(jìn)入了一個(gè)新的階段，在化學(xué)品生產(chǎn)、食品加工、有機(jī)合成、醫(yī)療保健、檢測、污染治理等方面的成功應(yīng)用案例日益增多 (目前已有超過 300種酶催化過程在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用[4])。

酶催化技術(shù)的核心是酶的高效生產(chǎn)、分離、制劑化和應(yīng)用開發(fā)，但目前酶制劑的生產(chǎn)過程復(fù)雜、成本高是制約酶催化廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問題。因此，酶的高催化活性、高穩(wěn)定性及循環(huán)利用技術(shù)成為構(gòu)建高效低成本酶催化工藝的關(guān)鍵創(chuàng)新方向所在。雖然通過基因工程等手段，可以利用合適的宿主對(duì)酶進(jìn)行高效異源表達(dá)，但實(shí)際生產(chǎn)上還面臨著蛋白可溶表達(dá)效率低、蛋白不穩(wěn)定、分離純化壓力大、活性檢測繁瑣等問題。此外，工業(yè)生物催化中，希望利用的底物或希望得到的產(chǎn)物往往與酶的天然底物/產(chǎn)物不同，一些催化過程還難以在自然界中找到合適的酶。另外，工業(yè)生物催化過程中的環(huán)境 (如高底物濃度、高產(chǎn)物濃度、有機(jī)溶劑等) 與酶合成過程中所處的細(xì)胞環(huán)境有很大差異，天然酶不一定具有實(shí)際催化環(huán)境所要求的耐受性。再者，由于天然酶的穩(wěn)定性有限，且工業(yè)生物催化過程中酶處于不斷“消耗”的過程，因此對(duì)酶的穩(wěn)定性提出了較高的要求。這些都表明需要對(duì)酶的性能進(jìn)行改造和優(yōu)化[1]。

除了傳統(tǒng)的固定化、溶劑工程、過程工程等手段，通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行改造，是目前重要且有效的方法[1]?；谌诤系鞍自O(shè)計(jì)的融合酶技術(shù)是分子酶工程和代謝工程的一個(gè)研究熱點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用于多功能酶和酶靠近效應(yīng)的構(gòu)建與控制研究中，顯示出重要的理論和應(yīng)用研究價(jià)值 (圖 1)。本論文重點(diǎn)綜述融合酶的分子設(shè)計(jì)及其應(yīng)用研究進(jìn)展，并對(duì)今后的發(fā)展趨勢(shì)和需要解決的問題進(jìn)行了展望。

圖1 融合酶在工業(yè)酶過程集成及代謝酶空間靠近效應(yīng)控制中的重要性. (A) 同時(shí)具有可視化信號(hào)、親和吸附和催化功能的融合酶能實(shí)現(xiàn)酶生產(chǎn)、分離、檢測和催化的過程集成. (B) 融合酶能作為調(diào)控代謝酶空間靠近效應(yīng)的一種有力手段Fig. 1 The importance of fusion enzymes in process integration and proximity modulation of metabolic enzymes. (A) Fusion proteins with visible signal, affinity and catalysis functions can realize the process integration for enzyme production, purification, detection and catalysis. (B) Fusion enzymes is a useful tool for modulating proximity of metabolic enzymes.

1 融合酶的概念及其特點(diǎn)

融合酶是指通過一定的手段將目標(biāo)酶和另外一個(gè)或多個(gè)酶 (或蛋白、短肽等) 以一定的形式連接起來，從而獲得的具有多種功能的酶。構(gòu)建融合酶的最直接的優(yōu)勢(shì)之一是可以將多個(gè)蛋白功能集成于一體，實(shí)現(xiàn)酶的多功能化。融合蛋白策略在酶的高效表達(dá)、分離純化、跟蹤定位、快速定量、目標(biāo)靶向等方面已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[5-10]。特別是，通過構(gòu)建具有親和吸附和熒光的多重融合蛋白，可以實(shí)現(xiàn)酶的生產(chǎn)、分離、催化、監(jiān)測等多個(gè)過程的集成，能減少酶制劑的使用成本 (圖1A)[11]，而這正是目前工業(yè)酶催化的瓶頸問題之一。融合酶的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)⒍喾N酶催化活性整合在一個(gè)雜合蛋白上。在大量的順序酶催化 (Sequential catalysis) 過程中，一個(gè)酶的產(chǎn)物 (中間產(chǎn)物) 是下一歩 酶催化反應(yīng)的底物，而這些酶往往處于游離狀態(tài)，特別在細(xì)胞工廠內(nèi)，酶分子之間的距離難以控制，制約了其催化效率。一個(gè)解決思路是通過融合蛋白技術(shù)將多個(gè)參與序列催化反應(yīng)的酶連接，通過調(diào)控其空間靠近效應(yīng)，控制反應(yīng)效率。通過融合酶實(shí)現(xiàn)多酶的空間靠近效應(yīng)，能帶來一系列好處 (圖1B)：1) 強(qiáng)化中間產(chǎn)物在兩個(gè)或多酶之間的傳遞過程；2) 避免了中間產(chǎn)物向主體相的擴(kuò)散；3) 減少了中間產(chǎn)物被其他副反應(yīng)的競爭；4) 減少了中間體不穩(wěn)定性導(dǎo)致的降解；5) 更重要的是增加了中間產(chǎn)物在催化活性中心附近的局部濃度(一般情況下中間產(chǎn)物的平衡濃度遠(yuǎn)低于Km)，從而大大加速了整個(gè)順序催化過程[12-13]。在天然酶中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少在進(jìn)化過程中通過融合不同催化結(jié)構(gòu)域以提高順序催化過程效率的例子[14-17]，多蛋白融合被認(rèn)為是自然界進(jìn)化的一種高級(jí)形態(tài)，表明構(gòu)建融合酶強(qiáng)化酶的空間靠近效應(yīng)是調(diào)控酶催化反應(yīng)效率的極具研究價(jià)值的方向，為代謝工程提供新的手段。

2 融合酶的分子設(shè)計(jì)策略研究進(jìn)展

2.1 直接的順序融合

融合酶最簡單的構(gòu)建方式是直接把兩個(gè)酶的編碼基因首尾相連 (除去第一個(gè)酶的終止密碼子)，構(gòu)成融合酶基因，繼而在合適的宿主中進(jìn)行蛋白表達(dá)得到融合酶 (順序融合，end-to-end fusion，圖2A)[18]。關(guān)于這方面的報(bào)道，之前已經(jīng)有不少研究者對(duì)其做了很好的總結(jié)，在此不再贅述[19-22]。理論上，因?yàn)樾碌玫降娜诤厦阜肿拥囊患?jí)序列包含融合前各個(gè)酶的一級(jí)序列，因此應(yīng)該具有被融合的酶所具有的功能，而且也有不少成功的案例[3,23-25]。然而實(shí)際上，通過這個(gè)方法構(gòu)建得到的融合酶，往往會(huì)導(dǎo)致 (單個(gè)或多個(gè))酶功能的喪失甚至是表達(dá)的失敗[23,26]，其原因可以總結(jié)如下：1) 融合酶基因翻譯后多肽鏈上各個(gè)氨基酸殘基之間的相互作用，比單個(gè)酶 (結(jié)構(gòu)域) 的情況要復(fù)雜得多，編碼不同結(jié)構(gòu)域的多肽片段上的氨基酸殘基相互干擾，有可能打破了某個(gè)結(jié)構(gòu)域正確折疊的過程，從而導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)域乃至整個(gè)融合酶的折疊失敗，最后得到被降解的多肽或者包涵體。2) 與單獨(dú)表達(dá)時(shí)每個(gè)酶的N端和C端處于自由狀態(tài)下不同，融合表達(dá)時(shí)各個(gè)結(jié)構(gòu)域的N端和C端首尾相連，會(huì)影響各個(gè)結(jié)構(gòu)域在這些區(qū)域的折疊和天然構(gòu)象，導(dǎo)致功能受影響。3) 蛋白在催化過程中需要在構(gòu)象上有一定程度的變化和運(yùn)動(dòng)，直接融合將導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域自由度的減少，阻礙這種運(yùn)動(dòng)進(jìn)行，從而使得酶的催化能力下降。4) 某個(gè)結(jié)構(gòu)域和底物的結(jié)合可能在空間上受到其他結(jié)構(gòu)域的屏蔽和阻礙，導(dǎo)致酶-底物親和性下降，同樣催化后也會(huì)影響產(chǎn)物離開活性中心，這些都將影響酶的催化能力[27-28]。鑒于直接順序融合會(huì)導(dǎo)致折疊、表達(dá)和催化等過程出現(xiàn)問題，這種融合策略已經(jīng)逐漸被其他融合策略所取代。

圖2 幾種融合酶的分子設(shè)計(jì)策略示意圖. (A) 直接順序融合. (B) 通過連接肽的順序融合. (C) 插入融合. (D) 分枝融合 (圖中N和C分別表示蛋白的N端和C端)Fig. 2 Several strategies for fusion enzyme design. (A) Direct end-to-end fusion. (B) End-to-end fusion with a linker. (C) Insertional fusion. (D) Branched fusion (N and C denote the N-terminus and C-terminus of the protein, respectively).

2.2 通過連接肽的順序融合

為了解決直接順序融合遇到的問題，研究者提出了各種融合策略，其中在兩個(gè)酶之間引入連接肽 (Linker) 是一種有效的手段，并已經(jīng)被很多研究者所采用 (圖2B)[15,29-32]。連接肽是指兩個(gè)被融合的酶或者結(jié)構(gòu)域之間存在的一段多肽(一般認(rèn)為與酶的催化過程沒有直接聯(lián)系)，其長度從幾個(gè)到上百個(gè)氨基酸殘基不等[33-35]。在自然界發(fā)現(xiàn)的酶分子中，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間也發(fā)現(xiàn)有連接肽的存在，表明這是自然界中產(chǎn)生的這類“融合”蛋白是自然進(jìn)化過程的一種策略[34-36]。連接肽的引入之所以能實(shí)現(xiàn)融合酶的成功表達(dá)，目前一般認(rèn)為是因?yàn)檫B接肽能把兩個(gè)酶 (結(jié)構(gòu)域) 適當(dāng)?shù)母糸_，從而避免了不同結(jié)構(gòu)域在折疊、催化過程中的相互干擾[27,34]。目前已經(jīng)有很多多肽序列 (天然的或者人工設(shè)計(jì)的) 被用作連接肽，以下總結(jié)了近年研究中幾類常見的連接肽類型(表1)。

2.2.1 柔性連接肽

柔性連接肽 (Flexible linker) 是指沒有形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力的連接肽，這類連接肽在空間上一般是以無規(guī)卷曲的形式存在[27-28]。其中，聚甘氨酸或者富含甘氨酸的連接肽是典型的柔性連接肽，這種連接肽能增加蛋白的可溶性，抗蛋白酶降解，并能提供催化過程中蛋白所需的柔性，使各個(gè)結(jié)構(gòu)域不相互干擾，因此得到非常廣泛的應(yīng)用[27-28,37]。最為典型的柔性連接肽是Huston等提出的 (GGGGS)n(一般n≤6)[32,38-39]，已經(jīng)幾乎成為一種“通用連接肽”。Lu等在構(gòu)建β-葡聚糖酶 (Glu) 和木聚糖酶 (Xyl) 的融合酶的研究中發(fā)現(xiàn)，若不使用連接肽，融合酶的Xyl活性的催化效率會(huì)有 31%的下降 (與單獨(dú)表達(dá)的Xyl相比，下同)，而引入 (GGGGS)2連接肽后，Xyl的催化效率有43%的提高，Glu的催化效率也比沒有連接肽的情況下更高[25,31]。雖然(GGGGS)n一類的柔性連接肽已經(jīng)在很多融合體系中成功應(yīng)用，但這種連接肽也存在諸多不足，譬如容易被蛋白酶降解，對(duì)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的隔離效果不穩(wěn)定等，在一些體系中導(dǎo)致融合酶表達(dá)和催化的失敗[40-42]。

2.2.2 能形成α螺旋的連接肽

自Maeda等在構(gòu)建蛋白G和熒光素酶融合酶的工作中成功應(yīng)用一個(gè)來自葡萄球菌蛋白 A的α-集束結(jié)構(gòu)域作為連接肽，能形成α螺旋的多肽才開始被接受并作為連接肽使用[42]。雖然蛋白A的α-集束能有效隔開兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，但作為連接肽對(duì)融合酶來說太大，會(huì)增加蛋白表達(dá)的負(fù)擔(dān)和風(fēng)險(xiǎn)。Maeda等后來采用 (EAAAK)n(一種能形成α螺旋的結(jié)構(gòu))[43]，同樣成功實(shí)現(xiàn)了融合酶的活性表達(dá)。Arai等通過進(jìn)一步研究 (EAAAK)n在融合蛋白中的構(gòu)象，證實(shí)了 (EAAAK)n能形成螺旋結(jié)構(gòu)，而且隨著 (EAAAK)n中結(jié)構(gòu)單元數(shù)目 n的增多，兩個(gè)相連的結(jié)構(gòu)域之間的距離越大[40-41]。與 (GGGGS)n相比，(EAAAK)n的優(yōu)勢(shì)在于能形成相對(duì)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，能給兩個(gè)相連的結(jié)構(gòu)域提供相對(duì)穩(wěn)定且可控的隔離效果；而(GGGGS)n類型的連接肽，即使增加其重復(fù)單元數(shù)目，但結(jié)構(gòu)域間的距離變化不大，且(GGGGS)n提供的隔離效果在不同體系中變化較大[40]。在蛋白穩(wěn)定性方面，因?yàn)?(EAAAK)n不是舒展的構(gòu)象，在一定程度上減少了蛋白酶攻擊的可能性，使得融合蛋白較為穩(wěn)定；而(GGGGS)n的舒展構(gòu)象有可能使其成為蛋白酶切割位點(diǎn)，導(dǎo)致融合蛋白的不穩(wěn)定[37]。Amet等在不同融合蛋白中引入 (EAAAK)2，發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量能分別提高1.7~11.2倍[44]。本研究組在構(gòu)建肝素酶 (HepA)、麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP) 和綠色熒光蛋白 (GFP) 的融合蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在MBP和GFP之間引入柔性連接肽 (GGGGS)3時(shí)，不能得到全長的目標(biāo)蛋白；而MBP和GFP之間采用剛性連接肽 (EAAAK)3則能實(shí)現(xiàn)融合蛋白的高效表達(dá)[45]，表明α螺旋連接肽在融合蛋白表達(dá)和折疊上的優(yōu)勢(shì)。但是連接肽的屬性，特別是剛/柔性對(duì)融合酶的性能影響規(guī)律目前了解得十分有限，融合酶的設(shè)計(jì)仍是個(gè)案處理 (Case by case)，缺乏理論依據(jù)和指導(dǎo)。

2.2.3 抗蛋白酶降解的連接肽

(GGGGS)n最初被認(rèn)為是能抵抗蛋白酶降解的一種結(jié)構(gòu)，但后來被各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)并非如此[37]，這也能看出抗蛋白酶降解是人們希望連接肽具有的一種重要特性，對(duì)于融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)和催化有著重要意義。富含脯氨酸的多肽特別是脯氨酸-蘇氨酸 (PT) 重復(fù)序列經(jīng)常被用作連接肽的一個(gè)原因就是其被證實(shí)具有明顯的抗蛋白酶降解性，而且經(jīng)常出現(xiàn)在天然多結(jié)構(gòu)域蛋白中作為連接肽[33,37]。譬如很多天然的纖維素酶和木聚糖酶就是通過 (PT)nP結(jié)構(gòu)的多肽來連接其催化模塊和碳水化合物結(jié)合模塊 (CBM)，其連接肽已經(jīng)被證明對(duì)纖維素和木聚糖的降解非常重要[46-47]。除了從天然蛋白中尋找抗降解的連接肽外，另外一個(gè)策略就是通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)人工連接肽，使其具有抗蛋白酶降解的性能。如通過MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫，根據(jù)在表達(dá)宿主中已知的蛋白酶切割位點(diǎn)信息來進(jìn)行連接肽設(shè)計(jì)以及切割位點(diǎn)的預(yù)測[48-49]。Kavoosi等在CBM-GFP融合體系中，比較了常見的 (GGGGS)n，天然的(PT)nP和通過MEROPS設(shè)計(jì)的S3N10等連接肽的效果，發(fā)現(xiàn)S3N10和 (PT)nP均有很好的抗蛋白酶降解作用，而 (GGGGS)n上有不少位點(diǎn)受到了蛋白酶的切割[37]。

表1 不同類型連接肽的特點(diǎn)Table 1 Characteristics of different types of linkers

2.3 插入融合

相比于目前廣泛采用的順序融合，插入融合(Insertional fusion) 是融合蛋白的一種有趣的選擇模式，而且在酶催化的調(diào)控上有著其他融合方式所不具備的優(yōu)勢(shì)，并逐漸被作為一種新的功能整合方式應(yīng)用在不同場合，具有巨大潛在的研究和應(yīng)用價(jià)值 (圖2C)[18,50-54]。插入融合蛋白是指一個(gè)客體結(jié)構(gòu)域被插入到一個(gè)主體結(jié)構(gòu)域內(nèi)部形成的融合蛋白。插入融合的設(shè)計(jì)較順序融合困難，因?yàn)樾枰紤]融合后兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的相互空間結(jié)構(gòu)。一般來說，成功的插入融合需要滿足兩方面的條件，即客體結(jié)構(gòu)域在天然構(gòu)象中其C端和N端在空間上要足夠靠近，以及主體結(jié)構(gòu)域能承受由于客體的插入導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)域不連續(xù)所帶來的影響。這些看似苛刻的條件實(shí)際上沒有那么難以滿足[55]。首先，基于對(duì)PDB數(shù)據(jù)庫中已知結(jié)構(gòu)蛋白的分析，約 50%的蛋白均具有靠近的 C端和N端 (距離小于5?)，從而能滿足被插入的空間要求[56]。另外，不連續(xù)結(jié)構(gòu)域 (結(jié)構(gòu)域的線性序列被另一結(jié)構(gòu)域序列插入其中) 在自然界的蛋白中很常見。Jones等對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的一個(gè)系統(tǒng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，28%的蛋白結(jié)構(gòu)域都是不連續(xù)的[57]。這些發(fā)現(xiàn)都為插入融合的結(jié)構(gòu)域提供了廣闊的選擇空間。Ehrmann等將堿性磷酸酶PhoA插入到跨膜蛋白MalF中，首次成功獲得同時(shí)具有兩者活性的插入融合蛋白[58]，隨后更多的蛋白組合被發(fā)現(xiàn)能用于插入融合。Doi等構(gòu)建了將β-內(nèi)酰胺酶 (BLA) 插入到GFP的融合，通過控制 BLA的抑制蛋白 (BLIP) 的水平，實(shí)現(xiàn)了對(duì)GFP熒光的調(diào)控[18]。Guntas等將BLA插入到MBP，通過麥芽糖濃度改變MBP構(gòu)象，從而實(shí)現(xiàn)BLA活性在0.16%~100%之間 (600-fold) 的調(diào)控，展示了插入融合作為分子開關(guān)的巨大潛力[59]。還有很多研究小組發(fā)現(xiàn)插入融合酶的構(gòu)建在催化調(diào)控和分子傳感器等方面有巨大的潛在價(jià)值[60-61]。盡管基因組學(xué)和蛋白組學(xué)為插入融合提供了豐富的蛋白結(jié)構(gòu)域信息和物質(zhì)基礎(chǔ)，但插入融合仍面臨一些關(guān)鍵問題，譬如如何選擇兩個(gè)蛋白使其融合之后能具有調(diào)控的效果，以及插入位點(diǎn)的選擇。雖然通過計(jì)算模擬可以對(duì)其進(jìn)行預(yù)測，但目前人們對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)和相互作用的認(rèn)識(shí)還難以做到很好的預(yù)測。

2.4 蛋白水平融合和分枝融合

作為構(gòu)建和設(shè)計(jì)融合酶的一種策略，除了在基因水平進(jìn)行融合外，也可在蛋白質(zhì)水平對(duì)酶進(jìn)行直接融合。在蛋白水平進(jìn)行融合的優(yōu)勢(shì)在于：1) 融合酶基因的表達(dá)有可能因形成包涵體等原因?qū)е虏荒塬@得有活性的融合酶或者產(chǎn)量、活性低，而蛋白水平的融合則不涉及融合酶基因的表達(dá)和折疊；2) 在目標(biāo)蛋白的基因無法獲取的情況下 (如一些抗體)，或者需要構(gòu)建非天然結(jié)構(gòu)的情況下 (如分枝結(jié)構(gòu)等非線性結(jié)構(gòu))，基因水平融合無法實(shí)現(xiàn)融合酶的構(gòu)建，只能利用蛋白水平的融合。特別是在構(gòu)建多重融合酶的情況下，蛋白水平融合將具備更加明顯優(yōu)勢(shì)[62]。將兩個(gè)蛋白進(jìn)行融合 (或交聯(lián)) 有多種方法，其中通過酶法進(jìn)行融合是最有效的方法[63]，而能催化這類蛋白-蛋白融合的酶主要有谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶 (TGase)、轉(zhuǎn)肽酶 (如分選酶)，以及一些氧化還原酶 (酪氨酸酶、漆酶、過氧化物酶)[63-68]。分枝融合(Branched fusion) 正是利用蛋白-蛋白融合技術(shù)發(fā)展出來的一種新的融合方式 (圖 2D)。與順序融合相比，分枝融合在構(gòu)建多元融合蛋白上有著明顯的優(yōu)勢(shì)：各個(gè)結(jié)構(gòu)域的空間分布更均勻，空間位阻和干擾更少，更利于多個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的電子傳遞和反應(yīng)中間體傳遞等。Hirakawa等利用TGase，成功構(gòu)建了一個(gè)三元分枝融合蛋白 (包括單加氧酶細(xì)胞色素 P450，電子傳遞蛋白假單胞氧還蛋白Pdx，以及Pdx還原酶)。與3個(gè)酶等量混合的體系相比，分枝融合酶在3個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的電子傳遞效率和初始反應(yīng)速率上都有了極大的提升[69-70]。Schoffelen等構(gòu)建了一個(gè)具有分枝結(jié)構(gòu)的多重融合酶 (含5個(gè)結(jié)構(gòu)域)，包括植物次級(jí)代謝產(chǎn)物云杉新甙合成途徑相關(guān)的 3個(gè)酶(對(duì)稱二苯代乙烯合成酶、4-香豆酸輔酶 A連接酶和糖基轉(zhuǎn)移酶)。他們的結(jié)果表明該融合酶能在體外環(huán)境以對(duì)香豆酸為前體物合成云杉新甙，表明了分枝融合酶在多步催化過程中的應(yīng)用潛力，是對(duì)順序融合酶的有力補(bǔ)充[62]。但這類融合方法的局限性也是明顯的，如 1) 融合方法的局限性比較大，且連接肽中需要引入特定的氨基酸作為酶的識(shí)別位點(diǎn)，給連接肽設(shè)計(jì)帶來限制；2) 目標(biāo)酶分子中有可能存在催化融合過程的酶的作用位點(diǎn)，導(dǎo)致融合過程不能特異性地進(jìn)行；3) 催化融合過程是一個(gè)多酶混合體系，如融合效率不足以使得大部分酶實(shí)現(xiàn)融合，殘留的目標(biāo)蛋白會(huì)對(duì)后面的應(yīng)用造成干擾，同時(shí)催化融合的酶也可能帶來影響。

2.5 其他融合方式

分子酶工程、蛋白質(zhì)工程、結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，以及對(duì)新酶、新蛋白質(zhì)的開發(fā)和發(fā)現(xiàn)，都推動(dòng)著融合酶分子設(shè)計(jì)的快速發(fā)展，以上只是針對(duì)其中較為系統(tǒng)的幾種融合酶分子設(shè)計(jì)策略進(jìn)行介紹，此外還有很多值得關(guān)注的設(shè)計(jì)策略，如對(duì)嗜熱酶的使用[3,23-24]、功能多肽的應(yīng)用[7-8,71]、以及對(duì)連接肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)等[72-73]，都能為融合酶的設(shè)計(jì)提供很好的工具。但這些方法目前成功的研究案例有限，需要更多的深入細(xì)致的研究。

3 融合酶的應(yīng)用研究進(jìn)展

融合酶可以把原屬多個(gè)不同酶 (或蛋白) 的功能整合到一個(gè)酶中，除了能實(shí)現(xiàn)酶的多功能化集成外，另一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)是可以改變多個(gè)酶(結(jié)構(gòu)域) 之間的空間組織關(guān)系 (一般指距離和取向)，這在由多個(gè)酶依次催化的順序反應(yīng)(Sequential reactions) 中尤為重要。其中，通過改變多個(gè)酶 (結(jié)構(gòu)域) 的空間距離產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)(空間靠近效應(yīng)) 的研究案例近年快速增多。多酶空間靠近效應(yīng)主要可能優(yōu)勢(shì)是這種融合酶促進(jìn)了“底物傳遞”效應(yīng)，即催化過程中一個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物作為下一反應(yīng)的底物 (中間產(chǎn)物) 在這兩個(gè)催化活性位點(diǎn)之間的直接傳遞，減少了中間產(chǎn)物向體系主體相的擴(kuò)散，從而增加了中間產(chǎn)物的局部濃度，提高反應(yīng)效率 (很多反應(yīng)其 Km值遠(yuǎn)大于底物在主體相中的平衡濃度)；底物傳遞也能防止中間產(chǎn)物流向其他競爭反應(yīng)，或者防止酶的活性位點(diǎn)被其他非目標(biāo)底物所占據(jù)；兩個(gè)活性位點(diǎn)間傳遞時(shí)間的縮短也能減少中間產(chǎn)物因自身不穩(wěn)定導(dǎo)致的降解。下面對(duì)融合酶在一些實(shí)際體系中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

3.1 木質(zhì)纖維素等生物質(zhì)多糖降解上的應(yīng)用

地球上每年都會(huì)產(chǎn)生數(shù)量驚人的多糖類生物質(zhì)，如通過植物光合作用每年就能產(chǎn)生多達(dá)4×1010t的纖維素，同時(shí)其他多糖如木質(zhì)素、淀粉、木聚糖的生產(chǎn)量也非常大[74]。生物質(zhì)多糖是一類碳?xì)浠衔铮ㄟ^一定的加工過程可以轉(zhuǎn)化成燃料、化工原料、化學(xué)品、醫(yī)藥制品等非常有應(yīng)用價(jià)值的一系列產(chǎn)品，因此在石油等不可再生資源日益匱乏的今天，對(duì)多糖等生物質(zhì)的開發(fā)和利用是非常有意義的。然而由于多糖的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，很難對(duì)其直接進(jìn)行利用，一般只能先對(duì)多糖進(jìn)行必要的預(yù)處理，降解成小分子的糖才能加以利用。多糖的降解可以通過物理法、化學(xué)法以及生物法實(shí)現(xiàn)，但生物法有著其他兩者不可比擬的優(yōu)勢(shì) (如條件溫和，環(huán)境友好，單位能耗低，副產(chǎn)物少等)，能滿足當(dāng)今社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的需求，其應(yīng)用日益廣泛。生物法一般是通過酶的作用對(duì)多糖進(jìn)行降解，由于纖維素等多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及酶作用的專一性，需要多種酶的共同作用才能完成，如纖維素水解需要葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、β-糖苷酶等。與各個(gè)酶單獨(dú)作用相比，融合酶具有更高的催化效率，這也是自然界中進(jìn)化的一個(gè)方向。An等通過順序融合構(gòu)建了熱纖梭菌Clostridium thermocellum的木聚糖酶 (Xyn)和菊果膠桿菌Pectobacterium chrysanthemi的纖維素酶 (Cel) 的融合酶，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cel融合在Xyn下游時(shí)，兩個(gè)酶的活性都能保持，但當(dāng)Xyn融合在Cel下游時(shí)，卻導(dǎo)致了兩者活性的喪失[74]。Lu 等通過構(gòu)建解淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens的葡聚糖酶和枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的木聚糖酶的融合酶，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。融合酶同時(shí)具有葡聚糖酶和木聚糖酶兩種活性，與單獨(dú)表達(dá)的酶相比，葡聚糖酶催化效率提高了3.15倍，但木聚糖酶催化效率下降了 31% (kcat/Km)。通過進(jìn)一步對(duì)兩結(jié)構(gòu)域之間的連接肽進(jìn)行優(yōu)化，Lu等發(fā)現(xiàn)在連接肽為(GGGGS)2時(shí)，融合酶的葡聚糖酶和木聚糖酶的催化效率分別提高了326%和43% (與單獨(dú)酶相比)[25,31]。這些例子顯示出融合酶在生物質(zhì)多糖水解上的應(yīng)用價(jià)值以及融合策略的重要性。另外，也可以通過將多糖降解和下游轉(zhuǎn)化的酶進(jìn)行融合，提高從多糖生產(chǎn)其他化學(xué)品的效率。Wang等構(gòu)建了兩個(gè) β-淀粉酶 (BA) 和海藻糖合成酶(TS) 的融合酶 (TSBA和BATS)，BA能把淀粉降解成小分子的麥芽糖，后者能被海藻糖合成酶作為底物利用，從而實(shí)現(xiàn)一步法從淀粉生產(chǎn)海藻糖。與單酶混合相比，融合酶TSBA和BATS的催化效率分別提高了3.4和2.4倍[15]，顯示出了融合酶技術(shù)應(yīng)用在順序催化反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。

此外，一些在醫(yī)藥和臨床領(lǐng)域上具有重要意義的生物多糖如肝素和硫酸軟骨素等，其降解產(chǎn)生的低分子量產(chǎn)物被證實(shí)具有比其降解前的大分子形式更強(qiáng)的藥理活性、更好的療效、更容易被人體吸收等諸多優(yōu)勢(shì)，因此低分子量肝素和硫酸軟骨素的生產(chǎn)方法逐漸成為研究的熱點(diǎn)[45,75-76]。其中，酶法降解具有反應(yīng)條件溫和、清潔、高效、特異性強(qiáng)、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是其他方法所不能比擬的[45,76]。然而降解肝素和硫酸軟骨素所需的肝素酶和硫酸軟骨素酶目前主要從野生菌中分離提取，其產(chǎn)量低、質(zhì)量不穩(wěn)定、純化難度大、成本高，無法實(shí)現(xiàn)酶的高效生產(chǎn)。本研究組利用MBP蛋白具有分子伴侶作用，能促進(jìn)與之融合的蛋白的可溶表達(dá)等特點(diǎn)，構(gòu)建了肝素酶Ⅰ (HepA) 和MBP的融合酶，成功克服了肝素酶異源表達(dá)中容易形成包涵體等問題，首次實(shí)現(xiàn)了HepA的高效可溶異源表達(dá)[77]。同時(shí)，利用MBP的親和吸附特性，HepA能實(shí)現(xiàn)便捷、高效的一步純化，大大降低了酶分離提取的難度與成本[6]。進(jìn)一步，通過構(gòu)建HepA，MBP和GFP的三重融合蛋白，利用GFP的熒光能快速定量HepA的酶活，從而實(shí)現(xiàn)HepA的生產(chǎn)、純化、檢測和催化的過程集成，進(jìn)一步降低了HepA酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用成本[11,45,78-82]。另外，本研究組對(duì)肝素酶Ⅱ、Ⅲ，以及硫酸軟骨素酶和MBP的融合蛋白也進(jìn)行了深入的研究，通過采取構(gòu)建融合酶的策略，也成功實(shí)現(xiàn)了這些酶的高效生產(chǎn)、純化和催化，表明融合酶在肝素、硫酸軟骨素等多糖裂解上具有重要的研究與應(yīng)用價(jià)值[83-84]。

3.2 手性催化-輔酶再生偶聯(lián)體系中的應(yīng)用

氧化還原酶的一個(gè)重要應(yīng)用是通過其不對(duì)稱氧化/還原，從前手性化合物生成相應(yīng)的手性化合物，這些手性化合物很多是具有商業(yè)價(jià)值的醫(yī)藥中間體、工業(yè)有機(jī)材料以及農(nóng)用化學(xué)品[38,85-86]。大部分氧化還原酶的催化都需要輔酶 (如NADH，NADPH)，然而考慮到輔酶昂貴的價(jià)格，要實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)可行的工業(yè)催化就必須要有高效的原位輔酶再生方法。目前最常用的方法是通過和另外一個(gè)氧化還原酶偶聯(lián)，利用廉價(jià)的底物對(duì)輔酶進(jìn)行再生[87-88]。通過構(gòu)建手性催化和輔酶再生的融合酶，可以大大縮短輔酶在兩個(gè)催化中心之間傳遞的時(shí)間，減少輔酶在體系的擴(kuò)散和降解，提高其局部有效濃度，從而可以提高手性催化和輔酶再生的效率[89-90]，近年來有不少這方面的相關(guān)報(bào)道。亞磷酸脫氫酶 (PTDH) 能以廉價(jià)的亞磷酸鹽作為底物實(shí)現(xiàn) NADPH的再生，Torres Pazmi?o等構(gòu)建了一系列B-V單加氧酶 (BVMOs)和PTDH的融合酶，在NADP濃度只有5 μmol/L時(shí)，仍能實(shí)現(xiàn)苯丙酮到乙酸芐酯的有效轉(zhuǎn)化(79%，3 h)，同時(shí)融合后各個(gè)酶都能保持天然酶的催化活性，表明了通過融合酶進(jìn)行手性催化的可行性[90]。H?lsch等構(gòu)建了甲酸脫氫酶(FDH) 和3-酮?；?ACP還原酶 (KR) 的融合酶進(jìn)行手性醇生產(chǎn)，與兩個(gè)酶混合物相比，初始催化速度提高了 2倍，底物轉(zhuǎn)化率能達(dá)到99.97%，并且具有極高的光學(xué)選擇性 (99.9% (S) -1- (pentafuorophenyl) ethanol)[38]。本研究組也曾報(bào)道過利用手性醇脫氫酶 (ReADH) 與甲酸脫氫酶 (CbFDH) 構(gòu)建融合蛋白以高效生產(chǎn)手性芳基醇的研究，并對(duì)ReADH和CbFDH的不同融合順序進(jìn)行了研究和探討。研究結(jié)果表明，融合位點(diǎn)和融合順序?qū)τ赗eADH和CbFDH的活性都有很大影響，其中CbFDH的C端融合會(huì)導(dǎo)致活性喪失，而N端融合則對(duì)活性沒有顯著影響；ReADH的C端融合和N端融合都能保持一定的活性，但N端融合時(shí)活性最高。特別地，當(dāng)ReADH的C端和CbFDH的N端進(jìn)行融合時(shí)(ReADH-CbFDH)，融合蛋白同時(shí)具有兩者的活性，能實(shí)現(xiàn)催化與輔酶再生的雙重功能[88]。

3.3 代謝途徑調(diào)控中的應(yīng)用

在利用微生物細(xì)胞工廠進(jìn)行化學(xué)品生產(chǎn)中，通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)的代謝流進(jìn)行有目的的調(diào)控，能夠顯著地提高底物的轉(zhuǎn)化率和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[91-94]。其中，通過構(gòu)建合成途徑中多個(gè)酶的融合酶，可對(duì)催化多步反應(yīng)的酶在細(xì)胞內(nèi)的空間組織進(jìn)行改造 (如使酶相互靠近或調(diào)整其相互取向)，這已經(jīng)成為對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝流進(jìn)行調(diào)控的重要手段[3,89,95-97]。合成途徑上各個(gè)酶的空間靠近性 (Enzyme proximity) 對(duì)中間產(chǎn)物的流向有著重要的影響，特別是在以下幾種情況中：1) 中間產(chǎn)物有其他競爭反應(yīng)；2) 中間產(chǎn)物不穩(wěn)定；3) 中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性或者對(duì)酶存在反饋抑制；4) 其他非目的底物對(duì)酶有競爭[13]。在這些情況中，通過構(gòu)建融合酶，拉近合成途徑中的兩個(gè) (或多個(gè)) 酶的空間距離，減少中間產(chǎn)物的流失，可以有效提高產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率和底物轉(zhuǎn)化率。

Albertsen等在釀酒酵母中引入來自廣藿香Pogostemon cablin的廣藿香醇合成酶 (PTS)，利用酵母細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的法尼基焦磷酸 (FPP) 作為起始物生產(chǎn)廣藿香醇。但因?yàn)榻湍竷?nèi)的FPP會(huì)被細(xì)胞內(nèi)多個(gè)其他代謝途徑競爭，導(dǎo)致流向廣藿香醇生產(chǎn)的FPP通量很少。通過在胞內(nèi)過量表達(dá)法尼基焦磷酸合酶 (FPPS) 和PTS的融合酶，能增加FPP流向PTS的通量，從而使得廣藿香醇的產(chǎn)量提高為原來的2倍[13]。

香葉基香葉醇 (GGOH) 是一種昂貴的香水和醫(yī)藥品的原材料，Tokuhiro等為了利用酵母細(xì)胞生產(chǎn)GGOH，構(gòu)建了其合成途徑上的香葉基香葉基焦磷酸合酶 (BTS1) 和甘油二酯焦磷酸磷酸酶 (DPP1) 的融合酶BTS1-DPP1。與同時(shí)單獨(dú)過表達(dá) BTS1和 DPP1相比，過表達(dá)融合酶BTS1-DPP1能更有效地提高細(xì)胞內(nèi)GGOH的產(chǎn)量。他們進(jìn)一步過表達(dá)融合酶 BTS1-ERG20 (ERG20為法尼基焦磷酸合酶，是GGOH合成途徑上的另一個(gè)關(guān)鍵酶)，發(fā)現(xiàn)原來的主產(chǎn)物鯊烯產(chǎn)量從191.9 mg/L下降到6.5 mg/L，而目標(biāo)產(chǎn)物GGOH則從0.2 mg/L上升到228.8 mg/L。最后，通過同時(shí)過表達(dá) HMG1，BTS1-DPP1和 BTS1-ERG20，使得 GGOH產(chǎn)量能進(jìn)一步達(dá)到3.31 g/L[98]。

Zhou等對(duì)具有轉(zhuǎn)化香葉基香葉基焦磷酸(GGPP) 合成丹參酮前體二萜化合物次丹參酮二烯的功能的兩個(gè)酶SmCPS和SmKSL進(jìn)行融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在酶靠近的情況下，合成最終代謝產(chǎn)物的通量更大。進(jìn)一步，對(duì) SmCPS和 SmKSL融合酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子模擬，發(fā)現(xiàn)不同融合方式導(dǎo)致催化中心空間距離差異，為解釋代謝途徑的性能提供了理論支持[99]。SmCPS和SmKSL都是多亞基蛋白，該研究開啟了多亞基代謝融合酶在微生物代謝工程中應(yīng)用的新方向。

這些例子表明，通過構(gòu)建代謝途徑上的融合酶，是調(diào)控途徑通量的有效手段，已經(jīng)成為代謝工程的一個(gè)重要工具。同時(shí)，結(jié)合傳統(tǒng)代謝調(diào)控的手段，利用融合酶技術(shù)能成為進(jìn)一步提高產(chǎn)品產(chǎn)量的有力方法[13]。

另外，當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物是一種對(duì)細(xì)胞有毒性的物質(zhì)時(shí)，往往產(chǎn)率很低甚至很難通過微生物細(xì)胞進(jìn)行直接生產(chǎn)。通過構(gòu)建具有催化產(chǎn)物生成和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化功能的融合酶，可以迅速將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為毒性較少或者無毒的衍生物，最大限度地減少了產(chǎn)物毒性的影響 (與兩種酶單獨(dú)表達(dá)相比)，從而提高細(xì)胞生產(chǎn)效率。香蘭素是目前工業(yè)過程生產(chǎn)的最重要的芳香化合物之一，在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)香蘭素最大的問題是即使很低濃度的香蘭素都能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性。為了減少香蘭素的毒性，Albertsen在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)氧甲基轉(zhuǎn)移酶 (OMT，催化香蘭素合成途徑最后一步的酶) 和 UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶 (UGT，對(duì)香蘭素進(jìn)行糖基化修飾以解除毒性) 的融合酶。與同時(shí)單獨(dú)表達(dá) OMT和 UGT相比，香蘭素的糖基化產(chǎn)物VG在細(xì)胞內(nèi)的積累速度明顯加快，香蘭素胞內(nèi)濃度則減少了40%，使得細(xì)胞生長速率提高了14%，表明融合酶的手段能有效解除產(chǎn)物 (或中間產(chǎn)物) 的毒性，提高細(xì)胞生產(chǎn)效率[100]。

4 結(jié)論與展望

隨著分子生物學(xué)以及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，融合酶的構(gòu)建策略早已打破順序融合的單一局面，并且產(chǎn)生出多元化的發(fā)展趨勢(shì)，如連接肽、插入融合、分枝融合等；新的融合策略的出現(xiàn)和發(fā)展，結(jié)合各自的優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)大了融合酶的應(yīng)用領(lǐng)域，同時(shí)也在原有的應(yīng)用領(lǐng)域上帶來了新的變革。

縱觀融合酶領(lǐng)域的現(xiàn)狀，融合酶的發(fā)展方向主要集中在兩方面。一是多功能化。具有特殊功能的新酶或者融合伴侶 (多肽或者蛋白) 的發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)融合酶在多功能化方面的發(fā)展，從而使得更加多樣化的功能可以在目標(biāo)蛋白上實(shí)現(xiàn)；另外，對(duì)極端微生物資源的開發(fā)和利用，以及蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，有可能給融合酶性能帶來飛躍，使融合酶的應(yīng)用更加廣泛。二是多結(jié)構(gòu)域化。僅僅通過酶的過量表達(dá)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)不足以使得外源途徑成為細(xì)胞的主導(dǎo)途徑，融合酶能通過控制(原本獨(dú)立的) 多個(gè)酶之間的空間組織，實(shí)現(xiàn)代謝途徑的調(diào)控 (空間靠近效應(yīng))，無論在in vitro還是in vivo體系都具有明顯的優(yōu)勢(shì)。然而目前蛋白的融合一般停留在兩個(gè)單亞基酶的組合，對(duì)途徑調(diào)控的復(fù)雜性和力度有限，而且也不能滿足對(duì)多亞基酶的調(diào)控。最近，有一些研究小組開始進(jìn)行多亞基酶以及多個(gè)酶的融合，并取得了重要的成果[62-63, 99, 101]。

雖然相比于天然酶 (單一酶或者多種酶混合)，融合酶的構(gòu)建能帶來功能上和應(yīng)用上的眾多優(yōu)勢(shì)，但在其構(gòu)建和應(yīng)用過程中，往往會(huì)出現(xiàn)蛋白不能表達(dá)、蛋白不能正確折疊、蛋白不穩(wěn)定以及酶原來的活性受到損失甚至喪失等問題。這些問題的根源在于目前對(duì)融合酶各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相互影響及其分子機(jī)理還缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。通過選擇不同的融合策略能在一定程度上調(diào)整結(jié)構(gòu)域之間的空間關(guān)系，從而改變?nèi)诤厦阜肿又薪Y(jié)構(gòu)域之間的相互作用情況以解決問題；但這些手段只能實(shí)現(xiàn)有限的幾種調(diào)整，且不能實(shí)現(xiàn)較為精細(xì)的調(diào)控 (在多結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜融合體系中尤為重要)。同時(shí)，對(duì)于融合策略的選擇尚沒有可靠的理論指導(dǎo)，目前只能采取試錯(cuò)辦法。因此融合酶今后的發(fā)展方向在于兩方面。一方面，可以利用分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)融合酶進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和機(jī)理解析。雖然目前還難以對(duì)大分子進(jìn)行精確的模擬[99]，但隨著算法和計(jì)算能力的發(fā)展，其在預(yù)測和研究結(jié)構(gòu)域相互作用中將會(huì)發(fā)揮越來越重要的作用，為融合酶構(gòu)建策略提供理論指導(dǎo)。另一方面，連接肽在各種融合方式中都是關(guān)鍵元件，且其可變性遠(yuǎn)大于酶本身，并能對(duì)融合酶性能產(chǎn)生重大影響[40-41]，是融合酶分子設(shè)計(jì)的重要方面。通過對(duì)連接肽進(jìn)行改造 (連接肽工程，linker engineering)[41]，有望能實(shí)現(xiàn)對(duì)融合酶結(jié)構(gòu)域之間空間組織關(guān)系的精細(xì)調(diào)控。但其問題的關(guān)鍵在于：1) 需要對(duì)連接肽性質(zhì)對(duì)結(jié)構(gòu)域空間組織關(guān)系的影響進(jìn)行系統(tǒng)研究。借助圓二色光譜、X射線小角度散射、X射線衍射和NMR等研究立體結(jié)構(gòu)的工具，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬，有希望在這方面取得突破，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)連接肽進(jìn)行理性設(shè)計(jì)。2) 需要擴(kuò)展能不同程度、不同方面 (如距離、角度、取向等) 改變結(jié)構(gòu)域空間組織關(guān)系的連接肽種類，為理性設(shè)計(jì)提供豐富的元件和模塊?？梢灶A(yù)見，在解決了以上兩個(gè)關(guān)鍵問題的基礎(chǔ)上，人們能實(shí)現(xiàn)連接肽的理性設(shè)計(jì)，并能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的空間組織結(jié)構(gòu)，這將為融合酶設(shè)計(jì)，特別是多結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜融合體系的設(shè)計(jì)提供強(qiáng)大的支撐作用。

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