中國馬鈴薯主要育成品種抗病毒分子標記分析

趙興濤 徐建飛 龐萬福 卞春松 段紹光 劉 杰 段艷鳳 金黎平

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）栽培面積廣泛，是世界上僅次于水稻和小麥的第三大糧食作物。中國是馬鈴薯生產(chǎn)第一大國，全國各地均有栽培（金黎平和屈冬玉，2002）。病毒病是為害馬鈴薯的重要病害，是造成馬鈴薯種薯退化的重要因素，每年世界上由于馬鈴薯病毒病造成的減產(chǎn)至少為20%（王曉明 等，2005）。

在引起馬鈴薯病毒病的病毒中，PVY（potato virus Y）和PVX（potato virus X）是危害較為嚴重的兩種病毒。Ryadg是控制馬鈴薯對PVY 具有極端抗性（extreme resistance，ER）的基因，來源于安第斯栽培種（Solanum tuberosumssp.Andigena），1996年被定位在第11 號染色體的末端（H?m?l?inen et al.，1997），Kasai 等（2000）設(shè)計了與該基因緊密連鎖的分子標記RYSC3，目前該標記已開始應(yīng)用于國外的育種進程（Ottoman et al.，2009）。Rx基因控制馬鈴薯對PVX 的極端抗性，Rx1（Rxadg）來源于安第斯栽培種，Rx2（Rxacl）來源于野生種無莖薯（Solanum acaule），1991年被分別定位在第12 號和5 號染色體（Ritter et al.，1991），這兩個基因的克隆分離分別于1999年和2000年完成（Bendahmane et al.，1999，2000），Ohbayashi 等（2010）根據(jù)Rx1基因的序列設(shè)計了STS 標記Rxsp，研究結(jié)果顯示該標記與基因的重組率僅為1.3%（Mori et al.，2011）。

本試驗利用與抗PVY 和PVX 基因Ryadg和Rx緊密連鎖的分子標記RYSC3 及Rxsp，對我國190 份馬鈴薯主要育成品種進行了檢測分析，以期為馬鈴薯抗病毒育種、優(yōu)良基因聚合及分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯主要育成品種190 份（表2），由全國18 個省、市22 個單位提供。于2008年種植于河北張家口壩上試驗基地，每品種10 株，株距0.3 m，行距0.6 m，常規(guī)田間管理。

1.2 DNA提取

取苗期植株幼嫩、健壯新鮮的葉片，采用CTAB 法結(jié)合高通量的Retsch 細胞破碎儀（Retsch Inc.，Haan，Germany）快速提取植物基因組DNA（Jones ＆ Walker，1963），1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和質(zhì)量后，樣品稀釋至10 ng·μL-1，置-20 ℃冰箱保存。

1.3 分子標記分析

標記信息見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 標記信息

RYSC3 標記PCR 擴增體系10 μL，其中10 ng·μL-1模板DNA 2.0 μL，10×TaqBuffer 1.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 0.8 μL，5 μmol·L-1上游引物0.25 μL，5 μmol·L-1下游引物0.25 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.2 μL，ddH2O 5.5 μL；Rxsp 標記PCR 擴增體系10 μL，其中10 ng·μL-1模板 DNA 2.0 μL，10×TaqBuffer 2.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture1.0 μL，5 μmol·L-1上游引物1.0 μL，5 μmol·L-1下游引物1.0 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 2.9 μL。試劑均為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

36 個循環(huán)PCR 反應(yīng)程序：94 ℃變性30 s，Tm 退火30 s，72 ℃延伸1 min。第1 個循環(huán)之前94 ℃預(yù)變性10 min。最后72 ℃延伸10 min。擴增反應(yīng)在Veriti PCR 儀（Applied Biosystems 公司）上進行。PCR 產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠、電壓8 V·cm-1條件下電泳40 min，溴化乙錠（EB）著色后經(jīng)直觀成像系統(tǒng)Chemi-Smart 3100（Vilber Lourmat 公司）成像（圖1）。

圖1 RYSC3 與Rxsp 標記在部分馬鈴薯品種中的擴增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 我國馬鈴薯主要育成品種抗病毒標記分析

對190 份供試馬鈴薯品種進行RYSC3 和Rxsp 標記分析，160 份品種既不含RYSC3 標記，也不含Rxsp 標記，占到了供試品種的84.2%；只含有RYSC3 標記的品種15 份，占供試品種的7.9%；只含有Rxsp 標記的品種8 份，占供試品種的4.2%；既含RYSC3 標記也含Rxsp 標記的品種7 份，占供試品種的3.7%（表2）。

表2 我國馬鈴薯主要育成品種RYSC3 和Rxsp 標記分析結(jié)果

2.2 我國馬鈴薯抗病毒品種育成親本來源分析

在含有 RYSC3 標記的品種中，國際馬鈴薯中心（CIP）引進的資源材料所育成的品種占31.8%，新型栽培種所育成的品種占9.1%（表3）；在含有Rxsp 標記的品種中，國際馬鈴薯中心引進的資源材料所育成的品種占26.7%，新型栽培種所育成的品種占20.0%。

表3 我國馬鈴薯抗病毒品種育成親本來源分析結(jié)果

2.3 我國馬鈴薯抗病毒品種育成年份分析

在含有RYSC3 標記的馬鈴薯品種中，2001年之前審定的品種9 份，2001年之后審定的品種11 份，分別占供試品種的40.9%與50.0%（表4）。在含有Rxsp 標記的品種中，2001年之前審定的品種3 份，2001年之后審定的品種12 份，分別占供試品種的20.0%與80.0%。

表4 我國馬鈴薯抗病毒品種育成年份分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

20 世紀30年代至今，國際上將馬鈴薯野生種作為優(yōu)良抗性基因的來源廣泛應(yīng)用于抗性育種進程。而在我國，特別是20 世紀90年代以前，育種親本單一，遺傳多樣性差的問題比較突出。2000年以來，我國馬鈴薯育種發(fā)展迅速，育成的品種數(shù)量迅速增加，遺傳基礎(chǔ)狹窄的情況有所改善，但是審定品種親緣關(guān)系近，遺傳多樣性仍較差（徐敏 等，2007），許多控制優(yōu)良性狀的基因不能引入到育種中。

本試驗利用與Ryadg和Rx基因連鎖的兩個標記RYSC3 和Rxsp，對190 份我國主要育成的馬鈴薯品種進行了檢測分析，揭示了兩個抗病毒基因在我國馬鈴薯品種中的分布情況。雖然所用標記較少，不足以完全代表我國馬鈴薯品種的抗病毒基因攜帶情況，但結(jié)果可以反映出以下問題和情況：①我國審定品種中含有優(yōu)良抗病毒基因的比例較??；②在含有抗病毒標記的品種中，由新型栽培種資源或從CIP 引進的資源育成的品種占了40%以上，這表明利用這兩種類型的材料，有助于提高材料抗病毒基因的多態(tài)性；③2001年以來，育成的含有抗病毒標記的品種數(shù)量明顯增加，說明我國馬鈴薯抗病毒育種取得了長足的進步。

目前，分子標記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于馬鈴薯遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀的基因定位克隆以及馬鈴薯種質(zhì)資源的研究。這些為馬鈴薯的分子標記輔助育種打下了良好的基礎(chǔ)，也為提高我國馬鈴薯綜合育種水平和加快育種進程提供了良好的機遇。然而，由于缺乏足夠多的與目標基因緊密連鎖的標記使得實際用于育種實踐的標記較少（Carrasco et al.，2009），因此開發(fā)更多的與重要性狀緊密連鎖的分子標記并應(yīng)用于標記輔助選擇進程，是一項緊迫和重要的工作。

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