EST-SSR標(biāo)記在蔬菜作物中的開發(fā)和應(yīng)用進(jìn)展

吳海濱 羅少波 羅劍寧* 龔 浩 何曉莉

（1 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州 510640；2 廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640）

DNA 分子標(biāo)記在分子遺傳學(xué)的建立和發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用，同時(shí)也是作物遺傳育種的重要工具。其中SSR（Simple Sequence Repeats）又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)，是一種在PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)。與其他分子標(biāo)記相比，它具有標(biāo)記潛在數(shù)量豐富，等位位點(diǎn)變異多，信息含量高，共顯性，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，20 世紀(jì)90年代以來(lái)，在一些大田作物中，SSR 標(biāo)記已經(jīng)被遺傳學(xué)家和育種學(xué)家廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因的定位和克隆、分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域（方宣鈞 等，2000）。根據(jù)SSR 標(biāo)記的序列性質(zhì)不同，SSR 標(biāo)記可分為基因組SSR（Genomic SSR，gSSR）和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（Expressed sequence tag SSR，EST-SSR），其中EST-SSR 是近年來(lái)建立起來(lái)的新型分子標(biāo)記。

1 EST-SSR 標(biāo)記概述

EST（Expressed Sequence Tags）即表達(dá)序列標(biāo)簽，是將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建成cDNA文庫(kù)后，大規(guī)模隨機(jī)挑選文庫(kù)中cDNA 克隆，對(duì)其3′或5′端進(jìn)行單向測(cè)序所獲得的一段cDNA序列。EST 是表達(dá)基因的窗口，它能反映mRNA 的信息，可代表生物體某種組織或細(xì)胞在某一時(shí)間的一個(gè)表達(dá)基因（于鳳池，2005）。目前，EST 數(shù)據(jù)庫(kù)作為基因組學(xué)與后基因組學(xué)研究的橋梁和工具，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于功能基因組分析、比較基因組分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、基因表達(dá)調(diào)控及基因芯片的制作等研究領(lǐng)域。

研究表明，10%的 EST 序列中包含有簡(jiǎn)單重復(fù)序列，可以用作 EST-SSR 標(biāo)記的開發(fā)（Yammanoto & Sasaki，1997；Hatey et al.，1998）。EST-SSR 標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用原理與gSSR 相似，兩者區(qū)別在于EST-SSR 來(lái)源于基因組的編碼區(qū)，更能反映出生物功能基因的信息（Li et al.，2004）。與gSSR 相比，EST-SSR 標(biāo)記還具有開發(fā)費(fèi)用少和難度相對(duì)較低、通用性好、信息量大等優(yōu)點(diǎn)。作為一種新的SSR 標(biāo)記的來(lái)源，EST-SSR 標(biāo)記已經(jīng)在眾多生物種類中得到證實(shí)和應(yīng)用。

2 EST-SSR 標(biāo)記在蔬菜作物中的研究進(jìn)展

2.1 植物EST 數(shù)據(jù)庫(kù)研究進(jìn)展

植物EST 計(jì)劃作為植物基因組計(jì)劃的一個(gè)重要組成部分，已經(jīng)在擬南芥、水稻、玉米、小麥、油菜等多種植物中得到開展。隨著EST 計(jì)劃在不同物種間的不斷擴(kuò)展和研究的深入，以及DNA 測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，EST 的數(shù)量呈指數(shù)級(jí)的驚人速度增長(zhǎng)。1991年各個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的EST數(shù)目尚不足2 000 條，但隨著EST 數(shù)據(jù)的增多，1993年美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National center of Biotechnology information，NCBI）建立了一個(gè)專門的EST 數(shù)據(jù)庫(kù)dbEST（data base of EST）用來(lái)收集和保存所有的EST 數(shù)據(jù)。截止2011年2月28日，該數(shù)據(jù)庫(kù)收集的水稻、玉米、小麥EST 序列數(shù)目已分別達(dá)到1.6×106、2.0×106、1.1×106條，蔬菜作物中黃瓜、甜瓜、番茄、辣椒的EST序列數(shù)目也已經(jīng)分別達(dá)到8.1×103、3.6×104、2.9×105、1.1×105條。EST 資源數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)充極大地方便和加快了人們?cè)谏茖W(xué)領(lǐng)域的研究，也為利用這些數(shù)據(jù)來(lái)開發(fā)EST 分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。

2.2 EST-SSR 標(biāo)記在蔬菜作物中的研究現(xiàn)狀

蔬菜是一大類作物的總稱，種類多、范圍廣。初步統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)在全國(guó)栽培的蔬菜種類（含亞種、變種）已有209 種，其中普遍栽培的種類也有60～120 種。目前，EST-SSR 標(biāo)記在一些主要蔬菜作物中已經(jīng)得到了一定程度的開發(fā)和應(yīng)用（表1）。為了便于敘述，本文將主要蔬菜作物大致分為葉菜類、茄果類和瓜類進(jìn)行綜述。

2.2.1 葉菜類 在大白菜和普通白菜的EST-SSR 研究中，忻雅等（2006）對(duì)4 584 條大白菜和普通白菜EST 進(jìn)行了SSR 搜索，共檢索出474 個(gè)SSR 位點(diǎn)，檢出率為10.3%。根據(jù)這些序列，設(shè)計(jì)了15 對(duì)EST-SSR 引物，在合適的PCR 反應(yīng)體系下，以大白菜自交系A(chǔ) 的DNA 為模板，進(jìn)行引物的篩選，發(fā)現(xiàn)15 對(duì)EST-SSR 引物都能擴(kuò)增出產(chǎn)物。進(jìn)一步用這些可擴(kuò)增的引物對(duì)28 個(gè)大白菜和普通白菜品種進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)7 對(duì)引物顯示多態(tài)性，占引物總數(shù)的46.7%。李麗和鄭曉鷹（2009）研制了由3 個(gè)引物對(duì)組成的6 套EST-SSR 復(fù)合標(biāo)記組合，用于鑒定白菜〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino〕和大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕品種，并形成了多重SSR 的最佳試驗(yàn)條件。這6 套標(biāo)記組合完全鑒別了43 個(gè)白菜和大白菜品種，并且比較了單引物標(biāo)記與復(fù)合標(biāo)記的鑒定效率，確認(rèn)其可以高效、準(zhǔn)確和全面地鑒別白菜和大白菜品種的真實(shí)性和雜交種純度。

表1 蔬菜作物EST-SSR 標(biāo)記開發(fā)進(jìn)展

關(guān)于甘藍(lán)的EST-SSR 研究，陳琛等（2010）從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載62 567 條甘藍(lán)相關(guān)EST，處理后得到19 611 條無(wú)冗余的EST，通過對(duì)其進(jìn)行SSR 搜索，共得到1 219 個(gè)SSR，分布在1 176條EST 上，分布密度為1/11.48 kb，包括273 種重復(fù)基元。針對(duì)這1 176 條含有SSR 的EST 序列，設(shè)計(jì)合成了978 對(duì)引物，用兩份甘藍(lán)自交系對(duì)978 對(duì)引物進(jìn)行初篩，897 對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，共擴(kuò)增出1 026 條擴(kuò)增帶；128 對(duì)引物表現(xiàn)出多態(tài)性，共有258 條多態(tài)性帶（占總帶數(shù)的25.15%）。利用4 對(duì)多態(tài)性引物，初步構(gòu)建了中甘11 號(hào)、8398、中甘15 號(hào)、中甘21 號(hào)甘藍(lán)雜交新品種及其親本的指紋圖譜。以上結(jié)果說(shuō)明從甘藍(lán)相關(guān)EST 數(shù)據(jù)庫(kù)中開發(fā)的SSR 引物有較好的可用性。

2.2.2 茄果類 在茄果類蔬菜中，有關(guān)辣椒的EST-SSR 分子標(biāo)記研究相對(duì)較多。Yi 等（2006）對(duì)辣椒10 232 條非冗余的EST 序列進(jìn)行SSR 搜索，獲得1 201 個(gè)SSR 位點(diǎn)，平均每3.8 kb 有1個(gè)SSR 位點(diǎn)。利用所含SSR 的EST 序列，設(shè)計(jì)了812 對(duì)EST-SSR 引物，其中513 對(duì)引物（63.1%）有擴(kuò)增產(chǎn)物，150 對(duì)引物（29.2%）在辣椒屬種間不同品種 TF68（C.annuum）和 Habanero（C.chinense）顯示出多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)，包含AC 二核苷酸重復(fù)的EST-SSR 標(biāo)記的多態(tài)性最高，多態(tài)性與基序長(zhǎng)度和重復(fù)數(shù)成正比。同時(shí)將139 個(gè)多態(tài)性EST-SSR 引物整合于之前構(gòu)建的遺傳連鎖圖上，使得該連鎖圖包含了14 個(gè)連鎖群，覆蓋長(zhǎng)度2 201.5 cM。這些EST-SSR 標(biāo)記均勻分布于各個(gè)連鎖群。這種基于SSR 標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜對(duì)于辣椒屬的比較作圖和分子標(biāo)記輔助育種作用很大。李晶晶等（2008）對(duì)4 000 條辣椒EST 序列進(jìn)行篩選，獲得了119 條含有SSR的EST，共設(shè)計(jì)出35 對(duì)EST-SSR 引物，占所有EST 序列的0.87%。以辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（CMS）21A，保持系21B 基因組DNA 為模板，利用新合成的EST-SSR 引物進(jìn)行篩選，首次獲得編號(hào)為Pe21、Pe26 和Pe27 的3 對(duì)與辣椒育性相關(guān)的特異引物。這些信息對(duì)進(jìn)一步研究辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子機(jī)理有一定的促進(jìn)作用。張宇等（2010）利用SSRIT 軟件從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的19 173 條辣椒EST 序列中篩選到612 個(gè)SSR，檢出率為3.19%。研究發(fā)現(xiàn)辣椒EST-SSR 以5～10 次重復(fù)為主，基序長(zhǎng)度集中在15～20 bp 范圍內(nèi)。利用含SSR 的576 條EST 序列共設(shè)計(jì)357對(duì)引物，在合適的PCR 條件下，337 對(duì)（94.40%）引物擴(kuò)增出清晰條帶，75 對(duì)（21.01%）引物表現(xiàn)多態(tài)性，表明EST-SSR 標(biāo)記在辣椒遺傳分析中是有價(jià)值且可行的。Ince 等（2010）利用辣椒屬EST 序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)了45 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記。將所設(shè)計(jì)的標(biāo)記在辣椒屬的多個(gè)種內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，包括一年生辣椒（C.annuumL.）、灌木狀辣椒（C.frutescensL.）、中國(guó)辣椒（C.chinense）、下垂辣椒（C.baccatum）和柔毛辣椒（C.pubescens）。結(jié)果顯示，這些EST-SSR 標(biāo)記在辣椒屬內(nèi)不同種間具有良好的通用性。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)包含二核苷酸重復(fù)的SSR 標(biāo)記比三核苷酸重復(fù)的SSR 標(biāo)記具有更好的多態(tài)性。

Stàgel 等（2008）篩選了超過3 300 條茄屬的EST 序列和基因組編碼區(qū)序列，獲得了64 條序列共含有70 個(gè)SSR 位點(diǎn)，其中50 條序列可以用于引物設(shè)計(jì)。用這些引物對(duì)38 個(gè)茄子栽培種和6 個(gè)茄屬近緣種進(jìn)行分析，其中39 對(duì)（78.0%）引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，31 對(duì)（79.5%）引物在茄屬種間有多態(tài)性，僅有 11 對(duì)（28.2%）引物在茄屬栽培種內(nèi)顯示多態(tài)性。通過試驗(yàn)證明這些EST-SSR 標(biāo)記在遺傳多樣性分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹方面作用顯著。

2.2.3 瓜類 在葫蘆科瓜類作物中，甜瓜、黃瓜、西瓜的EST-SSR 標(biāo)記研究相對(duì)較多。Kong 等（2007）將GenBank 和Melon EST Database 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的5 474 條來(lái)自甜瓜的EST 和mRNA序列進(jìn)行拼接，共得到3 188 條Unigene，覆蓋長(zhǎng)度為1.8 Mb。對(duì)這些序列進(jìn)行SSR 位點(diǎn)搜索，共獲得分布于309 條Unigene 的383 個(gè)EST-SSR 位點(diǎn)，SSR 平均分布距離為1/4.7 kb。在這些鑒定出的SSR 位點(diǎn)中，191（49.9%）個(gè)位點(diǎn)為二核苷酸重復(fù)，167（43.6%）個(gè)位點(diǎn)為三核苷酸重復(fù)，12（3.1%）個(gè)位點(diǎn)為四核苷酸重復(fù)，8（2.1%）個(gè)位點(diǎn)為五核苷酸重復(fù)，5（1.3%）個(gè)位點(diǎn)為六核苷酸重復(fù)。選擇合成56 對(duì)EST-SSR 引物，其中47 對(duì)引物能夠擴(kuò)增出預(yù)期產(chǎn)物，22 對(duì)引物在27 個(gè)甜瓜種質(zhì)資源中擴(kuò)增出特異性的多態(tài)性產(chǎn)物，平均每個(gè)位點(diǎn)能夠檢測(cè)到2.9 個(gè)等位基因。可轉(zhuǎn)移性分析表明，有15 個(gè)引物對(duì)在黃瓜上獲得了特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，占總數(shù)的68.2%。Fernandez-Silva 等（2008）根據(jù)甜瓜EST 序列和基因組文庫(kù)序列設(shè)計(jì)了225 對(duì)SSR 引物，其中包括183 對(duì)EST-SSRs 引物和42 對(duì)gSSRs 引物。用這些引物在甜瓜種質(zhì)資源中進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果表明144 對(duì)（79%）EST-SSRs 引物和36 對(duì)（86%）gSSRs 引物有擴(kuò)增產(chǎn)物。其中126 對(duì)EST-SSRs 引物和31 對(duì)gSSRs 引物在甜瓜種質(zhì)資源中顯示出多態(tài)性，多態(tài)性引物占有擴(kuò)增產(chǎn)物引物的87%，EST-SSR 和gSSR 引物的多態(tài)率相似，分別為87.5%和89.0%。為了驗(yàn)證EST-SSR引物在葫蘆科內(nèi)部的通用性，將這些引物在南瓜屬中的中國(guó)南瓜、美洲南瓜和印度南瓜中進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。結(jié)果表明，有12.7%的引物至少在一種南瓜中有擴(kuò)增產(chǎn)物，僅有5.4%的標(biāo)記顯示出多態(tài)性。并將其中121 個(gè)新開發(fā)的SSRs 標(biāo)記整合到以往構(gòu)建的甜瓜遺傳圖譜中。

Gonzalo 等（2005）對(duì)比了甜瓜的EST-SSR 標(biāo)記和gSSR 標(biāo)記的多態(tài)性差異，研究表明EST-SSR 的多態(tài)性比例為45.5%，gSSR 的多態(tài)性比例為51.2%，兩者多態(tài)性值類似，并把EST-SSR 標(biāo)記整合到甜瓜的遺傳圖譜上。

Kong 等（2006）從GenBank 中共獲得了5 268 條來(lái)自于黃瓜的EST 和基因序列，通過對(duì)這些序列分別進(jìn)行組裝，獲得3 558 條黃瓜的Unigene。以重復(fù)基序長(zhǎng)度為2～6 bp、最低重復(fù)次數(shù)5 次為標(biāo)準(zhǔn)，在Unigene 上搜尋SSR 位點(diǎn)，在474 條Unigene 中共獲得了582 個(gè)SSR 位點(diǎn)。在SSR 位點(diǎn)中，二核苷酸重復(fù)占60%，三核苷酸重復(fù)占36%。選擇了54 個(gè)SSR 位點(diǎn)合成側(cè)翼引物，在20 個(gè)黃瓜基因型上評(píng)價(jià)這些SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性，其中有49 對(duì)引物有預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物；20 對(duì)引物在20 個(gè)黃瓜種質(zhì)材料中擴(kuò)增出了特異性的具有多態(tài)性的產(chǎn)物。在多態(tài)性EST-SSR 位點(diǎn)上能夠檢測(cè)到2～6 個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)能夠檢測(cè)到3.3 個(gè)等位基因。可轉(zhuǎn)移性分析表明，有13 個(gè)引物對(duì)在甜瓜上有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，占總數(shù)的65%，其中有7 個(gè)（35%）引物對(duì)在測(cè)試的甜瓜基因型上表現(xiàn)出多態(tài)性。Hu 等（2010）對(duì)GenBank 上公布的6 344 條黃瓜ESTs 進(jìn)行SSRs 搜索，獲得533 個(gè)SSRs 位點(diǎn)，這些SSRs 位點(diǎn)主要為二核苷酸和三核苷酸重復(fù)，其中以AG和AAG 重復(fù)單元為主。392 條包含SSRs 位點(diǎn)的Unigene 適合用于引物設(shè)計(jì)。選擇合成了35 對(duì)SSR引物，28 對(duì)引物在黃瓜中有預(yù)期的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，26 對(duì)引物在21 個(gè)黃瓜種質(zhì)資源中擴(kuò)增出特異性的多態(tài)性產(chǎn)物，平均每個(gè)位點(diǎn)能夠檢測(cè)到3.77 個(gè)等位基因。為了驗(yàn)證EST-SSR 引物在葫蘆科內(nèi)部的通用性，將28 對(duì)在黃瓜中有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的引物在甜瓜、西瓜、南瓜和絲瓜中進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。結(jié)果表明，分別有26（92.9%）、16（57.1%）、15 對(duì)（53.6%）和17 對(duì)（60.7%）引物有擴(kuò)增產(chǎn)物。這表明EST-SSR 標(biāo)記有很好的物種間通用性，適合用于比較基因組分析。

鄒明學(xué)（2007）和鄒明學(xué)等（2009）對(duì)820 條來(lái)自西瓜的EST 序列進(jìn)行了SSR 序列的篩選，共發(fā)現(xiàn)SSR 序列87 條，占整個(gè)EST 數(shù)據(jù)庫(kù)的10.6%。二核苷酸重復(fù)中AG、GA、CT 和TC 較高，三核苷酸重復(fù)以CAA 所占比例最大。根據(jù)篩選EST 數(shù)據(jù)庫(kù)得到的SSR 序列設(shè)計(jì)并合成了79 對(duì)EST-SSR 引物。經(jīng)過PCR 擴(kuò)增和銀染檢測(cè)表明，36 對(duì)引物在西瓜作圖親本材料P1296341 和97103 中顯示出穩(wěn)定清晰的帶型，并將其中的9 個(gè)EST-SSR 標(biāo)記整合到以往構(gòu)建的遺傳圖譜上。

3 EST-SSR 標(biāo)記開發(fā)存在問題及解決方案

大量高質(zhì)量的EST 序列信息是EST-SSR 標(biāo)記開發(fā)的根本。目前，對(duì)于蔬菜作物而言，雖然網(wǎng)絡(luò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)積累了大量EST 數(shù)據(jù)，但是對(duì)于部分非大宗蔬菜作物而言，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的可利用信息非常有限。例如，截止2011年10月2日，dbEST 數(shù)據(jù)庫(kù)所收集的苦瓜、冬瓜、絲瓜EST 序列分別僅有180、19 條和1 條，如此少的序列信息將無(wú)法開發(fā)EST-SSR 標(biāo)記。缺乏EST 序列信息是EST-SSR 標(biāo)記在蔬菜作物中的大規(guī)模開發(fā)和應(yīng)用的瓶頸。近年來(lái)，隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，大規(guī)模測(cè)序的費(fèi)用較以往已經(jīng)大大降低，例如利用solexa 測(cè)序技術(shù)對(duì)一種新作物的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序獲得理想數(shù)據(jù)量的費(fèi)用一般可以控制在5 萬(wàn)元以內(nèi)。因此，對(duì)于某些特色蔬菜作物，即使通過自主測(cè)序來(lái)開發(fā)EST-SSR 標(biāo)記，其費(fèi)用對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室而言也是可以接受的。

4 展望

蔬菜種類繁多，不同蔬菜作物間研究水平參差不齊。在分子標(biāo)記研究領(lǐng)域中，除個(gè)別優(yōu)勢(shì)蔬菜作物外，大部分蔬菜作物研究水平薄弱。由于缺乏相應(yīng)的序列信息，蔬菜中大量使用的分子標(biāo)記主要分為兩類：一類是隨機(jī)引物標(biāo)記，如RAPD 標(biāo)記、ISSR 標(biāo)記、SRAP 標(biāo)記等（Singh et al.，2007；夏軍輝和向長(zhǎng)萍，2008；高山 等，2010；李懷志 等，2011），由于隨機(jī)引物PCR所擴(kuò)增的DNA 區(qū)段是無(wú)法預(yù)知的，具有很強(qiáng)的隨機(jī)性和任意性，因此所獲得的試驗(yàn)結(jié)果往往重復(fù)性差，準(zhǔn)確度低；另一類是基于限制性酶切和PCR 技術(shù)的AFLP 標(biāo)記（Gaikwad et al.，2008；楊衍 等，2009），該標(biāo)記具有多態(tài)性條帶豐富、信息量大、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。但是由于該技術(shù)步驟繁瑣、操作難度大、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，大大限制了該標(biāo)記的應(yīng)用。

近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和各種生物體基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的快速推進(jìn)，單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphism，SNP）越來(lái)越受到人們的重視。SNP 是指在基因組水平上單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，它具有基因組分布密度高及數(shù)量巨大等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記。目前，對(duì)于大多數(shù)蔬菜作物而言，SNP 的開發(fā)和檢測(cè)還存在一定困難：首先，SNP 的開發(fā)需要依賴大量基因組或轉(zhuǎn)錄基因的序列信息，而蔬菜作物中大多數(shù)物種的基因組信息未知，因此標(biāo)記的開發(fā)難度極大；其次，SNP 標(biāo)記的檢測(cè)難度相對(duì)較大，目前SNP 的檢測(cè)方法主要有直接測(cè)序法、DNA 芯片技術(shù)、酶切PCR 檢測(cè)法等。這些方法往往存在操作難度大、步驟繁瑣、花費(fèi)高等缺點(diǎn)，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室而言，難以大規(guī)模應(yīng)用。近年來(lái)，美國(guó)Idaho 公司開發(fā)出了高分辨熔解曲線檢測(cè)系統(tǒng)（High Resolution Melting，HRM）突變篩查和基因分型分析系統(tǒng)，能夠快速、大規(guī)模地檢測(cè)SNP。但是該系統(tǒng)對(duì)樣品和試驗(yàn)條件要求較高，同時(shí)大規(guī)模檢測(cè)費(fèi)用較高。因此，SNP 標(biāo)記在蔬菜作物中的大規(guī)模應(yīng)用還需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。

EST-SSR 標(biāo)記與上述標(biāo)記相比，具有操作簡(jiǎn)單、共顯性、擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性高、物種間通用性較好等突出優(yōu)點(diǎn)，非常適合運(yùn)用于蔬菜作物中。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，將會(huì)有越來(lái)越多蔬菜作物的轉(zhuǎn)錄組序列被測(cè)定，這將使得EST-SSR 標(biāo)記的開發(fā)費(fèi)用大大降低，將為其在蔬菜作物中的應(yīng)用提供更加廣闊的空間。到目前為止，EST-SSR 標(biāo)記在一些蔬菜作物中已經(jīng)得到了一定的應(yīng)用，但是對(duì)于大多數(shù)蔬菜而言，其應(yīng)用程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠?；贓ST-SSR 標(biāo)記的諸多優(yōu)點(diǎn)，大力開發(fā)蔬菜作物中EST-SSR 標(biāo)記，對(duì)于提高分子標(biāo)記在育種中的應(yīng)用，加快蔬菜分子標(biāo)記輔助育種步伐，進(jìn)一步推進(jìn)蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

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