番茄黃化曲葉病毒對B型和Q型煙粉虱雌蟲體長及卵大小的影響

徐艷霞 王相晶 焦曉國 潘慧鵬 王少麗 謝 文 吳青君張友軍*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

煙粉虱〔Bemisia tabaci（Gennadius）〕屬半翅目粉虱科，可通過取食植物韌皮部汁液，傳播植物雙生病毒，通過引起植物生理代謝紊亂、分泌蜜露、誘發(fā)真菌病害等方式對作物生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Inbar & Gerling，2007）。最新的系統(tǒng)發(fā)育分析、雜交試驗(yàn)和交配行為觀察結(jié)果表明，煙粉虱是由至少24 個隱種構(gòu)成的復(fù)合種（欒軍波和劉樹生，2010；de Barro & Ahmed，2011），由于隱種的命名尚未解決，本試驗(yàn)依舊以近年來文獻(xiàn)中采用的生物型代替隱種的名稱。煙粉虱不同生物型之間其內(nèi)共生菌的組成、抗藥性、傳播植物雙生病毒的能力等方面存在很大的差異（Luo et al.，2010；Wang et al.，2010；Chu et al.，2011）。在已知的煙粉虱生物型中，B型和Q 型是目前危害最為嚴(yán)重的兩種生物型，前者自20世紀(jì)80年代在美國造成危害以來在許多國家均有發(fā)現(xiàn)，是國際公認(rèn)的超級害蟲；而后者則是20世紀(jì)90年代在伊比利亞半島首先發(fā)現(xiàn)，近年來在世界各地迅速擴(kuò)散成為新的致害生物型（Guirao et al.，1997）。目前，發(fā)現(xiàn)Q 型和B 型煙粉虱在許多國家或地區(qū)同域發(fā)生并造成危害，如西班牙東南部地區(qū)和以色列等（褚棟 等，2007）。在我國，B 型煙粉虱于20世紀(jì)90年代入侵（羅晨 等，2002），并且迅速擴(kuò)散，對我國的作物生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Q 型煙粉虱于2003年在云南發(fā)現(xiàn)（褚棟 等，2005），而后逐漸取代B 型煙粉虱成為優(yōu)勢生物型（Pan et al.，2011），但是有關(guān)其取代機(jī)制尚不清晰，目前備受學(xué)術(shù)界重視（褚棟 等，2007）。

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬于菜豆金黃花葉病毒屬，由煙粉虱以可循環(huán)持久性的傳播方式傳播（Brown & Czosnek，2002）。在我國，TYLCV 于2005年在上海首次發(fā)現(xiàn)（Wu et al.，2006），隨后在浙江、江蘇、山東、北京以及河北等地均檢測到（Mugiira et al.，2008；孫作文 等，2009；張愛紅 等，2010；周濤 等，2010），對番茄生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在植物—病毒—煙粉虱這個互作體系中，一方面，病毒對煙粉虱的生物學(xué)特性、生理生化特性等產(chǎn)生影響（Colvin et al.，2006；Jiu et al.，2007；劉劍，2009），并能改變其發(fā)育歷期及解毒酶等相關(guān)生化指標(biāo)（劉劍，2009；歐陽志剛，2010）；另一方面，病毒的存在可以誘導(dǎo)植物應(yīng)答而改變植物體內(nèi)物質(zhì)，這使得取食病毒侵染的植物的昆蟲間接受到影響，從而相應(yīng)影響到了植食性昆蟲的許多特性（李萌，2010）。TYLCV 是否對B 型煙粉虱與Q 型煙粉虱具有影響，這些影響是否能夠影響B(tài) 型與Q 型煙粉虱的競爭取代，目前尚不清楚。對昆蟲而言，卵的大小具有較大可塑性，且與昆蟲對環(huán)境適應(yīng)性有極顯著關(guān)聯(lián)，直接影響其后代的存活率。在環(huán)境脅迫條件下，昆蟲一般產(chǎn)生大而少的卵，以增加幼蟲存活率；相反，在環(huán)境適宜條件下，昆蟲一般產(chǎn)生小而多的卵，以利于占有更適宜的生境（Duyck et al.，2006）。如單帶弄蝶雌蟲可根據(jù)寄主植物質(zhì)量差異調(diào)整所產(chǎn)卵的大?。∕izumoto & Nakasuji，2007）。此外，病毒的感染可能對煙粉虱的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響（歐陽志剛，2010）。本試驗(yàn)比較研究了感染TYLCV的B 型和Q 型煙粉虱以及無毒B 型和Q 型煙粉虱在健康番茄苗上所產(chǎn)卵的長度和寬度的差異，并對感染此病毒的雌蟲與無毒雌蟲進(jìn)行體長的比較，旨在探討B(tài) 型和Q 型煙粉虱對TYLCV 的適應(yīng)性差異，進(jìn)而探討TYLCV 在B 型和Q 型煙粉虱競爭取代過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

B 型煙粉虱于2004年采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所北圃場甘藍(lán)上，然后在甘藍(lán)上繼代飼養(yǎng)；Q 型煙粉虱于2009年采自中蔬大森林花卉市場一品紅上，而后在一品紅上繼代飼養(yǎng)。

本試驗(yàn)開始前，把B 型和Q 型煙粉虱分別轉(zhuǎn)接到健康和感染TYLCV 的番茄苗上隔離飼養(yǎng)，建立了4 個煙粉虱品系，本試驗(yàn)使用時已經(jīng)飼養(yǎng)了6 代。

1.2 供試植物

健康番茄苗：中雜9 號番茄，為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室培育的未接觸任何農(nóng)藥的無蟲苗。

TYLCV 感染番茄苗：菌液制備參見李萌（2010）的方法。取3 片復(fù)葉期的番茄幼苗，在莖部、葉柄部韌皮部用1 mL 一次性無菌注射器多點(diǎn)注射侵染性克隆菌液，每株注射0.2 mL。接種植株置于可控溫室內(nèi)，一般注射25 d 后即可觀察到發(fā)病癥狀。

1.3 試驗(yàn)方法

將健康番茄苗分別放置于實(shí)驗(yàn)室隔離飼養(yǎng)6 代的4 個煙粉虱品系的養(yǎng)蟲籠內(nèi)，飼養(yǎng)條件為相對濕度60%～70%，溫度30 ℃。其中包括帶毒B 型、Q 型煙粉虱番茄種群和無毒B 型、Q 型煙粉虱番茄種群，各種群數(shù)量約2 000 頭。每養(yǎng)蟲籠放置3 株10～12 片真葉期的健康番茄苗。待4 個品系的煙粉虱在健康番茄苗上產(chǎn)卵24 h 后，清除煙粉虱成蟲，每株番茄苗上隨機(jī)取10片葉，每片葉上隨機(jī)取10 個卵（發(fā)現(xiàn)每片葉上卵的數(shù)量均多于10 粒），在Leica 顯微鏡下用解剖針把卵剝離，依次測量每個卵的長度和寬度。另取帶毒B 型、Q 型煙粉虱品系和無毒B 型、Q 型煙粉虱品系各30 頭初羽化雌蟲，-20 ℃存放20 min，而后在Leica 顯微鏡下測量其體長。

1.4 PCR 擴(kuò)增及電泳

利用Shatters 等（2009）設(shè)計的B 型、Q 型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR 擴(kuò)增特異性引物和PCR 熱循環(huán)程序鑒定B 型、Q 型煙粉虱。Q 型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR 擴(kuò)增特異性引物分別為5′CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT 3′和5′CCTTCCCGCAGAAGAAATT TTGTTC 3′；B 型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR 擴(kuò)增特異性引物分別為5′CTAGGGTTTATTG TTTGAGGTCATCATATATTC 3′和5′AATATCGACGAGGCATTCCCCCT 3′；TYLCV 基因片段擴(kuò)增特異性引物分別為 5′CGGAATTCATTATGGCGAAACGTCC 3′和 5′CGGGATCCTGAATGGAACA ATAGATGT 3′。PCR 熱循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為413 bp（Ghanim et al.，2007）。PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖（0.5×TBE）電泳檢測，Biorad 凝膠成像儀觀察，記錄結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行處理間試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，利用SigmaPlot 軟件對所分析數(shù)據(jù)做柱形圖。

圖1 B型煙粉虱特異性引物對實(shí)驗(yàn)室無毒B型煙粉虱番茄種群的擴(kuò)增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 B 型和Q 型煙粉虱特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用B 型煙粉虱的特異性引物從本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的無毒B 型煙粉虱番茄種群中擴(kuò)增到1條478 bp 大小的mtDNA COⅠ基因片段（圖1）；使用Q 型煙粉虱的特異性引物亦從本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的無毒Q 型煙粉虱番茄種群中擴(kuò)增到1條303 bp 大小的mtDNA COⅠ基因片段（圖2）。應(yīng)用B 型煙粉虱的特異性引物無法擴(kuò)增到無毒Q型煙粉虱的此基因片段，使用Q 型煙粉虱的特異性引物亦無法擴(kuò)增到無毒B 型煙粉虱的此基因片段。

2.2 TYLCV 特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用TYLCV 的特異性引物從本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的帶毒B 型、Q 型煙粉虱番茄種群中擴(kuò)增到1 條413 bp 大小的TYLCV 基因片段（圖3）。

2.3 TYLCV 對B 型、Q 型煙粉虱雌蟲體長的影響

帶毒B 型與無毒B 型煙粉虱雌蟲體長分別為0.876 8 mm 和0.899 9 mm，帶毒Q 型與無毒Q 型煙粉虱雌蟲體長分別為0.863 1 mm和0.899 2 mm（圖4），表明帶毒B 型煙粉虱雌蟲體長小于無毒B 型煙粉虱（t=1.446，df=33，P=0.158），帶毒Q 型煙粉虱雌蟲體長小于無毒Q 型煙粉虱（t=1.29，df=34，P=0.206），但均無顯著差異。

圖2 Q 型煙粉虱特異性引物對實(shí)驗(yàn)室無毒Q 型煙粉虱番茄種群的擴(kuò)增結(jié)果

2.4 TYLCV 對B 型煙粉虱卵長和卵寬的影響

通過對帶毒和無毒B 型煙粉虱所產(chǎn)卵的長度和寬度進(jìn)行比較，帶毒B 型煙粉虱卵長與卵寬分別為0.178 8 mm 和0.085 0 mm，無毒B型煙粉虱卵長與卵寬分別為 0.172 2 mm 和0.082 8 mm（圖5），發(fā)現(xiàn)帶毒B 型煙粉虱所產(chǎn)卵長顯著高于無毒B 型煙粉虱（t=-2.745，df=179，P=0.007），帶毒B 型煙粉虱所產(chǎn)卵寬顯著高于無毒B 型煙粉虱（t=-2.613，df=179，P=0.01）。

圖3 TYLCV特異性引物對實(shí)驗(yàn)室?guī)Ф綛型、Q 型煙粉虱番茄種群的擴(kuò)增結(jié)果

2.5 TYLCV 對Q 型煙粉虱卵長和卵寬的影響

通過對帶毒和無毒Q 型煙粉虱所產(chǎn)卵的長度和寬度進(jìn)行比較，帶毒Q 型煙粉虱的卵長與卵寬分別為0.181 9 mm 和0.082 9 mm，無毒Q 型煙粉虱的卵長和卵寬分別為0.188 0 mm 和0.086 3 mm（圖6），發(fā)現(xiàn)帶毒Q 型煙粉虱所產(chǎn)卵的長度顯著低于無毒 Q 型煙粉虱（t=3.802，df=240，P＜0.001），帶毒Q 型煙粉虱所產(chǎn)卵的寬度顯著低于無毒Q 型煙粉虱（t=2.836，df=240，P=0.005）。

圖4 帶毒和無毒B型、Q 型煙粉虱雌蟲體長的比較

圖5 帶毒和無毒B型煙粉虱卵長和卵寬的比較

圖6 帶毒和無毒Q 型煙粉虱卵長和卵寬的比較

3 結(jié)論與討論

昆蟲在不同自然環(huán)境下對所產(chǎn)卵大小表現(xiàn)出明顯可塑性，卵的大小直接影響其后代存活率及對環(huán)境的適應(yīng)性（Fox，1994；Mizumoto & Nakasuji，2007）。研究發(fā)現(xiàn)，許多因素可以影響植食性昆蟲所產(chǎn)卵粒的大小（Landa，1992；Kawecki，1995；Awmack & Leather，2002；Fischer et al.，2004）。目前普遍認(rèn)為：當(dāng)昆蟲處于幼蟲存活率低、低營養(yǎng)供應(yīng)、高捕食風(fēng)險的脅迫條件下時，會相應(yīng)減少在寄主植物上的產(chǎn)卵數(shù)量，但會增加卵粒大小來調(diào)整產(chǎn)卵行為，這是昆蟲適應(yīng)環(huán)境的一種表現(xiàn)（Parker & Begon，1986；Sibly et al.，1988；Kawecki，1995）。溫度是影響昆蟲產(chǎn)卵的常見外部因素，在非洲蝴蝶適宜的產(chǎn)卵溫度范圍內(nèi)，該蝶在低溫條件下所產(chǎn)卵粒較高溫條件下所產(chǎn)卵粒大（Fischer et al.，2004）。Mizumoto 和Nakasuji（2007）將單帶弄蝶的卵按大?。ù笥?.19 mm 的L 組和小于0.16 mm 的S 組）分成兩組，在同等條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)L 組卵的存活率顯著高于S 組，L 組卵的發(fā)育歷期和蛹期顯著低于S 組，且L 組的雌蟲繁殖力較高并能產(chǎn)生較大后代。此外，植物的營養(yǎng)狀態(tài)如：碳水化合物、含氮量、植物次生代謝物質(zhì)也可能影響植食性昆蟲所產(chǎn)卵粒的大小（Awmack & Leather，2002），且寄主植物不同器官在不同季節(jié)亦可以影響植食性昆蟲所產(chǎn)卵粒的大?。↙anda，1992）。根據(jù)生活史理論，當(dāng)后代要經(jīng)歷強(qiáng)烈的資源競爭時，昆蟲會產(chǎn)出較大的卵，以增加競爭力（Mizumoto & Nakasuji，2007）。研究表明，象甲雌蟲在幼蟲或成蟲密度較高的環(huán)境中會產(chǎn)出較大的卵粒，以提高其適應(yīng)性（Kawecki，1995）。有些植食性昆蟲雌蟲依據(jù)宿主植物質(zhì)量不同而產(chǎn)出大小不同的卵，如單帶弄蝶會根據(jù)寄主植物表面粗糙度的差異而調(diào)整所產(chǎn)卵的大?。∕izumoto & Nakasuji，2007）。Skippers（Lepidoptera：Hesperiidae）也會根據(jù)宿主特異性和葉片粗糙度產(chǎn)出不同大小的卵（Nakasuji，1987）。

一般說來，昆蟲產(chǎn)生大的卵粒，由卵孵化出的幼蟲相應(yīng)也大，卵期也相應(yīng)短，這樣可以增加幼蟲的存活率和適應(yīng)性（Fox，1994；Dukas et al.，2001）。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帶毒B 型煙粉虱在番茄上所產(chǎn)卵的長度和寬度均顯著大于無毒B 型煙粉虱，而帶毒Q 型煙粉虱在番茄上所產(chǎn)卵的長度和寬度均顯著小于無毒Q 型煙粉虱，且TYLCV 對B 型、Q 型煙粉虱雌蟲體長并無顯著影響。推測可能是TYLCV 感染對B 型和Q 型煙粉虱產(chǎn)卵行為產(chǎn)生不同修飾作用。TYLCV 感染可能對B 型煙粉虱帶來負(fù)面影響，B 型煙粉虱產(chǎn)生大的卵粒；相反Q 型煙粉虱適應(yīng)TYLCV 的感染，感染后產(chǎn)生小的卵粒。目前只測定、比較了B 型和Q 型煙粉虱在感染TYLCV 和健康番茄苗上的雌蟲體長和卵粒大小，要想闡明TYLCV 在B 型和Q 型煙粉虱競爭取代中的作用，還需比較TYLCV 感染對B 型和Q 型煙粉虱生物學(xué)特性的影響及B 型和Q 型煙粉虱在健康和感染TYLCV 的番茄苗上的競爭取代。

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