馬鈴薯紡錘塊莖類病毒山西分離物侵染性克隆的構(gòu)建

白云鳳，閆建俊，張耀，張忠梁，馮瑞云，張維鋒

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030032）

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）是發(fā)現(xiàn)最早的一種類病毒，也是已知最小的可以在寄主體內(nèi)自我復(fù)制的病原。其分子是單鏈環(huán)狀裸露的RNA，沒有外殼蛋白質(zhì)包裹，因此，沒有免疫原性。PSTVd是引起馬鈴薯品種退化的重要病害之一[1-2]，它能在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制和累積，莖尖脫毒都難以剔除。其傳播途徑廣泛，包括汁液傳播（切刀、種薯切塊間摩擦、農(nóng)機(jī)具以及莖、葉接觸等擴(kuò)散）、媒介昆蟲傳毒、實(shí)生種子帶毒等。根據(jù)受侵染植株出現(xiàn)的癥狀，PSTVd可分為強(qiáng)系、弱系和中間株系。強(qiáng)系通常能使植株減產(chǎn)60%以上。PSTVd侵染后潛伏期長并能持續(xù)感染，使馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，而迄今尚無有效方法防治。

本研究通過構(gòu)建PSTVd的cDNA侵染性克隆，使人們在DNA水平上能開展該病毒的分子生物學(xué)研究，亦為采取有效措施進(jìn)行防治提供依據(jù)，為類病毒的毒源保存提供新的途徑。

1 材料和方法

1.1 供試材料

感病薯塊采自山西省陽曲縣，品種為紫花白。番茄品種為矮紅寶，由山西省農(nóng)科院作物科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室保存?？寺≥d體pBS-T購自Takara生物公司，大腸桿菌Top10由山西省農(nóng)科院作物科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室保存。生化和分子生物學(xué)試劑包括 RNA酶抑制劑（Rnasin），M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，Taq DNA 聚合酶，dNTP，T7 RNA聚合酶等，均購自Takara生物公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自博邁德生物公司。

1.2 PSTVd的cDNA合成和PCR擴(kuò)增

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)報(bào)道的PSTVd同源序列設(shè)計(jì)合成1對引物，正向引物：5′-ATCCCC GGGGAAACCTGGAGCGAAC-3′；反向引物：5′-CCCTGAAGCGCTCCTCCGAG-3′。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 馬鈴薯總RNA提取 其采用文獻(xiàn)[3]的改進(jìn)方法。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增 以馬鈴薯感病薯塊總RNA為模板，按以下步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1 鏈：2 μg 總 RNA，10μmol/L 反向引物 2 μL，10mmol/L 的 dNTP 1.5 μL 和 ddH2O 12.5 μL，混勻，70℃水浴5 min，冰浴5 min，再加入5×RT buffer 5 μL，RNasin 1 μL 和 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，混勻后，放于 42 ℃ 60min，然后于 70℃15 min停止反應(yīng)。以cDNA第1鏈為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積為 50μL，包括：5 μL cDNA 第 1 鏈，10×PCR buffer 5 μL，10mmol/L dNTPs 1 μL，10μmol/L正向引物 2 μL，10μmol/L反向引物 2 μL，Taq DNA 聚合酶（大連，TaKaRa）0.3 μL和 ddH2O34.7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)條帶用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒回收后，連接到pBS-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，酶切初步鑒定后，挑選陽性克隆，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.3 侵染性cDNA克隆的體外轉(zhuǎn)錄和接種

將陽性克隆用BamHI線性化后作為模板，利用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于接種。寄主植物番茄苗種于花盆。出苗2周后，提取葉片總RNA，并以此為模板進(jìn)行RT-PCR檢測，反應(yīng)體系同1.2.3，確認(rèn)無毒后進(jìn)行接種。接種物分別是PSTVd轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、BamHI線性化的陽性克隆和pBS-T空質(zhì)粒。接種前，將待接種葉片表面均勻涂抹金剛砂，之后用戴PE手套的手指蘸取接種液逆葉毛方向輕輕摩擦葉片，每株植物接種2～3個(gè)葉片。接種后10min向葉片表面噴灑清水，沖洗殘留的金剛砂。接種后的植物保濕1 d，然后正常培養(yǎng)，約2周后取葉片提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，同時(shí)將RT-PCR產(chǎn)物純化后送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSTVd山西分離物的cDNA合成和PCR擴(kuò)增

以馬鈴薯感病塊莖的總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。1.0%瓊脂糖凝膠分離，顯示擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約360bp（圖1），與預(yù)期相符?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，與克隆載體pBS-T連接，陽性克隆測序。結(jié)果表明，該片段長度為359 bp，含71個(gè)A，79個(gè) T，108個(gè)C，101個(gè) G，G＋C含量58.2%。將克隆的PSTVd命名為PSTVd山西分離物（PST Vd-SX），將克隆載體命名為pBS-PSTVd-SX。

2.2 PSTVd-SX核苷酸序列分析

用軟件DNAMAN對PSTVd-SX的核苷酸序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，表明PSTVd-SX的RNA分子能通過分子內(nèi)序列互補(bǔ)形成致密的二級結(jié)構(gòu)（圖2-A）。將克隆序列作為query進(jìn)行Blast搜索，結(jié)果表明，該序列與PSTVd荷蘭分離物（GenBank登陸號(hào)：AY372400.1）的序列完全一致。將其與PSTVd東北分離物[4]、河北分離物[5]及已公布的PSTVd弱株系（GenBank登陸號(hào)：M14814.1）、強(qiáng)株系（GenBank 登陸號(hào)：U23058.1）和中間株系（GenBank登陸號(hào)：AY937179.1）進(jìn)行序列比對（圖2-B），共有12個(gè)核苷酸具有多態(tài)性，其中有2個(gè)發(fā)生在左末端，6個(gè)發(fā)生在致病區(qū)，3個(gè)發(fā)生在中央保守區(qū)，1個(gè)發(fā)生在可變區(qū)。

2.3 PSTVd-SX的體外轉(zhuǎn)錄物及其cDNA的侵染性

將質(zhì)粒pBS-PSTVd-SX用DNA限制性內(nèi)切酶BamHI消化使之線性化之后，用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。之后分別用轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、線性化的pBS-PSTVd-SX和pBS-T空質(zhì)粒給番茄植株接種。接種20d后，接種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和pBS-PSTVd-SX質(zhì)粒的植株葉片出現(xiàn)輕微黃斑，心葉稍皺，接種pBS-T空質(zhì)粒的植株正常（圖3-A）。提取接種株上部葉片總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測，接種PSTVd的體外轉(zhuǎn)錄物及其pBS-PSTVd-SX質(zhì)粒的植株均顯示特異條帶，而接種pBS-T空質(zhì)粒的植株無特異條帶（圖3-B）。將接種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和質(zhì)粒pBS-PSTVd-SX植株的RT-PCR產(chǎn)物純化后測序，結(jié)果表明，二者均與PSTVd-SX的序列完全一致。

3 討論

PSTVd是第1個(gè)被鑒定的類病毒，在體外最小自由能的情況下呈棒狀或半棒狀的二級結(jié)構(gòu)[6]，含有5個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)：左末端區(qū)、致病區(qū)、中央保守區(qū)、可變區(qū)和右末端區(qū)[7]。致病區(qū)與病毒的致病性有關(guān)，中央保守區(qū)與病毒的復(fù)制有關(guān)。PSTVd山西分離物與其他幾個(gè)國內(nèi)外代表性株系的核苷酸序列比對結(jié)果表明，其與荷蘭的弱株系一致性最高，僅有2個(gè)核苷酸的差異，結(jié)合該分離物對番茄的致病性，初步將其歸為弱株系。在本研究范圍內(nèi)，PSTVd共有12個(gè)核苷酸具有多態(tài)性，其中有6個(gè)發(fā)生在致病區(qū)。分析這6個(gè)位點(diǎn)的核苷酸變化趨勢，與株系強(qiáng)弱沒有直接關(guān)系，似乎預(yù)示著致病性主要與二級結(jié)構(gòu)相關(guān)。

PSTVd容易發(fā)生變異。幾個(gè)核苷酸的變換不僅影響致病性，而且影響到它的寄主范圍[8]。本研究構(gòu)建的PSTVd侵染性克隆在接種番茄后并未發(fā)生變異。保存質(zhì)?；蚓罕缺４嫒~片更為簡單經(jīng)濟(jì)。PSTVd侵染性克隆的構(gòu)建為毒源保存提供了一條新的途徑，也為下一步的遺傳操作奠定了基礎(chǔ)。

交互保護(hù)是植物與病原物互作中常見的現(xiàn)象[9-10]。當(dāng)植株被類病毒弱株系侵染之后，會(huì)對相近病毒包括PSTVd的強(qiáng)株系的侵染產(chǎn)生抗性[11]。PSTVd傳播途徑廣，莖尖脫毒難以剔除，實(shí)生種子也能傳播，生產(chǎn)上很難防治。能否通過定點(diǎn)突變構(gòu)建弱毒甚至無毒的PSTVd株系用于植物交叉保護(hù)，使馬鈴薯免受強(qiáng)株系的侵染，降低產(chǎn)量損失，尚需研究探討。

本研究構(gòu)建的PSTVd侵染性克隆在PSTVd序列的上、下游均有冗余序列，仍能在植物體內(nèi)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。如果在其末端連接功能基因也能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，將對研究基因功能或作為生物反應(yīng)器具有重要意義。因?yàn)镻STVd分子量小，其基因組僅具最小RNA病毒的1/10，容易構(gòu)建不同毒性的株系，并且接種簡單，比植物病毒載體更易進(jìn)行遺傳操作。

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