液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用*

戴冬艷，朱靜毅，聞琍毓

(江蘇省揚(yáng)州藥品檢驗(yàn)所，揚(yáng)州 225009)

高效液相色譜(HPLC)是以液體作為流動相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。高效液相的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因此應(yīng)用范圍廣。近年來高效液相色譜法在藥物分析中占主要地位，據(jù)《美國藥典》22版記載，HPLC在含量測定方法中位居第一。

質(zhì)譜(MS)是強(qiáng)有力的結(jié)構(gòu)解析工具，能夠?yàn)榻Y(jié)構(gòu)定性提供較多的信息，是理想的色譜檢測器，不僅特異，而且具有極高的檢測靈敏度。串聯(lián)質(zhì)譜法是質(zhì)量分離的質(zhì)譜檢測技術(shù)，在單級質(zhì)譜給出化合物相對分子量的信息后，對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級裂解，進(jìn)而獲得豐富的化合物碎片信息，確認(rèn)目標(biāo)化合物，對目標(biāo)化合物定量［1］。串聯(lián)質(zhì)譜具有更高的選擇性和靈敏度，其檢測水平可以達(dá)到pg級。

液相色譜－質(zhì)譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC－MS/MS)技術(shù)將液相高效的在線分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的檢測能力相結(jié)合，可以同時(shí)得到化合物的保留時(shí)間、分子量及特征結(jié)構(gòu)碎片等豐富的信息，是組分復(fù)雜樣品和微量樣品分離分析最有力的研究手段。與氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)相比，GC－MS法對揮發(fā)性未知成分與微量成分的結(jié)構(gòu)分析具有獨(dú)到之處，但是GC－MS法的應(yīng)用范圍有限，因?yàn)樗芯康乃幬飿悠繁仨殮饣孰y以用于極性、熱不穩(wěn)定和大分子化合物的測定。LC－MS不受上述限制，且分析前樣品預(yù)處理簡單，一般無需衍生化或水解，這使得LC－MS聯(lián)用技術(shù)具有更廣闊的應(yīng)用前景。近年來，LC－MS聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛，在藥物及其代謝產(chǎn)物的定性和定量研究中發(fā)揮了極其重要的作用，本文綜述了近年來LC－MS聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用。

1 液質(zhì)聯(lián)用儀器

液質(zhì)聯(lián)用儀主要由液相色譜儀、質(zhì)譜儀、離子源組成。離子源即“接口”技術(shù)，就是將高流量的液相色譜和高真空的質(zhì)譜體系進(jìn)行“聯(lián)用”，將欲分析的樣品電離，得到帶有樣品信息的離子，使其進(jìn)入質(zhì)譜的真空系統(tǒng)，這一度曾是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展的“瓶頸”。一直到電噴霧技術(shù)和大氣壓化學(xué)電離技術(shù)的完善成熟，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)才得到快速的發(fā)展。當(dāng)前使用廣泛的接口技術(shù)有:熱噴霧(TSP)、等離子體噴霧(PSP)、粒子束(LINC)、大氣壓電離(API)和動態(tài)快原子轟擊(FAB)［2］。API主要包括電噴霧離子化(ESI)、離子噴霧離子化(ISI)和大氣壓化學(xué)離子化(APCI)3種模式。這3種的共同點(diǎn)是樣品的離子化在處于大氣壓下的離子化室內(nèi)完成，離子化效率高，大大增強(qiáng)了分析的靈敏度和穩(wěn)定性。質(zhì)譜分析器是液質(zhì)聯(lián)用的核心，是確保儀器具有高靈敏性、高準(zhǔn)確性、高選擇性、分析檢測范圍寬等強(qiáng)大功能的重要部分。液質(zhì)聯(lián)用儀中常用的質(zhì)譜包括串聯(lián)四級桿、離子阱、四級桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜等。這些質(zhì)譜各有特點(diǎn)，結(jié)合同位素標(biāo)記等技術(shù)，在藥物分析領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

2 在藥物成分分析中的應(yīng)用

LC－MS不僅具有足夠的靈敏度選擇性，同時(shí)還能夠給出一定的結(jié)構(gòu)信息，分析快速而且方便，為藥物鑒定提供了一種更高效、更有效的方法。

2.1 天然藥物成分分析 中藥藥物成分復(fù)雜多樣，定性分析方劑成分是一項(xiàng)復(fù)雜且耗時(shí)的工作。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在對中藥成分分析時(shí)，液相色譜對各成分進(jìn)行在線分離，質(zhì)譜檢測器可以給出大量的結(jié)構(gòu)信息，可對未知成分進(jìn)行直接分析;且樣品不需要進(jìn)行煩瑣和復(fù)雜的處理，因此在中藥成分分析中得到廣泛應(yīng)用。

侯鵬飛等［3］采用液質(zhì)聯(lián)用(HPLC－ESI－TOF/MS)技術(shù)分析了延胡索中的生物堿類成分，以ESI－MS獲得的準(zhǔn)分子離子峰確定化合物分子量，結(jié)合紫外光譜、HPLC的保留時(shí)間等信息鑒定了延胡索中的11個生物堿類成分。薛長暉［4］采用液質(zhì)聯(lián)用法對山西苦蕎中的黃酮類化合物進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)山西靈丘地區(qū)產(chǎn)的苦蕎提取液中黃酮類化合物以蘆丁為主，并分離出5種黃酮類化合物。

2.2 抗生素成分分析 許多抗生素品種由于其產(chǎn)生菌絕大多數(shù)都是產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相似的多組分復(fù)合物，用常規(guī)分析方法對其進(jìn)行快速鑒別和相關(guān)物質(zhì)分析比較困難，藥品質(zhì)量難以控制。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以其強(qiáng)有力的分離和分析能力，在這類抗生素藥物成分分析和相關(guān)物質(zhì)的鑒定上顯示了巨大優(yōu)勢。

馬鳳余等［5］應(yīng)用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定頭孢地嗪中異構(gòu)體雜質(zhì)的方法。在所建立的色譜條件下，頭孢地嗪及其異構(gòu)體雜質(zhì)獲得有效分離，并通過串聯(lián)ESI質(zhì)譜在線檢測，獲得相關(guān)的色譜和質(zhì)譜信息，結(jié)果鑒定出頭孢地嗪熱降解的異構(gòu)體雜質(zhì)為反式異構(gòu)體及Δ3異構(gòu)體。Min Hu等［6］應(yīng)用LC－MS技術(shù)鑒定了十六環(huán)大環(huán)內(nèi)酯抗生素。

2.3 中成藥、保健品、食品中非法添加化學(xué)藥物成分的鑒定分析 近年來，一些不法商人為牟取暴利，在中成藥、保健品和食品中非法添加化學(xué)藥物，患者在不知情的情況下大量服用，可能造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，嚴(yán)重威脅到人類健康。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以其靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用到非法添加藥物成分的鑒別中，成為打假治劣的一把利劍。

2.3.1 中藥制劑中非法添加化學(xué)藥物成分 目前中藥制劑中非法摻入化學(xué)藥物成分且同時(shí)摻入多種低濃度化合物是新動態(tài)之一?？癸L(fēng)濕類中藥多數(shù)顯效慢，需長期服用，但安全性高;西藥非甾體抗炎藥中絕大多數(shù)兼有抗風(fēng)濕作用，此外糖皮質(zhì)激素類亦具有抗風(fēng)濕及類風(fēng)濕作用。這些西藥的共同特點(diǎn)是療效迅速，但長期服用副作用大，嚴(yán)重的可危及患者生命。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合相對分子量一級二級質(zhì)譜碎片，可準(zhǔn)確快速地判斷中藥制劑中是否摻入阿司匹林、氨基比林、布洛芬、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛這些西藥［7］。來國防等［8］采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測補(bǔ)腎壯陽類中藥制劑中非法添加的化學(xué)成分西地那非和他迭拉非，此法靈敏準(zhǔn)確，可用于補(bǔ)腎壯陽類中藥制劑的質(zhì)量檢驗(yàn)。伴隨人們飲食習(xí)慣的改變，糖尿病的發(fā)病率呈上升趨勢，因此降糖類中藥制劑需求日益增大。但一些不法分子擅自在中成藥中摻入化學(xué)降糖藥，對患者的健康及生命安全造成了重大危害。李曉燕等［9］應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立了降糖類中成藥中非法添加降糖化學(xué)成分的快速定性方法，此法能同時(shí)鑒別降糖中藥中是否添加鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、格列吡嗪、鹽酸吡格列酮、格列齊特、格列本脲、格列美脲7種化學(xué)藥品。

2.3.2 保健食品中非法添加化學(xué)藥物成分 近年來，隨著生活水平的提高，保健品進(jìn)入到更多的家庭中去。但是不法分子為了突顯療效，在保健品中加入化學(xué)成分的現(xiàn)象非常普遍。崔福春等［10］應(yīng)用 LCMS/MS法建立了安神類保健品中非法添加21種化學(xué)成分的快速測定方法，該方法采用多反應(yīng)監(jiān)測的方式檢測，干擾少，靈敏度高，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。閆韶華［11］應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用儀建立了保健食品中非法添加藥物——茶堿成分定性定量的方法，該方法可用于保健食品中非法添加藥品茶堿成分的測定和確定。關(guān)日晴等［12］應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立了保健品中非法添加的6種腎上腺皮質(zhì)激素的檢驗(yàn)方法，該方法可同時(shí)對《中國藥典》收載的醋酸地塞米松、醋酸可的松、醋酸氫化可的松、醋酸潑尼松、醋酸潑尼松龍和倍他米松6種常用口服腎上腺皮質(zhì)激素進(jìn)行檢查，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

2.3.3 食品中非法添加化學(xué)藥物成分 河南省部分地區(qū)“瘦肉精”事件曝光后，引起國家各級部門高度重視，也使廣大人民群眾對食品安全的問題極為關(guān)注。引起人體中毒的“瘦肉精”主要是β－腎上腺素興奮劑中的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇。王秀穎等［13］建立了高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測豬肉中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇?xì)埩舻姆椒?，本法能快速、高靈敏、同步檢測出這3種化學(xué)成分。液質(zhì)聯(lián)用對于檢測禁用和限用的食品添加劑具有顯著優(yōu)勢，還可以大大提高工作效率，能滿足食品衛(wèi)生學(xué)評價(jià)的要求，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

3 在藥物含量測定中的應(yīng)用

藥物含量測定是藥物分析中主要的一個方面，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對于成分復(fù)雜、微量藥物定量具有優(yōu)勢，因此在中藥含量測定和藥物殘留測定時(shí)應(yīng)用廣泛。

3.1 在藥物成分含量測定中的應(yīng)用 嚴(yán)志宏等［14］采用LC－MS/MS法，建立了金櫻子中熊果酸和齊墩果酸的含量測定方法。該法測定的熊果酸和齊墩果酸的平均加樣回收率分別為98.1%(RSD為2.7%)和97.6%(RSD 為2.9%)，方法快速簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于金櫻子的質(zhì)量控制。中成藥附子理中丸具有溫和健脾等功能，但其有效成分雙酯型生物堿毒性很強(qiáng)，因此對含有附子的藥品中雙酯型生物堿的檢測和控制就非常重要。索志榮等［15］采用LC－MS測定附子理中丸中3種雙酯型生物堿——新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的含量，結(jié)果新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿平均回收率分別為98.7%(RSD為2.9%)、98.6%(RSD 為3.0%)和 98.1%(RSD 為 3.2%)，為評價(jià)和控制附子理中丸的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2 在藥物殘留測定上的應(yīng)用 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)出現(xiàn)以前，殘留藥物由于其含量低，檢測方法落后，因此沒有引起人們的重視。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是微量和痕量成分檢測很有效的方法，被廣泛應(yīng)用于藥物殘留的測定上。于慧娟等［16］采用HPLC/MS/MS建立了分析魚體中氯丙嗪殘留的方法，適合于魚類樣品中氯丙嗪的殘留檢測。田艷玲等［17］采用液相色譜－串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法測定牛奶中的氯霉素殘留量。程樸［18］經(jīng)過試驗(yàn)，建立了一種靈敏度高、結(jié)果可靠性高的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析法測定馬鈴薯樣品中的喔草酯殘留量。該方法殘留測定最小檢出量為2×10－8g，符合一般農(nóng)藥殘留分析要求。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)由于其自身特點(diǎn)，在藥物殘留檢測上具有廣闊的前景，對于控制食品、藥品質(zhì)量意義重大。

4 在藥代動力學(xué)、藥物代謝學(xué)中的應(yīng)用

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在分析藥物及其在各種復(fù)雜生物體基質(zhì)(全血、血漿、尿、膽汁及生物組織)中的代謝產(chǎn)物時(shí)，由于其選擇性強(qiáng)、靈敏度高，不僅可以避免復(fù)雜、煩瑣、耗時(shí)的樣品前處理工作，而且能分離、鑒定難于辨識的痕量藥物代謝產(chǎn)物，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜的應(yīng)用，通過多反應(yīng)檢測(MRM)，可以提高分析的專一性，改善信噪比，提高靈敏度，從而快速方便地解決問題。

4.1 在藥代動力學(xué)研究中的應(yīng)用 人體(或動物)在接受藥物后，藥物經(jīng)吸收、分布、代謝、排泄等過程，在體液中有濃度低、代謝復(fù)雜且代謝產(chǎn)物多等特點(diǎn)。通過應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可建立簡便靈敏的體內(nèi)分析方法，為該藥在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究提供一種可靠的檢測手段。

譚志榮等［19］利用高效液相色譜－質(zhì)譜檢測方法，研究普伐他汀的人體藥動學(xué)。血漿樣品經(jīng)固相萃取，以Thermo Hypurity C18柱為色譜柱，流動相為乙腈－0.2%甲酸水溶液(85∶15)，流速為 0.2 m l/min;采用ESI正離子方式進(jìn)行檢測。結(jié)果普伐他汀在2.52～660μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;絕對回收率均在70%以上，相對回收率為98% ～102%，日內(nèi)、日間 RSD均＜15%，可用于普伐他汀血藥濃度檢測和藥動學(xué)研究。趙恒利［20］等建立LC－MS/MS法測定人血漿中氯馬斯汀的濃度，該方法操作簡便，分析周期短，定量限可達(dá)0.01 ng/ml，可用于氯馬斯汀口服給藥的藥代動力學(xué)和生物等效性研究。

4.2 在藥物代謝研究中的應(yīng)用 國內(nèi)外多有采用LC－MS法進(jìn)行藥物代謝研究，不僅可以避免復(fù)雜的分離純化代謝物樣品，而且能分離鑒定難于辨識的痕量代謝產(chǎn)物，可以大大提高分析的專一性和靈敏度。

近年來在藥物研究中用LC－MS/MS進(jìn)行高通量生物分析的發(fā)展，應(yīng)用快速液相萃取，高效毛細(xì)管的LC－MS/MS，檢測多種藥物血中、尿中的藥物原型及其代謝產(chǎn)物［21］。徐友宣等［22］研究沙美特羅在小鼠體內(nèi)的代謝過程，尿樣經(jīng)固相提取后用LC－MS－MS分析，根據(jù)代謝知識和陽性尿的響應(yīng)數(shù)據(jù)，得出了沙美特羅的原型和四種代謝產(chǎn)物——羥基沙美特羅、羥基－甲氧基－沙美特羅、羰基－沙美特羅、羰基－羥基沙美特羅，從而推測沙美特羅可能的主要代謝途徑為羰基化、甲基化以及兩者的結(jié)合。趙宇峰等［23］采用人腸內(nèi)細(xì)菌和烏頭堿體外溫孵的方法，探討烏頭堿的代謝產(chǎn)物16－O－去甲基去氧烏頭堿在人腸內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化。利用ESIMS/MS方法直接分析16－O－去甲基去氧烏頭堿的代謝產(chǎn)物，烏頭類生物堿在ESI正離子模式下形成質(zhì)子化分子，結(jié)果成功檢測并鑒定了16－O－去甲基去氧烏頭堿被人腸內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化，通過脫乙?；?、脫苯甲?；⒚摷谆?、脫羥基以及酯化反應(yīng)產(chǎn)生新型的單酯型、雙酯型和脂類生物堿等10余種代謝產(chǎn)物。

總之，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于藥物及其代謝產(chǎn)物研究是該技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛、研究論文報(bào)道最多的領(lǐng)域。液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢，代表了藥物代謝研究的發(fā)展趨勢。

近年來，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用在技術(shù)及應(yīng)用方面取得了很大進(jìn)展，在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，且在生物大分子分析(如在蛋白質(zhì)分離和鑒定上應(yīng)用)和臨床診斷中都發(fā)揮重要作用［24］。隨著現(xiàn)代化高新技術(shù)的不斷發(fā)展及液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)自身的優(yōu)點(diǎn)，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)必將在未來幾年不斷發(fā)展且在藥物分析中發(fā)揮越來越重要的作用。

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