3種酒精發(fā)酵工業(yè)廢液厭氧消化特性研究

王建政， 朱玉霞， 夏偉民

(1.車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室， 河南 南陽 4730000; 2.河南南陽天冠企業(yè)集團， 河南 南陽 473000;3.河南上延安全技術(shù)服務(wù)有限公司， 河南 鶴壁 458000)

酒糟液是含淀粉原料(如小麥、玉米、木薯等)經(jīng)過酒精發(fā)酵(酵母為接種物)、蒸餾出乙醇后剩余的廢液，它含有大量的有機物殘渣，其干物質(zhì)成分主要是粗蛋白、粗脂肪和粗纖維[1-4]，粗纖維又包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等成分。酒糟液是酒精發(fā)酵工業(yè)的主要廢水，混排量大，但可以采用沼氣發(fā)酵厭氧消化處理。傳統(tǒng)上的燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)一般采用單一的原料，如玉米、小麥或木薯，進行發(fā)酵。近年來，為了糧食戰(zhàn)略安全，國家提倡原料多元化的燃料乙醇生產(chǎn)模式[5]，因此國內(nèi)部分企業(yè)開始實施將玉米、小麥和木薯等原料混合的乙醇發(fā)酵工藝[6-7]。由于發(fā)酵原料由單一到混合，酒糟廢水的組成成分也發(fā)生了很大的改變，這種改變對后續(xù)沼氣厭氧消化的影響，目前還沒見到國內(nèi)有研究文獻報道。文章著重考察玉米、小麥和木薯3種原料混合酒精發(fā)酵模式對后續(xù)的廢水處理程序—沼氣發(fā)酵過程的影響。

1 主要實驗儀器

箱式電阻爐(BW GWL558，東莞市博威儀器設(shè)備有限公司)；沼氣分析儀(Geotech GA2000，英國)；萬位天平(Sartorious BSA224S-CW，德國)；水分測定儀(Sartorious MA160，德國)；恒溫培養(yǎng)箱(DHG 9626A，上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；元素分析儀(Elementar Vario ELⅢ，德國)；熱分析儀(Setaram Setsys 16/18，法國)；瓊脂糖凝膠電泳儀(Invitrogen G8100/G8200，美國)；超微量分光光度計(NanoDrop 2000，美國)；DNA測序儀(Illumina Miseq PE250，美國)。

2 試驗材料、裝置和流程

2.1 試驗材料

新鮮蒸餾后的酒糟樣品來自豫南某乙醇生產(chǎn)企業(yè)的3個不同燃料乙醇廠，分別記為ZR，MR，CR，其中ZR代表玉米糟液(Zea fermentation alcohol distillation residue)，MR代表復(fù)合糟液(Mixed material fermentation alcohol distillation residue)，CR代表木薯糟液(Cassava material fermentation alcohol distillation residue)。ZR和CR的發(fā)酵原料分別為玉米和木薯，MR采用的是復(fù)合發(fā)酵原料，質(zhì)量比分別為：玉米(40%)、小麥(40%)和木薯(20%)。

根據(jù)傳統(tǒng)的沼氣發(fā)酵分析方法[8]，采用水分分析儀測量3種糟液中的總固體含量(Total solids)。將部分干物質(zhì)(TS)粉碎過篩(60目)，按照國家標準方法測定粗蛋白(CP)(GB/T6432-1994)、粗灰分(Ash)(GB/T6438-2007)、粗脂肪(EE)(GB/T6433-2006)和中性洗滌纖維(NDF)(GB/T 20806-2006)的含量。結(jié)果如表1所示。

表1 3種糟液的干物質(zhì)含量和化學成分 (%)

采用元素分析儀測定樣品的C，H，O，N含量。采用熱分析儀測定樣品的熱失重(Thermogravimetry，TG)和微商熱失重(Derivative Thermogravimetry，DTG)。熱失重(TG)表示的是樣品的總質(zhì)量減少量隨溫度的變化曲線，微商熱失重(DTG)表示的是總質(zhì)量減少率隨溫度的變化曲線[9]。

2.2 沼氣發(fā)酵裝置和流程

本實驗采用自制的發(fā)酵裝置(見圖1)進行厭氧消化試驗(沼氣發(fā)酵)。該裝置主要由厭氧發(fā)酵裝置、溫度控制裝置和集氣裝置3部分組成。發(fā)酵裝置為2 L發(fā)酵瓶，集氣裝置為1 L寬口瓶，用橡膠塞密封。發(fā)酵瓶與集氣裝置之間采用膠管與玻璃管連接，瓶蓋與管道嚴格密封，保證厭氧環(huán)境。將發(fā)酵瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中進行恒溫發(fā)酵。整個實驗裝置的產(chǎn)氣量采用向下排水(飽和鹽水)集氣法測量。根據(jù)理想氣體定律和測量溫度，將產(chǎn)氣量換算為標準條件下的氣體體積，除以基質(zhì)干物質(zhì)質(zhì)量(TS質(zhì)量)，即當日甲烷產(chǎn)量(單位質(zhì)量干物質(zhì)日產(chǎn)氣量)。采用便攜式沼氣分析儀測定沼氣中CH4的含量。以上數(shù)據(jù)在每天定時測量。

圖1 沼氣發(fā)酵裝置示意圖

本研究以ZR，MR和CR全糟液為底物，采用序批式單相厭氧發(fā)酵模式進行沼氣發(fā)酵試驗。以河南省南陽市某沼氣公司的厭氧活性污泥為沼氣發(fā)酵接種物。將培養(yǎng)料(ZR，MR或CR)放入發(fā)酵瓶中，接好活性污泥，加水定容至1 L，關(guān)閉發(fā)酵裝置，放入恒溫生化培養(yǎng)箱進行恒溫發(fā)酵，然后以沼氣產(chǎn)量和甲烷含量作為考核指標。沼氣發(fā)酵液初始固形物含量(TS%)控制在8 %(含活性污泥干重)，活性污泥量(干質(zhì)量)控制在每瓶8 g，發(fā)酵溫度控制在35℃±1℃。按規(guī)定時間每天攪拌1次，每次攪拌1分鐘，發(fā)酵60 d。每種原料(ZR，MR或CR)重復(fù)5次。

2.3 DNA測序和菌譜分析

在無菌條件下，用改進的氯苯法從產(chǎn)甲烷高峰期的發(fā)酵液中提取總DNA[10]。經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳，選擇DNA樣品(濃度>10 ng·μL-1；OD260/280在 1.8～2.2 之間；瓊脂糖凝膠電泳主帶清晰、雜質(zhì)較少且無嚴重拖尾現(xiàn)象)，用引物515F Modified[11]和806R Modified[12](見表2)進行16S rRNA 基因的擴增。擴增后的產(chǎn)物進行純化和定量。

表2 基因擴增引物

利用Illumina miseq PE250平臺，對純化的擴增樣品進行高通量測序。使用軟件Flash v1.2.7 (http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)拼接每個樣本兩端的序列，得到原始序列。使用軟件Qiime v1.9.0 (http://qiime.org/)過濾原始序列以獲得高質(zhì)量的序列。使用軟件Usearch v8.0 (http://www.drive5.com/usearch/)檢測嵌合序列，剔除后獲得有效序列。根據(jù)16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫-Silva數(shù)據(jù)庫(Release115，http://www.arb-silva.de)，注釋所有OTUs對應(yīng)的細菌和古細菌分類信息。利用Origin Pro 2017對豐度比大于2%的門、屬進行統(tǒng)計，并用百分率直方圖直觀地顯示細菌譜信息。

用SPSS v18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(p<0.05表示差異顯著)，結(jié)果以“均值±標準差”的方式表示。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 產(chǎn)氣速率和甲烷含量測定

本文分別采用玉米酒糟液(ZR)、混合原料酒糟液(MR)和木薯酒糟液(CR)作為培養(yǎng)底物進行沼氣厭氧發(fā)酵試驗，各試驗組在發(fā)酵初期產(chǎn)氣量很??；隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)氣量逐漸增加(見圖2～圖4)，分別在第8天(ZR)，第14天(MR)和第20天(CR)達到高峰，最高日產(chǎn)氣量分別為24.77，14.69和12.96 mL·g-1d-1。此后產(chǎn)氣量呈下降趨勢。各實驗組的累積產(chǎn)氣量由小到大依次為CR < ZR < MR，分別為177.11，211.44和223.8 mL·g-1。若將累積產(chǎn)氣量達到總產(chǎn)氣量的90%作為發(fā)酵周期，則發(fā)酵周期由長到短依次為CR > MR > ZR，分別為37 d，35 d和26 d。

圖2 玉米糟液ZR的產(chǎn)氣曲線

圖3 混合原料發(fā)酵糟液MR的產(chǎn)氣曲線

圖4 木薯糟液CR的產(chǎn)氣曲線

對產(chǎn)氣量最高日的沼氣甲烷含量進行統(tǒng)計分析，與ZR，MR，CR這3個試驗組相對應(yīng)的甲烷含量分別為64.33%±15.27%%，67.98%±14.78%和58.79%±11.23%(見表3)。

圖5 3種糟液日產(chǎn)氣量比較

表3 沼氣中的甲烷含量(最高產(chǎn)氣日) (%)

3.2 微生物群落分析

筆者對3組底物的沼氣厭氧發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)進行了考察。引物515F Modified和806R Modified能夠同時對細菌和古菌的16S rRNA基因進行擴增[13-14]。根據(jù)高通量測序結(jié)果進行分類統(tǒng)計，得到的門、綱、目、科、屬等分類水平的菌群譜，能夠反映分類學水平上沼氣發(fā)酵料液中細菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)。

圖6 微生物菌譜豐度柱形圖(門級分類)

如圖6所示，在微生物群落結(jié)構(gòu)的門級上，ZR實驗組厭氧消化水中相對豐度排名前3位的分別是變形菌門(Proteobacteria，39.63%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，28.88 %)和厚壁菌門(Firmicutes，13.29%)；MR實驗組排名前3的分別是變形菌門(Proteobacteria，33.53 %)、厚壁菌門(Firmicutes，20.95%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，18.42 %)；CR實驗組占比前3位的分別是變形菌門(Proteobacteria，28.78 %)、擬桿菌門(Bacteroidetes，23.16%)和厚壁菌門(Firmicutes，13.64 %)；在3種厭氧消化體系中，還發(fā)現(xiàn)有綠彎菌門細菌(Chloroflexi)，其相對豐度分別為2.23,%，3.06%和2.16%。細菌中的厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，以及古菌中的產(chǎn)甲烷微菌屬都是常見的沼氣發(fā)酵優(yōu)勢菌群[15-18]。變形菌門(Proteobacteria)包括許多互營共生菌，具有降解長鏈脂肪酸的作用[19]，能夠水解氨基酸、長鏈脂肪酸及淀粉等物質(zhì)，部分細菌具有脫氮作用[20]，它們大多數(shù)營兼性或者專性厭氧，尤其是其中的β-變形菌綱(Betaproteobacteria)，在工業(yè)污水處理廠和市政污水處理廠的污泥中，均為優(yōu)勢菌群[21-22]。擬桿菌門(Bacteroidetes)的菌群能將大的有機化合物(如多糖、脂肪和蛋白質(zhì))水解成小的有機酸、單糖、低級醇和氨基酸[23-24]。厚壁菌門(Firmicutes)可以降解碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)，也是降解揮發(fā)性脂肪酸的主要菌群[25]。類桿菌和硬壁菌是產(chǎn)氫/產(chǎn)酸細菌。綠彎菌門(Chloroflexi)是一種重要的葡萄糖降解菌，能與產(chǎn)甲烷菌競爭，并能利用氫氣[26]。

圖7 微生物菌譜豐度柱形圖(細菌屬級分類)

圖8 微生物菌譜豐度柱形圖(古菌屬級分類)

廣古菌門包含了古細菌中的大多數(shù)種類，是主要的產(chǎn)甲烷菌[36]，其中的甲烷髦毛菌屬(Methanosaeta)和產(chǎn)甲烷桿菌屬(Methanobacterium)是分布最廣泛的古菌屬[37]。如圖8所示，在本論文中，ZR實驗組厭氧消化的水體中，相對豐度占比前3位的古菌屬分別是甲烷螺菌屬(Methanospirillum，32.64%)、甲烷囊菌屬(Methanoculleus，30.72%)和甲烷鬃菌屬(Methanosaeta，24.34%)；MR實驗組的前3位分別是甲烷鬃菌屬(Methanosaeta，50.04%)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina，17.02%)和甲烷螺菌屬(Methanospirillum，14.48%)；CR實驗組的前3位分別是甲烷鬃菌屬(Methanosaeta，80.30%)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina，8.84%)和甲烷螺菌屬(Methanospirillum，6.81%)，甲烷囊菌屬(Methanoculleus，30.72%)的相對豐度降低到了0.80%。Methanosaeta能夠利用醋酸鹽等酸類物質(zhì)生成甲烷和CO2，是乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[38-40]。Methanobacterium常分布在高溫污泥、中溫污泥中，主要代謝的底物是H2，CO2，甲酸鹽和甲醇[41]。此外，甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)也屬于優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌，該菌可以通過食氫甲烷途徑和食乙酸產(chǎn)甲烷途徑進行甲烷合成[42]，有些菌種還能夠以甲酸或甲醇為發(fā)酵底物進行甲烷合成[43]，是低溫環(huán)境下維持沼氣池正常產(chǎn)氣的關(guān)鍵菌屬[44]。甲烷螺菌屬(Methanospirillum)和甲烷囊菌屬(Methanoculleus)也都是嚴格的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群。

沼氣發(fā)酵過程中，產(chǎn)甲烷菌與非產(chǎn)甲烷菌相互依存、相互制約，維持厭氧消化環(huán)境的動態(tài)平衡。整個沼氣發(fā)酵過程的產(chǎn)氣量取決于各菌群的協(xié)調(diào)性。以Clostridiumsensustricto為代表的初級發(fā)酵菌在原核生物群落中所占比例很高，但并不是影響甲烷生產(chǎn)效率的決定性因素[45-46]。MR實驗組的沼氣發(fā)酵產(chǎn)量較高，甲烷含量也較高，這可能是由于MR糟液的生物質(zhì)組成更適合于相關(guān)菌群之間協(xié)調(diào)的緣故。

3.3 元素分析

玉米糟液(ZR)、混合原料糟液(MR)和木薯糟液(CR)的干物質(zhì)(TS)元素分析結(jié)果見表4所示。其中，木薯糟液干物質(zhì)中N元素含量較低，僅為1.04%±0.19%，其C/N值高達48.17，這可能是由于原料木薯中的蛋白質(zhì)含量較低的緣故(見表1)。

沼氣發(fā)酵原料的碳氮比一般維持在25～30∶1左右，才能獲得持久均衡的產(chǎn)沼氣能力[47-48]，3種糟液的干物質(zhì)化學組成(見表1)和元素比例(見表4)的差異，可能影響到它們在厭氧消化過程中的產(chǎn)甲烷特性，例如產(chǎn)氣速率、累積產(chǎn)氣量和沼氣成分等。

3.4 熱分解譜分析

自然狀態(tài)下的生物質(zhì)大分子常常具有獨特的晶型結(jié)構(gòu)，例如纖維素即是一種高結(jié)晶度纖維結(jié)構(gòu)，其晶胞類型可以分為纖維素Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ[49]；這些晶型結(jié)構(gòu)阻礙了微生物胞外水解酶與底物大分子的微觀空間接觸[50]，降低了酶的水解效果，增強了底物的抗微生物降解的能力[51]。因此常須借助汽爆[49]、表面活性劑和離子液體[52]、微波和化學處理(酸或堿)[53]等方法對纖維質(zhì)原料進行預(yù)處理，以期改變其超微結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度，提高酶解效果。生物質(zhì)熱裂解是指生物質(zhì)在受熱過程中，其物理結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)發(fā)生變化，包括結(jié)晶區(qū)的破壞[54]、揮發(fā)性成分溢出、糖苷鍵斷裂和聚合度下降，以及游離糖單元的分解等過程。借助熱裂解分析技術(shù)，如熱重分析(TG)和微商熱重分析(DTG)，可以研究纖維素等生物質(zhì)大分子晶型結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[55-56]。

表4 糟液干物質(zhì)的元素分析

本文研究了ZR，MR和CR這3種糟液干物質(zhì)在不同加熱階段的熱失重(TG)和微商熱失重(DTG)曲線。從圖9～圖12可以清楚地看出，3種樣品在TG和DTG曲線上的失重明顯表現(xiàn)為文獻[57-58]所描述的4個熱降解階段：第1階段發(fā)生在溫度從室溫上升到250℃左右時，質(zhì)量損失是由水和二氧化碳的受熱釋放引起的，這可能涉及重排反應(yīng)，如物質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的脫水、化學鍵斷裂和過氧化氫基團的形成等[59-60]。第2階段發(fā)生在250℃～450℃之間。在這一階段，DTG曲線上有一個明顯的失重峰，其質(zhì)量損失是由纖維素、半纖維素、部分木質(zhì)素和非纖維素組分的分解引起的：半纖維素在200℃～300℃左右分解；纖維素在310℃～400℃左右分解[61]；木質(zhì)素在半纖維素和纖維素降解的整個過程中降解[62]。第3階段發(fā)生在450℃～600℃之間。這一階段的質(zhì)量損失與木質(zhì)素的分解和灰分的形成有關(guān)，這可能涉及C-C鍵和C-H鍵的進一步斷裂以及殘余固體中碳的富集[63]。之后，炭化樣品的分解速率趨于平緩，質(zhì)量不再發(fā)生顯著變化。

圖9 ZR干物質(zhì)熱分解曲線

圖10 MR干物質(zhì)熱分解曲線

圖11 CR干物質(zhì)熱分解曲線

此外，上述熱分解曲線顯示，ZR，MR和CR這3種酒糟干物質(zhì)樣品的Tmax值分別為300℃，320℃和350℃(如圖12所示)。Tmax值表示樣品達到最大降解速率時的溫度，此時分子結(jié)構(gòu)變化最劇烈、樣品失重速度最快。CR干物質(zhì)的Tmax值最高，說明其所含大分子的晶型結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，更不容易降解。生物質(zhì)大分子常以共價鍵的形式，彼此之間形成諸如蛋白聚糖[64]、糖蛋白[65]和糖脂[66]等復(fù)合物，這些復(fù)合物在不同來源的原料中，其分子晶型結(jié)構(gòu)(如晶胞類型，結(jié)晶區(qū)、非結(jié)晶區(qū)的比例)和相對含量也千差萬別[49,67-71]，因而它們抵抗微生物降解的能力也有很大差異[51]，這種差異對其厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷等生化過程產(chǎn)生重大影響[72]。本試驗中Tmax值的差異顯示了ZR，MR和CR這3個試驗組之間發(fā)酵底物的分子組成和晶型結(jié)構(gòu)的差異，這可能是導(dǎo)致它們在沼氣消化階段表現(xiàn)出不同的發(fā)酵特性的原因。

圖12 3種干物質(zhì)樣品的Tmax值比較

4 結(jié)論

(1)以復(fù)合糟液(MR)為底物的厭氧消化產(chǎn)氣量最高(223.8 mL·g-1)；以玉米糟液(ZR)為底物的厭氧消化發(fā)酵周期最短(26天)；以木薯糟液(ZR)為底物的厭氧消化的沼氣中甲烷含量最低(58.79%)。

(2)在厭氧消化微生物群落中，ZR試驗組相對豐度排名前3位的依次是變形菌門(39.63%)、擬桿菌門(28.88 %)和厚壁菌門(13.29%)；MR試驗組排名前3的依次是變形菌門(33.53 %)、厚壁菌門(20.95%)和擬桿菌門(18.42 %)；CR試驗組占比前3位的依次是變形菌門(28.78 %)、擬桿菌門(23.16%)和厚壁菌門(13.64 %)。

(3)在3種糟液干物質(zhì)中，ZR試驗組的碳氮比(C/N)最高，達到48.17，其干物質(zhì)熱分解Tmax值也最高，達到了350℃。