天山雪蓮UDP葡萄糖-類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及功能分析

唐亞萍，原慧，覃建兵

新疆師范大學(xué)分子生物學(xué)與生物信息研究室，新疆 烏魯木齊 830053

黃酮類化合物是植物次生代謝過程中主要的產(chǎn)物之一，在植物的生理和形態(tài)學(xué)方面發(fā)揮著各種各樣的功能。黃酮類化合物能夠幫助植物抗紫外線、抵抗病原微生物的侵害、抗蟲害并在植物生殖過程中擔(dān)當(dāng)信使[1]。黃酮類化合物也是人類和動(dòng)物的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一，尤其在人類的營養(yǎng)和醫(yī)藥方面，黃酮類化合物具有抗輻射、抗氧化、抗癌及心血管疾病等方面發(fā)揮著重要的作用。

糖基轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于植物中，催化植物次生代謝產(chǎn)物的合成，是植物次生代謝過程中的重要部分，是天山雪蓮藥用化學(xué)成分花青素的生物合成的關(guān)鍵酶。UDP葡萄糖-類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (3GT) 催化UDP葡萄糖的糖基取代花色素的3-OH集團(tuán)，催化不穩(wěn)定的花色素糖苷形成各種穩(wěn)定的花色苷[2]，對(duì)花色素進(jìn)行糖基化修飾，以增加其穩(wěn)定性和水溶性。Kho等[3]1978年首次對(duì)3GT基因的遺傳調(diào)控和酶活性進(jìn)行報(bào)道，3GT基因是1984年采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米中分離而來[4]，隨后控制3GT基因活性的遺傳位點(diǎn)An1、An2和An3也在矮牽牛中被分離出來[5]。

天山雪蓮為新疆特有的珍惜名貴中藥，為國家三級(jí)保護(hù)漸危植物[6]，特殊的生長環(huán)境造就了其獨(dú)特的藥用價(jià)值。黃酮類化合物是天山雪蓮的主要藥用成分，在水母雪蓮Saussurea medusa、天山雪蓮 Saussurea involucrate和雪兔子Saussurea gossypiphora野生植株中，天山雪蓮總黃酮的抗氧化活性最高[7]。天山雪蓮花青素屬黃酮類化合物，具有抗氧化、抗輻射、抗癌等作用。由于人類對(duì)天山雪蓮自然資源的掠奪性開采，使得該物種瀕臨滅絕，目前有關(guān)天山雪蓮分子生物學(xué)的研究較少。本研究從天山雪蓮中克隆了3GT基因，運(yùn)用生物信息軟件對(duì)3GT基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，構(gòu)建了該蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的同源轉(zhuǎn)化，經(jīng)篩選得到轉(zhuǎn)基因天山雪蓮愈傷組織，其總黃酮含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因的愈傷組織。初步鑒定了天山雪蓮3GT基因在黃酮代謝途徑中的作用，為提高天山雪蓮中藥用化學(xué)成分黃酮類物質(zhì)及實(shí)現(xiàn)天山雪蓮花青素的人工生物合成的研究奠定基礎(chǔ)，為解決天山雪蓮資源匱乏提供參考。

1 材料與方法

1.1 天山雪蓮材料及實(shí)驗(yàn)試劑

野生天山雪蓮種子采集于天山“一號(hào)冰川”，挑選籽粒飽滿的種子50粒，經(jīng)滅菌后接入1/2 MS培養(yǎng)基內(nèi)[8]，待種子發(fā)芽長出真葉4~5片后使用。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)、LA Taq酶、3′-Full RACE Core Set Ver.2.0、限制性內(nèi)切酶 (TaKaRa公司)；TRIzol試劑、PCR 2.1 vector、PCR Super Mix、T4 DNA 連接酶 (Invitorgen公司)；RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司)；SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech公司)；乙酰丁香酮(Sigma公司)；潮霉素 B (Roche Diagnostics GmbH，Germany)。

1.2 天山雪蓮總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采用液氮研磨法用 TRIzol試劑提取天山雪蓮葉片、莖、根及愈傷組織總 RNA。按照RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA第一鏈。按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit及 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒說明書合成5′端及3′端完整的天山雪蓮葉片cDNA第一鏈。

1.3 天山雪蓮cDNA片段的同源克隆

根據(jù)3GT基因的同源序列利用Primer5.0及Oligo6.0設(shè)計(jì)基因特異引物FGT和RGT (表1)，以cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增天山雪蓮3GT基因的保守區(qū)域，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)Axygen的凝膠回收試劑盒回收目的條帶后連接到PCR2.1載體中，經(jīng)酶切鑒定送華大基因有限公司測(cè)序。

1.4 天山雪蓮 3GT基因的 3′ RACE和5′ RACE

根據(jù)測(cè)序獲得的cDNA片段，用生物信息軟件設(shè)計(jì)基因特異引物 (表1)，以cDNA第一鏈為模板，3′ RACE outer Primer、3′ RACE inner Primer、GTF1和GTF2為引物，進(jìn)行Nested PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃~ 50℃30 s，72 ℃ 1 min ，30個(gè)循環(huán) (每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃)；72 ℃延伸10 min。5′ RACE 以GTR1和GTR2為引物，按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件與3′ RACE反應(yīng)條件相同。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，PCR及酶切鑒定后測(cè)序。

表1 文中所用引物序列Table 1 Primer used in this study

1.5 cDNA全長擴(kuò)增

依據(jù) cDNA拼接序列，以基因特異引物FLGTF和 FLGTR，引物中劃線部分為 BglⅡ和NheⅠ酶切位點(diǎn)，對(duì)cDNA序列進(jìn)行全長擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min ，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

1.6 天山雪蓮3GT基因cDNA序列及其編碼蛋白氨基酸的序列分析

在 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) 和DNAMAN中進(jìn)行基因序列的同源比較，在NCBI中的ORF Finding進(jìn)行開放閱讀框的預(yù)測(cè)，用軟件DNAMEN對(duì)基因cDNA進(jìn)行核苷酸序列分析，在網(wǎng)站Clustal W2 (www.ebi.ac.uk/clustalw/)進(jìn)行氨基酸序列的同源序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 3GT基因的轉(zhuǎn)錄模式

用3GT基因的全長引物及用軟件Primer5.0及Oligo6.0設(shè)計(jì)，對(duì)3GT基因組織器官表達(dá)模式進(jìn)行分析。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin基因特異引物。

1.8 3GT基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將已獲得的 3GT基因全長及表達(dá)載體pCAMBIA1305.1同時(shí)用內(nèi)切酶BglⅡ和NheⅠ在恒溫水浴鍋中37 ℃雙酶切2 h以上。酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Escherchia coli DH5α，提取大腸桿菌質(zhì)粒，篩選陽性克隆，用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌農(nóng)桿菌 Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105中，用3GT全長基因特異引物進(jìn)行 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株，將檢測(cè)到的菌株命名為pS3GT。

1.9 3GT基因葉盤轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因愈傷組織的篩選

天山雪蓮葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小的葉盤，將該葉盤置于天山雪蓮愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng) 2 d，葉盤浸泡在含有pS3GT菌株及100 μmol/L乙酰丁香酮，OD600=0.5的MS液體培養(yǎng)基中10 min[9-10]。將共培養(yǎng)2 d的葉盤轉(zhuǎn)入含有8 mg/L潮霉素 (Hygromycin，hyg) 的天山雪蓮愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因愈傷組織的篩選[11]，45 d后，提取在抗性培養(yǎng)基上生長的愈傷組織的 DNA，用潮霉素基因的特異引物hptF和hptR (表1) 進(jìn)行轉(zhuǎn)基因愈傷組織的篩選。

1.10 轉(zhuǎn)基因愈傷組織的懸浮培養(yǎng)及紫外分光光度法測(cè)量總黃酮

將篩選到的轉(zhuǎn) 3GT基因的愈傷組織及非轉(zhuǎn)基因愈傷組織各0.2 g分別接入10 mL的N6液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)[12]，光周期為12 h，轉(zhuǎn)速110 r/min，培養(yǎng)溫度為25 ℃。分別培養(yǎng)4、8、12、16 d，試驗(yàn)重復(fù)3次。將培養(yǎng)的愈傷組織在60 ℃烘箱內(nèi)烘干，測(cè)量干重，并用80%乙醇，60 ℃浸泡過夜提取總黃酮，用紫外分光光度法測(cè)定[12]，波長為 510 nm，其蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與其吸光度的直線方程：C=0.09344A?0.00230797，r=0.9992 (C為總黃酮含量單位是g/L，A為光的吸收變量)，并測(cè)量雪蓮愈傷組織的總黃酮量。

2 結(jié)果與分析

2.1 天山雪蓮 UDP葡萄糖-類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA片段的分析

根據(jù)雙子葉植物3GT基因同源序列，運(yùn)用生物信息軟件設(shè)計(jì)的天山雪蓮 3GT基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，純化此擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果獲得1個(gè)327 bp的cDNA片段 (圖1) 經(jīng)生物信息軟件DNAMAN、Clustal W2及Blast分析發(fā)現(xiàn)該片段與菊科向日葵屬植物的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因UGT90A7 (GenBank Accession No. EU561019)高度同源，相似性達(dá)到100%，與鳶尾屬植物的3GT (GenBank Accession No. AB161175) 基因相似性為88%，表明實(shí)驗(yàn)獲得的cDNA片段為目的基因類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段。

2.2 天山雪蓮 UDP葡萄糖-類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因全長cDNA的克隆與序列分析

依據(jù)天山雪蓮中該基因cDNA片段的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物，用RACE技術(shù)克隆目的基因的3′和5′cDNA末端序列進(jìn)行，測(cè)序結(jié)果表明，其大小分別為570 bp和1 190 bp (圖1)。

圖1 3GT基因特異引物 RT-PCR、3′ RACE及5′ RACE擴(kuò)增Fig. 1 PCR products of RT-PCR, 3′ RACE and 5′RACE. M : DNA marker; 1: product of primers FGT and RGT; 2: product of 3GT 3′ RACE; 3: product of 3GT 5′ RACE.

對(duì)已獲得的3個(gè)cDNA片段進(jìn)行序列拼接，結(jié)果獲得了1個(gè)全長為1 721 bp的cDNA序列。在該 cDNA序列兩端設(shè)計(jì)基因特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，得到1個(gè)大小為1 698 bp的cDNA片段，將此 1 698 bp片段與目的基因的cDNA拼接序列進(jìn)行比對(duì)分析，分析結(jié)果顯示兩序列一致，這表明天山雪蓮3GT基因cDNA拼接序列正確。天山雪蓮3GT基因全長含有1 548 bp的開放閱讀框，其 5′含有起始密碼子ATG，3′端含有137 bp的非編碼區(qū)，這表明天山雪蓮3GT基因的cDNA序列完整，獲得GenBank登錄號(hào) (Accession No. JN092127)。

2.3 天山雪蓮3GT氨基酸序列分析

根據(jù)天山雪蓮3GT基因cDNA全長序列推測(cè)其編碼516個(gè)氨基酸殘基。以來自不同物種的5種類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，推測(cè)天山雪蓮類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶含有一個(gè)由 44個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的糖基轉(zhuǎn)移酶的保守域PSPG[13]，如圖2中劃線部分，該保守序列被認(rèn)為是結(jié)合糖基供體的區(qū)域。這表明，從天山雪蓮中克隆得到的基因3GT具有類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族所具有的序列特征，進(jìn)一步證明其為類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。

2.4 天山雪蓮3GT系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

天山雪蓮類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶與其他植物的 GT氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖 3)，不同物種的類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶聚為一類，天山雪蓮類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶與毛楊梅的3GT基因及草莓的GT6親緣關(guān)系較近，Griesser等[14]運(yùn)用原核表達(dá)，在體外獲得草莓 GT6表達(dá)的蛋白，對(duì)該蛋白的分析表明，該蛋白參與類黃酮的糖基化。

圖2 天山雪蓮和其他物種3GT氨基酸序列比對(duì)分析Fig. 2 Muti-sequence alignment of UDP-glucosyltranserases proteinases from Saussurea involucrata and other organisms. Q40284: Manihot esculenta Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase; ABB92748: Fragaria x ananassa GT6; AAD21086: Forsythia x intermedia 3GT. The identical and positive amino acid resdues are denmed with “﹡” and “∶”.

2.5 天山雪蓮3GT基因的轉(zhuǎn)錄模式分析

根據(jù)利用 3GT基因的保守引物擴(kuò)增不同組織中的基因cDNA片段。從圖4中可以看出，天山雪蓮 3GT基因在葉和愈傷組織中的表達(dá)量比較高，在根中僅有少量的表達(dá)，在莖中幾乎不表達(dá)。

2.6 天山雪蓮3GT基因的表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

重組質(zhì)粒構(gòu)建 (圖5)，挑取大腸桿菌中的單菌落用 BglⅡ和 NheⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，得到預(yù)期大小1 808 bp的片段，并用3GT基因特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)得到預(yù)期1 808 bp的片段。經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選與大腸桿菌重組子的篩選相同，均得到預(yù)期大小的片段。

圖4 天山雪蓮3GT基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄模式Fig. 4 Transcriptional pattern analysis of 3GT in different organs of S. involucrata. Transcripts were amplified using gene specific primers, with the PCR products separated using 1% agarose gel. Equal cycles for PCR reaction, different loadings for the different samples. L: leaf; C: callus; S: stem; R: root.

2.7 天山雪蓮轉(zhuǎn)3GT基因愈傷組織的篩選

經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的雪蓮葉片共150片，轉(zhuǎn)入含有潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)20 d后開始出愈，經(jīng)45 d培養(yǎng)后，運(yùn)用CTAB法提取雪蓮愈傷組織的總 DNA。由于該遺傳轉(zhuǎn)化為同源轉(zhuǎn)化，所以對(duì)轉(zhuǎn)化子的篩選采用抗性標(biāo)記基因的PCR檢測(cè)，用潮霉素基因的特異引物進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，共檢測(cè)到 14個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖6)，該基因的轉(zhuǎn)化率為9.33%。

2.8 轉(zhuǎn)天山雪蓮 3GT基因的愈傷組織干重及總黃酮含量

圖5 3GT表達(dá)載體的構(gòu)建Fig. 5 Plasmid used in transformation of 3GT transgeneic. P35S: CaMV 35S promoter; T35S: CaMV 35S terminator; 3GT: S. involucrata UDP-glucose gene; hpt: hygromycin phosphotransferase gene.

圖6 3GT基因轉(zhuǎn)基因愈傷組織的檢測(cè)Fig. 6 PCR analysis of transgenes in S. involucrata callus, hpt gene. 1: DNA marker; 2: positive control; 3: negative control; 4?11: S. involucrata callus PCR.

圖7 懸浮培養(yǎng)雪蓮愈傷組織干重及總黃酮含量Fig. 7 Dry weight and flavonoid content in S. involucrata callus after suspension culture. (A) The control of the S. involucrata callus. (B) 3GT gene transformated of S. involucrata callus.

取其中3個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行雪蓮愈傷組織的懸浮培養(yǎng)，分別測(cè)量其在4、8、12、16 d的平均干重及總黃酮含量的變化如圖7所示，隨著懸浮培養(yǎng)時(shí)間的增加，雪蓮愈傷組織的干重和總黃酮含量不斷增加，在第 12天左右干重及總黃酮含量的增加幅度開始變小 (圖7)；其中轉(zhuǎn)基因愈傷組織的總黃酮含量是非轉(zhuǎn)基因愈傷組織總黃酮含量平均值的2.06倍。

3 討論

盡管花青素代謝途徑中的多個(gè)結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)從水母雪蓮中分離出來[15-17]，但是國內(nèi)外未見報(bào)道天山雪蓮中花青素代謝途徑的關(guān)鍵酶基因3GT的研究，該文首次從天山雪蓮中克隆得到3GT基因。本研究通過同源克隆的方法從天山雪蓮葉片中分離得到3GT基因全長序列，根據(jù)推測(cè)的蛋白質(zhì)序列分析基因的功能，運(yùn)用同源轉(zhuǎn)化的方法驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因雪蓮愈傷組織中的總黃酮含量比對(duì)照有顯著提高，這一結(jié)果與王慶菊等[18]在對(duì)紫葉稠李葉片和張劍亮等[19]在向日葵的研究 3GT基因的過表達(dá)能夠顯著提高植物中黃酮類物質(zhì)的積累這一研究結(jié)果一致。

近幾年國內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)糖苷代謝的研究不斷深入。花青素糖基轉(zhuǎn)移酶 (GT) 對(duì)于植物花色和花青素的穩(wěn)定性及可溶性很重要，是因?yàn)槠錄Q定了糖基化的位置。植物的次生代謝過程中糖基轉(zhuǎn)移酶具有很嚴(yán)格的糖附屬物的選擇性[20]。多數(shù)花青素的糖基化是通過葡萄糖轉(zhuǎn)移酶類的3GT實(shí)現(xiàn)的。目前研究報(bào)道的植物GTs多為將底物通過 C-或者 N-糖基化形成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物。天山雪蓮的3GT與其他物種的3GT在C端具有相似性，能夠識(shí)別相同或相似的受體，而N端的相似性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于C端，說明天山雪蓮花青素的糖基化可能主要為C-糖基化。天山雪蓮3GT和各種植物糖基轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)化樹表明，天山雪蓮3GT與不同物種的 3GT親緣關(guān)系較近，與毛楊梅的3GT相似性較高。

3GT基因的表達(dá)具有品種和時(shí)間特異性，3GT基因僅在紅皮葡萄品種Vitis vinifera中表達(dá)[21]，在龍膽Gentiana triflora中，只能在花瓣中檢測(cè)到3GT基因的表達(dá)，在白色花中很少表達(dá)[22]。當(dāng) 3GT基因被抑制表達(dá)時(shí)，組織培養(yǎng)的葡萄細(xì)胞中花色苷的含量明顯降低[23]。天山雪蓮3GT基因在葉及愈傷組織中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量較少，在莖中幾乎不表達(dá)，對(duì)該方面具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

目前，在GTs家族中還有95%的基因及蛋白還不知道其功能和特征，這就為研究學(xué)者們提出了極大的挑戰(zhàn)。對(duì)天山雪蓮3GT基因功能的初步研究中，轉(zhuǎn)基因愈傷組織中總黃酮的含量較野生天山雪蓮總苞高2.47倍，天山雪蓮3GT是雪蓮黃酮代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，能夠促進(jìn)黃酮類物質(zhì)在天山雪蓮細(xì)胞內(nèi)的積累，這與前人的研究結(jié)果一致，因此，該基因在雪蓮總黃酮合成過程中起著重要的作用。運(yùn)用基因工程手段將天山雪蓮自身的 3GT基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入天山雪蓮愈傷組織中能夠提高天山雪蓮總黃酮的合成能力，這將為今后對(duì)實(shí)現(xiàn)天山雪蓮黃酮類物質(zhì)的人工合成方面的研究奠定基礎(chǔ)，是解決天山雪蓮資源匱乏的有效方法之一。

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