單個B細胞抗體制備技術及應用

遲象陽，于長明，陳薇

軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所，北京 100071

單克隆抗體技術是現(xiàn)代生命科學研究的重要工具，自1975年雜交瘤單克隆抗體技術的出現(xiàn)，單克隆抗體迅速在生命科學研究和臨床檢測診斷中得到了廣泛的應用，為許多領域的發(fā)展作出了不可估量的貢獻。目前單克隆抗體制備技術有雜交瘤技術、EBV轉化B淋巴細胞技術、噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術以及單個B細胞抗體制備技術等[1]。

傳統(tǒng)的鼠雜交瘤單克隆抗體技術的基本過程是將來源于免疫接種過的小鼠的 B細胞與骨髓瘤細胞融合，繼而篩選出既能無限增殖又能分泌抗體的鼠雜交融合細胞，但是這種方法得到的鼠源抗體免疫原性高、半衰期短，往往臨床療效不顯著。即使是對鼠源單克隆抗體進行完全人源化的基因工程改造，也不可能完全消除鼠源單抗的免疫原性，對臨床療效的改善依然有限[2]。

為了減少鼠雜交瘤抗體和人源化抗體的免疫原性，提高抗體生物效應，許多研究者嘗試各種方法來獲得全人抗體。其中人雜交瘤技術是在鼠雜交瘤技術的基礎上發(fā)展的一種抗體制備技術，這種方法是將免疫過的人或鼠B細胞與人骨髓瘤細胞融合從而獲得無限傳代且能分泌抗體的雜交融合細胞，該技術雖然克服了鼠雜交瘤技術免疫原性等不足，但是仍有較多局限，如人骨髓瘤細胞系非常有限、細胞融合成功率低且容易造成染色體丟失等[3]。針對于以上缺陷，研究者利用EB病毒 (Epstein-Barr Virus，EBV) 在體外能感染正常靜止的B細胞，使它們變成永生化的淋巴細胞系這一特性，制備分泌人單抗的雜交瘤細胞，即EBV轉化B細胞技術。然而，EBV轉化B細胞株不是惡性腫瘤細胞，較難克隆且抗體產(chǎn)量低，因而仍然沒有得到廣泛應用[4]。

噬菌體展示技術是目前廣泛應用的體外篩選人源抗原特異性抗體可變區(qū)基因的一種方法，噬菌體展示是將抗體DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使抗體隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術[5]。這種方法無需B細胞培養(yǎng)過程、較為簡單，但是得到的抗體并非在人體中表達，可能導致構象改變從而丟失抗原特異性，并且由于抗體重鏈和輕鏈隨機組合，無法保持抗體重鏈輕鏈的天然配對[6]。

除此之外，轉基因鼠抗體制備技術在破壞鼠內(nèi)源抗體基因后導入人抗體基因，進而用目標抗原免疫轉基因鼠并在其體內(nèi)表達人源抗體，這種方法得到的抗體產(chǎn)量和親和力較高，但是鼠與人類免疫系統(tǒng)組成上的差異限制了其應用前景[7]。

近幾年來新興的單個 B細胞抗體制備技術是一種體外克隆和表達單個抗原特異性 B細胞抗體基因技術，這種方法保留了輕重鏈可變區(qū)的天然配對，具有基因多樣性好、效率高、全人源、需要的細胞量少等優(yōu)勢。以下將詳細介紹單個B細胞抗體制備技術及其應用。

1 單個B細胞抗體制備技術過程

1.1 鑒定和分離單個B細胞

抗體基因的來源隨研究目的差異而不同。Wrammert等[8]制備的抗 H1N1抗體是從外周血中分離漿細胞 (Plasma cells) 獲得；Morris等[9]則通過分離外周血單個記憶B細胞 (Memory B cells) 得到抗HIV抗體；Wardemann等[10]為研究人自身反應抗體的結構和規(guī)律，從正常人骨髓中分離前B細胞制備自身反應抗體。

在樣品豐富的情況下，為提高特異性抗體得率，可以在分離B細胞之前先通過密度梯度法[11-12]，或流式細胞分選[13]從外周血中粗分離B淋巴細胞，以ELISPOT進行抗原特異性細胞豐度的評價，從而選擇含抗原特異性抗體濃度較高的血樣進行后續(xù)抗體制備[8,14-16]。也有文獻以ELISA法直接比較不同供血者的血樣中含特異性抗體的濃度，如 Gilbert等[11]利用基于細胞的ELISA技術(Cell based ELISA)估計血樣中抗腫瘤抗體的含量。

單個 B細胞分離可分隨機分離和抗原特異性分離，前者只需分離B細胞，操作簡單，但是隨機分離適用于抗原特異性抗體濃度較高的血樣，通常來自于疫苗接種者或患者，以盡量減輕后續(xù)抗體特異性鑒定的工作量[8,17-19]。后者需分離抗原特異性B細胞，操作較復雜，尤其適合抗腫瘤抗體、自身免疫抗體等特異性抗體含量較低的情況[9-11,15]。

隨機 B細胞分離的方法主要有顯微操作法(Micromanipulation)、激光捕獲顯微切割法(Laser capture microdissection，LCM)、熒光激活細胞分選法 (Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)，見表 1。顯微操作法是在鏡下用顯微操作儀人工分離 B細胞，雖然該方法無需特殊設備、操作簡單但是分離效率低，且分離細胞種類有限；激光捕獲顯微切割法的基本過程是將事先經(jīng)組織化學、免疫組化或免疫熒光方法染色的樣品切片，在顯微激光切割系統(tǒng)下觀察細胞形態(tài)和染色情況并獲取單細胞群或單細胞。該方法的特點是操作簡單，定位準確，能在目視下從樣品中特異挑選同類細胞乃至單一細胞并剔除雜質成分，但是該技術制樣復雜，無法自動化在短時間內(nèi)獲取大量單個B細胞；熒光激活細胞分選法以熒光劑和細胞分選儀為基礎，用激光束激發(fā)單行流動的細胞上結合的抗體所偶聯(lián)的熒光素，根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號對細胞進行自動分析或分選。雖然操作較為復雜，對設備和樣品的要求較高，但熒光激活細胞分選能夠自動化，從而快速準確分選或分析細胞，是目前應用最為廣泛的細胞分離方法之一。

目前普遍運用于抗原特異性單個 B細胞分離的方法包括：熒光標記抗原多參數(shù)細胞分選法(Fluorochrome-labeled antigens via multiparameter，F(xiàn)ACS)、抗原標記磁珠分選法 (Antigencoated magnetic beads)、微雕法 (Microengraving)以及細胞微陣列芯片法 (Cell-based micro-array chip systems)。熒光標記抗原多參數(shù)細胞分選法與熒光激活細胞分選法類似，二者差異在于前者在加入用于標記B細胞表面抗原的熒光抗體之外，還需加入熒光標記的目標抗原用來結合 B細胞表面的膜抗體，以分選目標抗原特異性的 B細胞。它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，此技術不僅提高分離細胞的純度，而且可以得到更多的細胞信息，分選各個時期的B細胞用于不同的研究方向。該方法具有速度快、精度高、自動化程度高等優(yōu)點，已成為當代最先進的細胞定量分析分選技術。抗原標記磁珠分選法基本原理是基于細胞表面目標抗原特異性抗體能與連接有磁珠的目標抗原相結合，在外加磁場中，通過目標抗原與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面特異性抗體的細胞由于不能與連接著磁珠的目標抗原結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。這種方法可以在幾分鐘內(nèi)從復雜的細胞混合物中分離出高純度的細胞，在流式分選單細胞前可用磁珠分選法進行預分離，但是由于磁珠影響細胞生物活性因而不利于分離后培養(yǎng)與操作；微雕法基于軟光刻 (Soft lithographic) 微陣列芯片識別、恢復和克隆產(chǎn)生抗原特異性抗體的B細胞，刺激多克隆B細胞產(chǎn)生抗體并將其逐個置于芯片孔內(nèi)，將該芯片轉印至相應的蛋白芯片后，即可用熒光標記的目標抗原識別特異性抗體，進而顯微操作將檢測到的分泌目標抗原特異性抗體 B細胞轉移到細胞培養(yǎng)皿中進行后續(xù)克隆操作。微陣列芯片法同微雕法具有高通量 (每個芯片分選細胞量高達10萬個細胞)、快速、成本低、可直接從多克隆B細胞中分選并鑒定抗體分泌B細胞等優(yōu)點。另外，Jin等[20]通過酶聯(lián)免疫斑點微陣列芯片法 (Immunospot array assay on a chip，ISAAC) 高通量制備流感抗體，ISAAC法是微陣列芯片法的延伸和補充，該方法用包被于芯片表面的抗免疫球蛋白抗體來代替微雕法轉印蛋白芯片的過程，抗免疫球蛋白抗體能夠快速捕捉抗體分泌B細胞分泌的抗體，進而用生物素標記的目標抗原識別特異性抗體，從而達到篩選并分離特異性抗體分泌 B細胞的目的。ISAAC法較微雕法另一改進在于，前者能在同一塊芯片上篩選針對多種不同目標抗原的特異性抗體，簡化了實驗過程且更加高效，是目前前景非常廣闊的分選B細胞方法。

表1 單個B細胞分選方法Table 1 Approaches of single B cell isolation

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1.2 擴增和克隆抗體基因

經(jīng)典克隆未知抗體基因的方法比如 cDNA文庫篩選[40-41]等有著共同的弊病，即實驗操作繁瑣，周期較長、工作量大。近些年來隨著 PCR技術的快速興起和成熟，單個B細胞抗體基因的擴增和克隆也隨之發(fā)展。

細胞分選時，通常需將單個B細胞分至內(nèi)含適量細胞裂解液、RNA酶抑制劑和PCR反應試劑的適當容器中，如 96孔板。由于單個細胞內(nèi)RNA含量少，適當?shù)娜萜骺梢苑奖愦笈坎僮?、防止樣品損失或交叉污染。另外，不同類型B細胞抗體分泌能力差異明顯，如抗體分泌B細胞中抗體基因轉錄本含量遠高于記憶B細胞，因此從抗體分泌B細胞中更容易擴增得到抗體基因。

通常從單個B細胞中擴增未知抗體基因，需使用合適的引物進行巢式或半巢式逆轉錄 PCR (Nested or semi-nested RT-PCR)，該過程要求引物具有通用性、靈敏性、特異性，能避免非特異性擴增又能擴增出完整的抗體基因序列，因此合理設計引物序列至關重要。通常針對抗體重鏈輕鏈可變區(qū)不同前導序列設計前向引物的混合物，反向引物特異性互補于抗體恒定區(qū)。根據(jù)實驗目的，如果分離和擴增不同同種型的抗體，反向引物則是特異性互補于各種同種型抗體恒定區(qū)的混合物[42-45]。除此之外，為方便重疊延伸 PCR重組和酶切克隆抗體重鏈輕鏈可變區(qū)基因，前向引物5′端和反向引物3′端需要包含限制性內(nèi)切酶位點。雖然該方法已被應用證實能擴增出部分抗體序列，但產(chǎn)物的多樣性仍受限于前向引物結合序列的非保守性，理論上是無法涵蓋所有分選到的B細胞中功能性抗體基因[9,12,15,19,25,27]。此外，這種基于混合引物的多重 PCR反應體系復雜，在擴增效率、特異性以及抗體基因表達譜的還原(Repertoire retrieve) 上都可能存在問題。

Ozawa 等[23]通 過 5′ RACE (5′ rapid amplification of cDNA ends) 方法成功擴增出抗體基因編碼框5′端的完整序列，該方法通過針對不同同種型抗體恒定區(qū)保守序列的特異性反向引物序列 GSP引物混合物，直接從細胞中RT-PCR合成cDNA第一鏈，對第一鏈加多聚G尾后，繼續(xù)用一條帶有下游巢式 PCR引物互補序列和多聚C的前向引物AP合成第二鏈，進而利用針對AP和恒定區(qū)保守序列的特異性引物混合物進行兩步巢式PCR，更加特異地擴增出目的基因。傳統(tǒng)的5′ RACE法擴增未知基因的細胞含量要求較高，Ozawa提出的單個B細胞5′ RACE材料要求少至僅需一個細胞，且可能擴增出多種前向引物混合物 PCR的方法無法擴增出的抗體基因，另外過程中無需純化PCR產(chǎn)物，省略了復雜的前向引物混合物，大大簡化了反應體系[14,20,22,46]。

擴增出的抗體基因片段用重疊延伸 PCR方法連接成scFv、scAb、Fab等形式[47]，酶切將其連接至原核或真核表達載體中。Liao等[19]構建的線性表達框 (Linear expression cassettes) 包含有抗體轉錄和翻譯所有必需的功能元件：CMV啟動子 (CMV promoter)、抗體前導序列 (Ig leader sequences)、IgG1重鏈或輕鏈恒定區(qū)基因(Constant region of IgG1 heavy- or Ig light-chain)、多聚A尾 (poly(A) tail)、可替換重鏈和輕鏈可變區(qū)基因 (Substitutable VHor VLgenes)。這個方法無需克隆過程，直接轉染到哺乳動物細胞中表達，方便于高通量快速高效篩選鑒定和分析特異性抗體[9,14]。

對抗體基因擴增產(chǎn)物測序得到的結果，可在相應數(shù)據(jù)庫中，如IMGT V-QUEST (http://www. imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)、 IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 評價 V-D-J基因完整性，分析其插入、缺失和突變情況。

1.3 表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體

鑒定抗體的抗原特異性和生物活性前需將攜帶有抗體基因的表達載體在相應系統(tǒng)中表達，最簡單常用的是原核表達系統(tǒng)[8,15,22,25,27]，如Escherichia coli，相較而言，真核表達系統(tǒng)尤其是哺乳動物細胞表達系統(tǒng)更有利于抗體的加工修飾，其產(chǎn)物的生物活性可靠性更高[12-13,17,39,46]，常用的有HEK293和CHO等細胞系。通過親和層析和離子交換層析純化到的抗體，可通過SDS-PAGE[14]、Western blotting[9,14-15]、ELISA[16,18,32]等常規(guī)方法篩選和鑒定抗體，也可通過免疫沉淀(Immunoprecipitation)[16]、空斑法 (Plaque assay)[8]、空斑減少中和測定法 (PRNT50 assay)[8]、流式分析法 (FACS analysis)[8]、活細胞成像測定法 (Live cell imaging assays)[11]、體內(nèi)藥物活性測定法[8]等方法進一步測定抗體與抗原的特異性、親和力以及中和活性保護活性等生物學特性。

2 單個B細胞抗體制備技術應用

單克隆抗體技術是現(xiàn)代生命科學研究的重要工具，其在蛋白質的結構與功能研究、疾病診斷、藥效學及臨床應用等方面有著不可或缺的作用。近年來，隨著分子生物學和細胞生物學的發(fā)展，單個B細胞抗體制備技術開始興起，并逐漸得到廣泛應用。單個B細胞抗體技術制備的單克隆抗體所具有的全人源性、自身高度特異性和均一性的特點在治療病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面顯出了獨特的優(yōu)勢和良好的應用前景。目前單個B細胞抗體制備技術已廣泛應用于以下幾方面。

2.1 病原微生物感染治療

其他抗體制備技術如噬菌體展示、轉基因鼠等只能研究有限種類的B細胞，而單個B細胞抗體制備技術幫助人們在病人感染或免疫幾個月甚至多年后仍然能夠快速分離到記憶 B細胞制備單抗，與此同時人們能夠從基因水平更加深入了解和闡釋人類免疫系統(tǒng)機制。單個B細胞技術已用于制備抵抗病原微生物感染的高度特異性人源抗體，如HIV抗體[48-50]、破傷風抗體[51-52]、乙肝抗體[46]、流感抗體[16-17]等。Morris 等[9]從HIV-1疫苗接種者外周血中分離單個B細胞，并克隆得到能識別 HIV-1 gp41保守位點且中和多株HIV-1的抗體，并研究得出結論在HIV-1 gp41包被蛋白的C端存在多免疫原性靶點，為HIV-1疫苗設計提供幫助。Wrammert 等[8]通過單個 B細胞抗體制備技術，從H1N1感染患者外周血中成功制備了針對H1N1病毒基因保守區(qū)的中和性抗體，動物保護實驗發(fā)現(xiàn)用于測試的具有代表性的3株抗體在小鼠感染H1N1后70 h后仍然都能起到保護作用，并且 3株抗體能抵抗絕大多數(shù)H1N1、H5N1病毒株。Liao等[19]從單個B細胞中擴增流感抗體基因，將其連接至線性表達框并直接轉化到哺乳動物細胞中表達，僅用6 d從分選的24個細胞中擴增出9對完整的抗體基因并表達，并成功篩選到5個高親和力人流感單克隆抗體。Jin等[20]通過酶聯(lián)免疫斑點微陣列芯片分選法，僅用7 d同時從一批人外周血中分別篩選出63個流感特異性抗體分泌B細胞和104個乙肝特異性抗體分泌B細胞，從中成功制備了19株流感和 45株乙肝中和性單克隆抗體。因此，單個 B細胞抗體制備技術能夠高效高通量制備高親和力人單克隆抗體。

2.2 自身免疫疾病檢測和治療

在腫瘤檢測和治療方面，單個B細胞技術同樣發(fā)揮著其他技術難以比肩的重大作用，Wang等[26]通過該技術發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為葡萄膜炎癥狀的玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤患者的IgH基因和T細胞受體 (TCR) 基因重排，以此建立了一種新型的高靈敏度高特異性的初期玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤檢測方法。Gilbert等[11]在單個B細胞技術的基礎上建立了新型的基于細胞 ELISA (Cell-based ELISA) 得到對黑色素瘤細胞具有殺傷作用的抗黑色素瘤抗體，同時發(fā)現(xiàn)該抗體在黑色素瘤患者體內(nèi)含量遠遠高于其在正常人體內(nèi)的含量。

2.3 人類免疫系統(tǒng)研究

單個 B細胞抗體制備技術最突出的應用在于治療和研究自身免疫性疾病和人類免疫系統(tǒng)。單個 B細胞抗體制備技術能夠分離到人體內(nèi)任意時期的B細胞，使得詳細深入地研究人體免疫系統(tǒng)各個階段功能和機理成為可能。Scheel等[25]發(fā)現(xiàn)在風濕性關節(jié)炎患者滑液組織中存在持續(xù)激活特定B細胞的現(xiàn)象，使得滑液組織處大量漿細胞富集，由此得出結論認為出現(xiàn)淋巴細胞滲入情況的關節(jié)炎患者，可通過早期B細胞排除治療法減輕漿細胞堆積的癥狀。Wardemann等[10]從健康人體內(nèi)克隆出單個 B細胞抗體基因并對此進行分析和研究發(fā)現(xiàn)，骨髓中初期生成的大部分B細胞都具有自身免疫特異性，從而推論在抗體發(fā)生過程中可能存在兩個排除自身免疫的檢查點：一個位于骨髓，另一個位于B細胞發(fā)生免疫耐受的外周組織。

從上述對單個 B細胞抗體制備技術應用簡述中可以看到，單個B細胞技術具有效率高、全人源、基因多樣性更豐富等優(yōu)勢。但到目前為止，單個 B細胞抗體制備技術的應用潛力還遠遠沒有發(fā)揮出來，單個B細胞抗體制備技術仍受到一些現(xiàn)實條件的約束，如高通量 PCR抗體基因擴增技術仍不夠完善、某些目標抗原難以制備、合適的人源供體需求量較多等，但是在過去十年里，單個B細胞抗體制備技術已經(jīng)成為制備人源抗體的熱門方法，同時也促進了包括抗體發(fā)生成熟、疫苗保護機制、疫苗開發(fā)、腫瘤及自身免疫疾病等免疫學相關研究。隨著B細胞分選技術、后續(xù) PCR擴增基因方法以及抗體基因高通量分析鑒定等方法的成熟和完善，未來單個B細胞抗體制備技術將在診斷、藥效學及臨床應用中發(fā)揮前所未有的重大作用，引領新型治療性抗體研究的嶄新時代。

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