PLGA/ECM神經(jīng)支架性質(zhì)的體外評價

劉彬，可金星，蔡紹皙，李校堃，張路，陳文琦1,,5，張耀光

1 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400715

2 第三軍醫(yī)大學(xué)中心實驗室，重慶 400030

3 重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030

4 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118

5 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

周圍神經(jīng)缺損替代修復(fù)是一個復(fù)雜且難度較高的問題，生物組織工程支架是解決這一難題的有效途徑。材料問題一直是神經(jīng)支架所面臨的重要問題之一，很多材料都被應(yīng)用這一領(lǐng)域的研究中[1-8]。單一材料在體現(xiàn)其優(yōu)勢的同時，通常也體現(xiàn)出一些缺陷，因此采用多種材料制備復(fù)合材料作為神經(jīng)支架以促進周圍神經(jīng)損傷修復(fù)，是目前普遍認(rèn)可的方法。新鮮豬皮中水分含量為55.5%，脂肪含量為13.56%，豬皮中的膠原含量約為24.35%，其余部分主要為細胞內(nèi)容物[9]。以豬皮為原料制備細胞外基質(zhì) (ECM) 的實質(zhì)是去除脂肪和具有免疫原性的細胞內(nèi)容物。豬皮來源的ECM主要由膠原構(gòu)成，除此之外還含有層粘連蛋白、纖維結(jié)合蛋白等有益于神經(jīng)再生的物質(zhì)，具有良好的生物相容性[1]。其中，膠原為三股螺旋結(jié)構(gòu)，α1和α2鏈的分子量約為100 kDa，β鏈的分子量約為200 kDa，變性溫度為37.5 ℃。膠原分子主要包含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸，不含色氨酸和胱氨酸[9-10]。豬皮在厚度及其面積方面的優(yōu)勢決定了豬皮來源的ECM更易于加工成神經(jīng)支架所需要的形態(tài)。NGF在神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用得到了廣泛的認(rèn)同，但是，NGF緩釋體系的合理性直接決定了NGF功能的發(fā)揮[1]。在以豬皮來源的ECM制備對NGF具有緩釋功能的神經(jīng)支架的過程中，需要一種包封劑。PLGA良好的生物相容性及其生物可降解性等性質(zhì)，都表明它適合作為這種包封劑。PLGA在體內(nèi)降解過程中，會釋放弱酸性物質(zhì)，從而為組織環(huán)境pH的穩(wěn)定造成一定的壓力[11]，本研究擬采用一種弱堿性物質(zhì)，即賴氨酸[12-13]來克服這一問題。

本研究以豬皮為原料制備 ECM，用 PLGA將NGF和賴氨酸復(fù)合在ECM上，以構(gòu)建一種對NGF具有緩釋功能，并可以在一定程度上中和PLGA酸性降解產(chǎn)物的復(fù)合材料。通過形態(tài)學(xué)觀察、力學(xué)測試、降解試驗、細胞學(xué)試驗，在體外評價其作為神經(jīng)支架的可行性。由于本材料僅供體外測試使用，故其形態(tài)未與周圍神經(jīng)的幾何形態(tài)相匹配。

1 材料與方法

1.1 豬皮來源ECM的制備與觀測

取豬肩背部新鮮豬皮，去毛，溫水清洗，切割成條狀 (2 mm×2 mm×100 mm)，用NaOH溶液脫脂，用NaCl進行高滲透壓處理，用純凈水進行低滲透壓處理，用胰蛋白酶 (Sigma公司)破壞細胞成分、細胞連接，疏松膠原，用5 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) +2%TritonX- 100中在37 ℃下振蕩浸泡3 d，室溫下用清水沖洗2 d，用Trix-100 (Sigma公司) 進行去垢處理，純凈水漂洗；用冷凍干燥機 (Flexi-Dry μP，F(xiàn)TSSYSTEM，USA) 脫水；分別進行掃描電子顯微鏡 (AMRAY 1000B，USA) 和 HE染色觀測去細胞效果以及內(nèi)部形態(tài)[14]。

1.2 NGF明膠微球的制備

在明膠 (Bloom strength，225；pI：4.7；Sigma)水溶液中加入NGF (?-NGF，Human，Sigma)，加入植物油 (37 ℃) 乳化，冷凍到?20 ℃，在冷凍離心機中分離，沉淀物用丙酮洗滌，除去植物油和水，冷凍干燥，篩分備用 (400目)[15-20]。

1.3 神經(jīng)支架的制備

將NGF明膠微球、賴氨酸、豬皮來源ECM置于3% (W/V) PLGA (8020 mole ratio of lactide to glycolide；Sigma) 的二氯甲烷溶液中，振蕩混合后，負(fù)壓抽干。

1.4 內(nèi)部形態(tài)觀察及孔隙率測定

用掃描電子顯微鏡 (AMRAY 1000B，USA)觀察神經(jīng)支架的表面及斷面的形態(tài)；用文獻報道的方法測定孔隙率和密度[21]。

1.5 力學(xué)測試

用材料力學(xué)測試機 (INSTRON 1011，USA)檢測神經(jīng)支架的力學(xué)性質(zhì) (加載速度為10 mm/min)。

1.6 體外降解測試

取神經(jīng)支架 (300±1) mg (以豬皮來源ECM和 PLGA為對照)，置于安培瓶中，分別加入10 mL三蒸水或PBS (Sigma公司)，置于搖床(50 r/min) 在生化培養(yǎng)箱 (37 ℃) 中持續(xù)處理8周，期間不更換降解液，每周取樣1次。用pH計 (DELTA320) 在各時間點檢測降解液pH值。在前4周分別稱量各樣品的濕重和干重 (經(jīng)冷凍干燥)，稱重后將樣品重新放回原降解液中。對于進行SEM觀察的樣品做相同的處理。

1.7 對NGF的持續(xù)釋放作用

取50 mg神經(jīng)支架，加入10 mL PBS，置于搖床 (40 r/min) 在生化培養(yǎng)箱 (37 ℃) 中持續(xù)處理30 d每次取樣1 mL，同時回加1 mL新鮮的PBS。期間，在起始12 h中，每間隔2 h取樣1次，在此后的2 d內(nèi)，每12 h取樣1次，之后，每天取樣1次。對各樣品進行?70 ℃保存。待全部取樣完成后，統(tǒng)一用β-NGF (human) ELISA kit (Sigma) (按試劑盒使用說明書) 對各樣品進行處理。神經(jīng)支架對NGF的累計釋放率的計算公式為：

1.8 雪旺氏細胞在神經(jīng)支架上的粘附與增殖

雪旺氏細胞的分離、培養(yǎng)與純化，及 MTT法均參照文獻報道的方法進行[22-23]。在神經(jīng)支架與雪旺氏細胞共培養(yǎng)15 d后，取出材料進行SEM觀察。

2 結(jié)果

2.1 豬皮來源ECM觀察

蘇木精-伊紅 (HE) 染色，是一種傳統(tǒng)而經(jīng)典的組織學(xué)方法，可以將細胞核物質(zhì)染成紫色，將其余物質(zhì)染成粉紅色。從圖1可以看出，新鮮豬皮 (圖1A) 相對致密，其中零星分布著一些細胞，ECM (圖1B) 較為疏松，無細胞。這可以說明本研究中所使用的 ECM 實現(xiàn)了去細胞的目的。SEM觀察結(jié)果顯示，與新鮮豬皮 (圖1C) 相比，ECM (圖1D) 中膠原纖維的排列較為疏松，纖維的直徑為1~10 μm左右，纖維間縫隙的寬度為5~50 μm左右，這就為制備內(nèi)部具有相互聯(lián)通的蜂窩狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架提供了充分的前提條件，同時也為NGF 明膠微球進入其內(nèi)部以構(gòu)建NGF緩釋體系創(chuàng)造了條件。

2.2 神經(jīng)支架的形態(tài)和結(jié)構(gòu)

本神經(jīng)支架的孔隙率為 68.3%~81.2%，密度為0.62~0.68 g/cm3?？障堵适巧窠?jīng)支架的重要指標(biāo)之一。但是并不能直接地用于評價神經(jīng)支架的優(yōu)劣。因為支架內(nèi)部孔隙的大小、相互間的連通性、均質(zhì)程度，才與雪旺氏細胞和軸突是否能夠順利地在支架內(nèi)部穿行和進行物質(zhì)交換直接相關(guān)。同時，在支架的降解過程中，以及在巨噬細胞的吞噬過程中，支架內(nèi)部會有新的空隙形成。再者，過高的孔隙率意味著支架質(zhì)地過于疏松，會導(dǎo)致質(zhì)地脆弱，難以耐受移植過程中的手術(shù)操作，以及術(shù)后的組織壓迫和牽拉。所以，孔隙率的指標(biāo)需要與支架的力學(xué)性質(zhì)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)相結(jié)合，以評價神經(jīng)支架形態(tài)的合理性。

SEM觀察顯示，PLGA在神經(jīng)支架表面 (圖2A) 形成膜狀結(jié)構(gòu)，同時在表面形成一系列分布較為均勻的直徑介于1~5 μm的孔隙。這些孔隙主要是在材料制備過程中，在負(fù)壓作用下由溶質(zhì)揮發(fā)所形成的。這種尺度的孔隙允許神經(jīng)支架內(nèi)部橫向就近與組織環(huán)境進行物質(zhì)交換，但細胞無法通過。這種結(jié)構(gòu)或許可以改善神經(jīng)損傷修復(fù)中，移植體內(nèi)部與組織環(huán)境間的物質(zhì)交換問題，這無疑會有益于軸突的再生。細胞無法在這些孔隙中通過，對軸突的有序生長是有益的。因此本神經(jīng)支架的表面形態(tài)符合神經(jīng)再生的要求。

神經(jīng)支架的斷面 (圖2B) 很難發(fā)現(xiàn)ECM中的膠原纖維，這表明PLGA已經(jīng)滲入ECM內(nèi)部，并在孔隙內(nèi)表面形成膜狀結(jié)構(gòu)，由此推測，NGF明膠微球和賴氨酸也被 PLGA包封起來從而形成一種有效的NGF、賴氨酸緩釋體系。斷面 (圖2B) 中可以觀察到直徑為8 μm左右的圓球狀顆粒，這是完整的NGF明膠微球。還可以觀察到直徑為0.5 μm左右的粉末狀顆粒，它們可能是明膠微球在支架加工成型過程中崩解所造成的。這些粉末可能是 NGF、明膠、賴氨酸的混合物。不過，仍有理由相信，它們也被 PLGA在表面進行了輕度的覆蓋。它們的存在可能會導(dǎo)致支架在降解的早期對NGF暴釋。在支架的斷面 (圖2B) 中體現(xiàn)出了眾多遠大于10 μm的孔隙，這為雪旺氏細胞及軸突的侵入提供了足夠的內(nèi)部空間。

2.3 力學(xué)性質(zhì)

材料的力學(xué)性質(zhì)也是神經(jīng)支架的重要性質(zhì)之一。在移植過程中需要耐受手術(shù)操作而保持形態(tài)，在移植后也需要耐受肌肉收縮等原因所導(dǎo)致的拉伸和擠壓。豬皮來源的ECM主要由于膠原纖維構(gòu)成，具有很好的機械強度。PLGA具有較好的剛性。在ECM和PLGA所組成的復(fù)合材料中，韌性主要由膠原所決定，硬度由PLGA決定。二者的含量以及混合的均勻程度都會導(dǎo)致復(fù)合材料力學(xué)性質(zhì)的變化。本神經(jīng)支架的斷裂強度為8.308 MPa，斷裂伸長率為38.98%，彈性模量為97.27 MPa. 這說明其強度高，具有一定的彈性，硬度適中。

圖1 新鮮豬皮與豬皮來源的ECM的內(nèi)部形態(tài)Fig. 1 Morphology of fresh pigskin and acellular pigskin. (A) Fresh pigskin (HE staining). (B) ECM (HE staining). (C) Fresh pigskin (SEM). (D) ECM (SEM).

圖2 神經(jīng)支架的形態(tài)Fig. 2 Structure of the scaffold (SEM). (A) Surface. (B) Cross section.

2.4 降解性質(zhì)

在PBS中降解4周后發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)支架的最大吸水率為126%，最大失重率為43.3%，而對照組豬皮來源的ECM的最大吸水率為300%，最大失重率為9.9% (圖3)。支架中的PLGA逐步降解，在第4周時幾乎僅剩下ECM的成分 (圖4)。這表明此時的支架應(yīng)該已經(jīng)不具備對 NGF和賴氨酸的持續(xù)釋放功能，如果希望要延長這樣的過程，則在支架的制備中需要增加PLGA的含量。在8周的考察期中 (圖5)，降解液中的pH體現(xiàn)出了一個逐步緩慢降低的趨勢，相對于對照組 (PLGA) 而言，支架組的pH 降低的趨勢較為平緩。這表明賴氨酸在支架中的添加能中和PLGA降解過程中所釋放的弱酸性物質(zhì)，以穩(wěn)定環(huán)境pH。賴氨酸的釋放應(yīng)該在4周左右結(jié)束 (圖4D)，但是，在4~8周的降解過程中 (圖5)，支架組降解液的pH仍略高于對照組 (PLGA)，這或許是豬皮來源ECM的降解性質(zhì)所決定的。

2.5 支架對NGF的緩釋性質(zhì)

支架對NGF的緩釋曲線 (圖6) 顯示，在第1天屬于NGF的暴釋期，累積釋放量占整個考察期 (30 d) 累積釋放率 (38%) 的40%左右。在開始1周的累積釋放量占考察期 (30 d) 累積釋放率 (38%) 的60%左右。

2.6 雪旺氏細胞在神經(jīng)支架上的粘附與增殖

將支架與雪旺氏細胞共培養(yǎng)7 d，以單獨培養(yǎng)的雪旺氏細胞作為對照 (Control)，同時在另一實驗組中一次性添加NGF。結(jié)果 (圖7) 顯示，在各組中雪旺氏細胞的增殖趨勢相同，但是仍體現(xiàn)出細胞數(shù)量的不同。細胞增殖速度由低到高的排列順序依次為：對照組、支架組、單獨添加NGF組。這一結(jié)果表明支架中NGF保持了生物活性。將支架與雪旺氏細胞通過15 d的共培養(yǎng)，能夠觀察到雪旺氏細胞在支架表面的粘附 (圖8)。

圖3 神經(jīng)支架質(zhì)量的殘留率 (失重率)Fig. 3 Weight remaining of the scaffolds and PLGA.

圖4 支架在降解過程中的形態(tài)變化Fig. 4 Changes of the scaffold surface during degradation in PBS solution. (A) 1 week. (B) 2 weeks. (C) 3 weeks. (D) 4 weeks.

圖5 支架在水中降解的過程中環(huán)境pH的變化Fig. 5 Changes of pH value in degradation solution.

圖6 支架對NGF的緩釋作用Fig. 6 NGF release ratio of the scaffold.

圖7 雪旺氏細胞的MTT試驗Fig. 7 MTT assay of schwan cells.

圖8 雪旺氏細胞在支架表面的粘附Fig. 8 Schwann cell adhering to the scaffold.

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，本研究所制備的復(fù)合材料具有如下性質(zhì)：適宜的強度、彈性和硬度；內(nèi)部蜂窩狀結(jié)構(gòu)；易降解；對NGF的緩釋功能；保持了NGF的生物活性；對PLGA降解過程中所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)具有一定的中和作用；對雪旺氏細胞有較好的親和性。這些性質(zhì)都是神經(jīng)支架所需要滿足的條件，因此有望成為一種新型的促周圍神經(jīng)損傷修復(fù)支架。

REFERENCES

[1] Schmidt CE, Leach JB. NEURAL TISSUE ENGINEERING: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng, 2003, 5: 293?347.

[2] Xu HF, Shao ZW, Wu YC, et al. Effects of self-assembled IKVAV peptide nanofibers on olfactory ensheathing cells. Chin J Biotech, 2009, 25(2): 292?298.徐會法, 邵增務(wù), 吳永超, 等. 自組裝 IKVAV多肽納米纖維支架凝膠及其對嗅鞘細胞的作用. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(2): 292?298.

[3] Li M, Wu BY, Hu XY, et al. Genipin crosslinked preparation of new peripheral nerve tissue engineered scaffolds and comparison of their biological characteristics. Chin J Trauma, 2010, 26(2): 165?170.李沫, 吳邦耀, 胡學(xué)昱, 等. 以京尼平交聯(lián)制備新型人工神經(jīng)支架材料及其生物學(xué)特性的對比研究. 中華創(chuàng)傷雜志, 2010, 26(2): 165?170.

[4] Tang ZP, Chen XY, Tang RH. Current application of scaffold materials for nerve tissue engineering. J Clin Rehabil Tissue Eng Res, 2008, 12(1): 189?192.唐洲平, 陳興泳, 唐榮華. 神經(jīng)組織工程生物支架材料的應(yīng)用現(xiàn)狀. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2008, 12(1): 189?192.

[5] Zheng HY, Huang JF, Chen ZH, et al. Experimental rarely of nerve allograft through the application of slow-releasing film with FK506/NGF/RGD composites. Chin J Clin Anat, 2009, 27(2): 212?215.征華勇, 黃繼鋒, 陳莊洪, 等. 復(fù)合FK506/NGF/RGD緩釋膜應(yīng)用于同種異體神經(jīng)移植的實驗研究. 中國臨床解剖學(xué)雜志, 2009, 27(2): 212?215.

[6] Xie XT, Zhang CQ. Biological and artificial nerve conduit for repairing peripheral nerve defect. Neural Regen Res, 2006, 1(4): 372–374.

[7] Shi ZD, Liu MW, Qin ZZ, et al. Appcation of a venous conduit as a stent for repairing rabbit facial nerve injury. Neural Regen Res, 2007, 2(12): 717–721.

[8] Gu XS, Ding F, Yang YJ, et al. Construction of tissue engineered nerve grafts and their application in peripheral nerve regeneration. Prog Neurobiol, 2010, 93(2): 204–230.

[9] Zhao S, Gong X, Li GY. Influence of different pigskin degreasing methods on collagen yield. Chin Leath, 2007, 36(9): 33?36.趙帥, 鞏旭, 李國英. 豬皮的不同脫脂方法對膠原提取率的影響. 中國皮革, 2007, 36(9): 33?36.

[10] Gao ST, Deng ZS, Li BJ, et al. Comparison of different chemical methods for preparation of acellular nerve scaffold. Chin J Rep Recon Surg, 2008, 22(7): 851?853.高嵩濤, 鄧展生, 李寶軍, 等. 不同去細胞神經(jīng)支架制備方法的對比研究. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2008, 22(7): 851?853.

[11] Kitchell JP, Wise DL. Poly (lactic/glycolic acid) biodegradable drug-polymer matrix systems. Methods Enzymol, 1985, 112: 436?448.

[12] Li J, Yan QJ, Xu Y, et al. Preparation and characterization of nerve graft material poly[LA-(Glc-Lys)]/NGF/β-TCP. Funct Mater, 2007, 38(Suppl): 1851?1853.李娟, 嚴(yán)瓊姣, 徐盈, 等. 人工神經(jīng)支架材料聚(羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸)/NGF/β-TCP復(fù)合膜的制備及性能研究. 功能材料, 2007, 38(Suppl): 1851?1853.

[13] Dong NR, Huang JF, Zheng HY, et al. Regeneration of rat sciatic nerve promoted by sustained-release diaphragm of RGD peptide grafted poly[LA-(Gic-Lys)], FK506 and nerve growth factor. Chin J Orthop Trauma, 2008, 10(11): 1066?1069.董能讓, 黃繼鋒, 征華勇, 等. 乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸多肽接枝聚復(fù)合 FK506和神經(jīng)生長因子緩釋膜促進大鼠坐骨神經(jīng)再生的實驗研究. 中華創(chuàng)傷骨科雜志, 2008, 10(11): 1066?1069.

[14] Liu B, Cai SX, Ma KW, et al. Fabrication of a PLGA-collagen peripheral nerve scaffold and investigation of its sustained release property in vitro. J Mater Sci: Mater Med, 2008, 19: 1127?1132.

[15] Li SH, Cai SX, Liu B, et al. In vitro characteristics of poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres incorporating gelatin particles loading basic fibroblast growth factor. Acta Pharmacol Sin, 2006, 27(6): 754?759.

[16] Zhou JQ, Chen SG, Zhu ZK. Kinetics model of spherical immobilized cellulase. Chin J Biotech, 2005, 21(5): 799?803.周建芹, 陳實公, 朱忠奎. 微球載體固定化纖維素酶的反應(yīng)動力學(xué)模型研究. 生物工程學(xué)報, 2005, 21(5): 799?803.

[17] Gates BD, Xu QB, Stewart M, et al. New approaches to nanofabrication:? molding, printing, and other techniques. Chem Rev, 2005, 105(4):1171–1196.

[18] Ainslie KM, Desai TA. Microfabricated implants for applications in therapeutic delivery, tissue engineering, and biosensing. Lab Chip, 2008, 8(11): 1864–1878.

[19] Feng L, Wu HL, Ma P, et al. Development and optimization of oil-filled lipid nanoparticles containing docetaxel conjugates designed to control the drugmrelease rate in vitro and in vivo. Int J Nanomed, 2011, 6: 2545–2556.

[20] Caldorera-Moore M, Guimard N, Shi L, et al. Designer nanoparticles: Incorporating size, shape, and triggered release into nanoscale drug carriers. Expert Opin Drug Deliv, 2010, 7(4): 479–495.

[21] Hsu YY, Gresser JD, Trantolo DJ. Effect of polymer foam morphology and density on kinetics of in vitro controlled release of isoniazid from compressed foam matrices. J Biomed Mater Res, 1997, 35(1): 107?116.

[22] Ivanov AE, Kumar A, Nilsang S, et al. Evaluation of boronate-containing polymer brushes and gels as substrates for carbohydrate-mediated adhesion and cultivation of animal cells. Colloids Surf B Biointerfaces, 2010, 75(2): 510?519.

[23] Wang Z, Luo J, Wang W, et al. Characterization and culture of isolated primary dairy goat mammary gland epithelial cells. Chin J Biotech, 2010, 26(8): 1123?1127.王楨, 羅軍, 王偉, 等. 奶山羊乳腺上皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定. 生物工程學(xué)報, 2010, 26(8): 1123?1127.