胡楊甜菜堿醛脫氫酶基因的功能分化

劉佳琪，楊雪，李迪，楊海靈

1 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

2 中國科學(xué)院植物研究所 系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國家重點實驗室，北京 100093

甜菜堿是一類季銨化合物，普遍存在于細(xì)菌、藻類、動物和植物中[1]。植物甜菜堿可以通過不同過程保護(hù)細(xì)胞免受脅迫壓力的損害，包括參與細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)，清除自由基，保護(hù)細(xì)胞膜完整性，穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)與功能，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)組織免受脫水損害等。甜菜堿是以膽堿為底物經(jīng)兩步酶催化合成，首先由膽堿單加氧酶 (Choline rnonooxygenase，CMO) 催化膽堿形成甜菜堿醛，然后由甜菜堿醛脫氫酶 (Betaine aldebyde dehydrogenase，BADH，E.C.1.2.1.8) 催化形成甜菜堿，其中BADH是合成甜菜堿的關(guān)鍵酶[2]。許多研究發(fā)現(xiàn)將BADH基因轉(zhuǎn)入煙草[3]、胡蘿卜[4]、水稻[5]、棉花[6]等植物中，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、耐鹽、抗凍性都得到一定程度的提高，比如在胡蘿卜中過量表達(dá) BADH基因顯著增強(qiáng)了植株的抗鹽能力；在棉花中轉(zhuǎn)入菠菜BADH基因明顯增強(qiáng)其抗凍性能[4]，說明了轉(zhuǎn)基因植株在低溫下細(xì)胞膜的通透性能較好，這可能是甜菜堿對維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有一定程度的保護(hù)作用[6]。因此，這些研究表明 BADH在植物的抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

甜菜堿脫氫酶屬于醛脫氫酶 (ALDH) 超基因家族中的一個亞家族[7]，迄今為止，BADH基因已從擬南芥、菠菜、甜菜、堿蓬、水稻、小麥、豌豆等草本植物中得到分離和鑒定[7-10]，而木本植物BADH基因的研究報道較少。胡楊Populus euphratica是楊柳科楊屬中古老的一個種，具有耐鹽堿、抗旱、抗寒、抗風(fēng)沙、適應(yīng)性強(qiáng)等特點，是我國西北干旱鹽堿荒漠地帶能形成純林的唯一高大喬木樹種[11]。由于胡楊獨特的抗逆能力使其能在干旱、鹽堿化、多風(fēng)沙的惡劣環(huán)境中生長，這對維持該地區(qū)脆弱的生態(tài)平衡具有非常重要的作用[12]。本研究從胡楊中克隆得到2個BADH基因，對該基因的基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、表達(dá)模式、所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與生化功能進(jìn)行了詳細(xì)的研究，為深入揭示BADH基因在植物逆境脅迫中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 BADH基因序列的鑒定與命名

根據(jù)已知擬南芥ALDH10A8和ALDH10A9蛋白序列 (GenBank Accession No. AAM13070，AAK44148)，利用TBLASTN檢索GenBank中毛果楊Populus trichocarpa的基因組數(shù)據(jù)庫，獲得的2個與擬南芥ALDH10A8和ALDH10A9均具有較高相似性的序列。獲得序列經(jīng)過Pfam判讀，確定該序列編碼的蛋白具有BADH結(jié)構(gòu)域特征。我們將這2組序列分別命名為PtBADH1 (GenBank Accession No. XM_002318594) 和 PtBADH2 (GenBank Accession No. XM_002322111)。

1.2 胡楊BADH基因的克隆

胡楊苗取自新疆。取新鮮胡楊頂芽組織0.1 g，按照Aurum Total RNA Kit (BIO-RAD) 試劑盒說明書步驟提取胡楊頂芽組織總 RNA，并以總RNA為模板，通過RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaKaRa)，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PtBADH1和PtBADH2基因序列分別設(shè)計引物 PtBADH1-CL1/CL2和PtBADH2-CL1/CL2 (表1)。引物由Invitrogen公司合成。以cDNA為模板，利用2對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶，純化產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中。挑選多個陽性克隆進(jìn)行雙向測序，測序分析使用載體通用引物。

1.3 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

PeBADH1和PeBADH2的蛋白序列與其他植物ALDH序列通過Clustal X 1.83 進(jìn)行氨基酸序列比對，然后經(jīng)BioEdit手動校對。利用MEGA V.4.0的neighbour-joining (NJ) 模型構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000。

1.4 胡楊BADH基因的組織表達(dá)分析

為了研究 BADH基因在胡楊不同組織中和不同脅迫下的表達(dá)分布，分別對1年生胡楊進(jìn)行了NaCl和H2O2脅迫處理，NaCl脅迫處理條件是：150 mmol/L NaCl 處理7 d，而H2O2脅迫處理條件是：0.5% H2O2處理12 h，然后提取不同處理的頂芽、葉、韌皮部、莖和根等組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PeBADH1和PeBADH2的基因序列分別設(shè)計特異性引物PeBADH1-SP1/SP2和PeBADH2-SP1/SP2 (表1)。在PCR反應(yīng)中以含有目的基因的pGEM-T載體作為陽性對照，以不加任何cDNA模板的PCR反應(yīng)液作為陰性對照，并以胡楊A(yù)ctin基因作為內(nèi)標(biāo)。PCR反應(yīng)程序是：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，26個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，為了進(jìn)一步驗證所擴(kuò)增到的是否為目的基因，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.5 胡楊BADH蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建、融合蛋白的表達(dá)與純化

根據(jù)PeBADH1和PeBADH2的cDNA序列設(shè)計表達(dá)引物PeBADH1-EX1/EX2和PeBADH2-EX1/EX2 (表1)。通過定向克隆技術(shù)將PeBADH1和PeBADH2基因的編碼序列亞克隆到帶6×His標(biāo)簽的pET30a表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tuner感受態(tài)細(xì)胞中。將測序驗證正確的重組表達(dá)菌于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，以1∶100稀釋后擴(kuò)大培養(yǎng)至A600為0.5~0.6，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)4 h。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于4 ℃、6 500×g離心10 min收獲菌體，用緩沖液A (20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.5) 重懸，冰上超聲破碎裂解。然后4 ℃、10 000×g離心30 min，取少量原菌液、超聲破碎離心后的上清液和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE檢測是否具有目的蛋白，SDS-PAGE檢測采用10%的分離膠，5%的濃縮膠。蛋白質(zhì)純化用 Ni親和柱 (Amersham pharmacia biotech)。首先用緩沖液A平衡Ni親和柱，將超聲破碎后離心上清液上樣，然后以緩沖液 A平衡，最后用緩沖液B (0.5 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.5) 洗脫目的蛋白，收集目的蛋白洗脫峰進(jìn)行下一步酶學(xué)活性分析。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 胡楊BADH蛋白的酶學(xué)活性和熱力學(xué)穩(wěn)定性測定

植物 BADH基因是植物醛脫氫酶 (ALDH)超家族的一個亞類型，本實驗對ALDH常見底物乙醛的活性測定參照Black的方法進(jìn)行測定[13]。以乙醛為底物，室溫下50 mmol/L Tris (pH 8.5)、1 mmol/L NAD+、100 mmol/L KCl、2% TritonX-100為反應(yīng)緩沖液，將純化得到的BADH蛋白酶分別在25 ℃到75 ℃之間每5 ℃設(shè)定一個溫度梯度下保溫10 min，在保溫結(jié)束后檢測酶對底物乙醛的催化活性。

1.7 胡楊BADH蛋白結(jié)構(gòu)模擬

選取豌豆AMADH蛋白 (PDB:3iwj) 的X衍射晶體結(jié)構(gòu)為模板，以Align 2D程序 (InsightII的Homology模塊) 進(jìn)行序列比對，運(yùn)用InsightII的 Modeler模塊構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生 10個結(jié)構(gòu)，每個結(jié)構(gòu)產(chǎn)生 10個不同的環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)，優(yōu)化水平為高等，以Profiles-3D對各結(jié)構(gòu)進(jìn)行評價，選取最優(yōu)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡楊BADH基因的序列與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

使用RT-PCR方法，以胡楊頂芽cDNA為模板，克隆獲得 PeBADH1和 PeBADH2的cDNA序列 (GenBank Accession No. JN816361和JN816362)。PeBADH1的cDNA編碼503個氨基酸的蛋白，預(yù)測分子量為 54.93 kDa。PeBADH2的 cDNA編碼 503個氨基酸的蛋白，預(yù)測分子量為54.90 kDa。PeBADH1蛋白序列與毛果楊PtBADH1的蛋白序列僅有4個氨基酸差異，而 PeBADH2蛋白序列與毛果楊 PtBADH2的蛋白序列有9個氨基酸差異(圖1)。

圖1 植物BADH蛋白的序列比對分析Fig. 1 Sequence alignments of plant BADH proteins. Conserved residues in all plant BADH proteins are marked in black. The NAD＋-binding sites of plant BADH proteins are marked with black arrows. This sequence alignment was created using the following sequences: PeBADH1 (GenBank Accession No. JN816361), PeBADH2 (GenBank Accession No. JN816362), PtBADH1 (GenBank Accession No. XM_002318594), PtBADH2 (GenBank Accession No. XM_002322111), PsBADH (GenBank Accession No. CAC48392), AtBADH (GenBank Accession No. AAM13070), OsBADH (GenBank Accession No. BAC76608), SoBADH (GenBank Accession No. P17202), AcBADH (GenBank Accession No. AAM19157), SlBADH (GenBank Accession No. AAL33906), BvBADH (GenBank Accession No. P28237), TaBADH (GenBank Accession No. AAL05264).

為了研究胡楊BADH基因與其他植物BADH基因的序列相似性，我們選取多個代表不同進(jìn)化歷史的植物BADH基因為研究對象，包括雙子葉植物擬南芥Arabidopsis thaliana、菠菜Spinacia oleracea、甜菜 Beta vulgaris、堿蓬 Suaeda liaotungensis、濱藜atriplex centralasiatica、豌豆Pisum sativum，單子葉植物水稻Oryza sativa、小麥Triticum aestivum等植物。序列比對分析發(fā)現(xiàn)所有BADH蛋白高度保守 (圖1)，其序列相似性范圍是 70%~92%，其中 PeBADH1和PeBADH2蛋白的序列相似性最高為 92%，而小麥BADH蛋白與豌豆BADH蛋白的序列相似性最低為70%。

BADH基因被證明是ALDH基因超家族的成員[7]，植物ALDH基因超家族的其他亞家族類型，包括ALDH2、ALDH3、ALDH7和GAPDH亞家族的蛋白序列也加入到系統(tǒng)發(fā)育分析中。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示PeBADH1和PeBADH2與所有BADH聚成一枝，支持率達(dá)到100% (圖2)，這支持本研究克隆的2個基因為BADH基因。

2.2 胡楊BADH蛋白三維結(jié)構(gòu)模建

圖3A和圖3B展示了模擬的2個胡楊BADH蛋白的三維結(jié)構(gòu)。優(yōu)化后的構(gòu)象用Profile-3D進(jìn)行氨基酸殘基的兼容性考察，Profile-3D分析結(jié)果如圖3C所示，從圖中可以看到絕大部分氨基酸殘基得分都是正值，位于合理的范圍。結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)PeBADH1與PeBADH2的結(jié)構(gòu)高度保守(圖3D)。胡楊PeBADH1與PeBADH2蛋白都具有 3個結(jié)構(gòu)域：輔酶 NAD＋結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NAD-binding domain)，催化結(jié)構(gòu)域 (Catalytic domain) 和寡聚反應(yīng)結(jié)構(gòu)域 (Oligomerization domain) (圖3A和3B)。其中第1~132與151~230位氨基酸是輔酶NAD＋結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合輔酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸；第231~480位氨基酸是催化結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域能特異結(jié)合不同的反應(yīng)底物；而第 481~490與133~150位氨基酸是寡聚反應(yīng)結(jié)構(gòu)域，由2個長β折疊和1個短β折疊組成的。

2.3 胡楊BADH基因的組織表達(dá)模式

通過RT-PCR研究胡楊BADH基因在正常生長、鹽脅迫、氧化脅迫下不同組織 (根、莖、葉、頂芽和韌皮部) 中的表達(dá)分布 (圖 4)。RT-PCR擴(kuò)增后對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示在正常生長、鹽和H2O2脅迫下，PeBADH1和PeBADH2基因在韌皮部中不表達(dá)。在正常生長情況下，PeBADH1和PeBADH2基因在莖、葉、頂芽中都表達(dá)；不同之處在于PeBADH2基因的表達(dá)豐度比PeBADH1高，同時PeBADH2基因在根中表達(dá)較弱，而PeBADH1基因在根中未檢測到表達(dá)。鹽脅迫明顯地誘導(dǎo)根中PeBADH1基因的表達(dá)，而抑制了PeBADH1和PeBADH2基因在其他組織中的表達(dá)。H2O2脅迫抑制了PeBADH1和PeBADH2基因在莖和頂芽中的表達(dá)。這些結(jié)果顯示PeBADH1與PeBADH2存在表達(dá)模式的分化。

2.4 胡楊 BADH蛋白表達(dá)、純化及酶活性分析

將構(gòu)建的表達(dá)載體 pET30a/PeBADH1和pET30a/PeBADH2分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tuner感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)PeBADH1和PeBADH2在大腸桿菌Tuner中高效表達(dá) (圖5)。通過鎳柱親和層析純化后，獲得純化的重組蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白分子量與預(yù)測的PeBADH1和PeBADH2蛋白分子量大小一致。

BADH是植物ALDH超基因家族成員，由于植物 ALDH對底物多種脂肪醛和芳香醛具有廣泛活性，特別是大部分ALDH對乙醛具有很高的活性，因此我們分別測定了 PeBADH1和 PeBADH2對乙醛的活性，對乙醛的催化活性的測定參照 Black[13]的方法，PeBADH1和PeBADH2的酶活性分別為0.073 μmol/(min·mg)和0.107 μmol/(min·mg)，PeBADH2的酶活性是PeBADH1的1.5倍，這說明胡楊BADH蛋白具有醛脫氫酶活性。

圖2 植物BADH基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic tree showing relationships between PeBADH and other classes of plant ALDH. The affiliations of the plant BADH sequences used in the tree reconstruction are specified in the legend of Fig. 1. The affiliations of the other plant ALDH sequences are the following: Oryza sativa ALDH3 (GenBank Accession No. AAD35089), Arabidopsis thaliana ALDH3 (GenBank Accession No. AAL59944), Craterostigma plantagineum ALDH3 (GenBank Accession No. CAC84900), Zea mays GAPDH (GenBank Accession No. Q43272), Oryza sativa GAPDH (GenBank Accession No. AAM00227), Arabidopsis thaliana GAPDH (GenBank Accession No. AAK59790), Arabidopsis thaliana ALDH7 (GenBank Accession No. AAK55676), Oryza sativa ALDH7 (GenBank Accession No. AAG43027), Glycine max ALDH7 (GenBank Accession No. AAP02957), Oryza sativa ALDH2 (GenBank Accession No. BAA96794), Arabidopsis thaliana ALDH2 (GenBank Accession No. AAM27003), Zea mays ALDH2 (GenBank Accession No. AAK58370).

圖3 胡楊PeBADH1和PeBADH2蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬Fig. 3 Structure modelling of PeBADH1 and PeBADH2 proteins. (A,B) Structures of PeBADH1 and PeBADH2. (C) Evaluation of the structure of PeBADH1 and PeBADH2 by Profile-3D program. (D) Structural comparison of PeBADH1 (green) and PeBADH2 (red).

圖4 胡楊PeBADH1和PeBADH2基因的表達(dá)模式Fig. 4 Expression of the PeBADH1 and PeBADH2 genes in various tissues of P. euphratica. NC, NA and HO indicate the tissue under normal growth conditions and following NaCl and H2O2 treatments, respectively.

圖5 胡楊PeBADH1和PeBADH2蛋白的表達(dá)與純化Fig. 5 Overexpression and purification of BADH proteins from P. euphratica. 1: molecular mass markers; 2: total cellular extract from E. coli; 3, 5: total cellular extracts from induced bacteria containing PeBADH1 and PeBADH2, respectively; 4, 6: the purified PeBADH1 and PeBADH2, respectively.

2.5 胡楊BADH蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性分析

PeBADH1和PeBADH2蛋白熱力學(xué)穩(wěn)定性結(jié)果如圖 6所示。結(jié)果顯示 PeBADH1和PeBADH2蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性具有較大差異。PeBADH1在40 ℃時還保持著最高活性的85%，而PeBADH2僅保持著最高活性的25%。在50 ℃時，PeBADH1保持著最高活性的60%，而PeBADH2僅保持著最高活性的 10%。這說明PeBADH1是一個熱力學(xué)穩(wěn)定性較高的酶，在50 ℃以下都是穩(wěn)定的，而相對于 PeBADH1，PeBADH2是一個熱力學(xué)穩(wěn)定性較低的酶。

圖6 PeBADH1和PeBADH2蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性Fig. 6 Thermal stability of recombinant PeBADH1 and PeBADH2.

3 討論

植物在干旱、鹽堿等逆境條件下可積累大量的甜菜堿[14]，而甜菜堿的積累對改善滲透調(diào)節(jié)、保護(hù)細(xì)胞膜具有重要作用。植物體內(nèi)甜菜堿的合成途徑相對簡單，主要包含兩步氧化反應(yīng)完成，甜菜堿一旦被合成后就不能被進(jìn)一步代謝，積累在細(xì)胞中作為永久性或半永久性滲透調(diào)節(jié)劑[4]。因此，甜菜堿合成途徑中的限速酶基因BADH被認(rèn)為是最有希望的脅迫抗性基因之一，BADH的分子生物學(xué)與生物化學(xué)研究引起廣泛的關(guān)注。在本研究中，我們從胡楊中克隆到2個BADH基因，對該基因的基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與生化功能進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究。

在水稻、大麥和甜菜中，Northern blotting分析發(fā)現(xiàn) BADH在正常生長和鹽脅迫條件下均表達(dá)，但在鹽脅迫條件下表達(dá)量升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些基因能夠提高植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，降低因滲透失水造成對細(xì)胞膜、酶及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的傷害[8-9,15]。在本研究中，在正常生長條件下的根中沒有檢測到胡楊PeBADH1基因的表達(dá)，但當(dāng)受到鹽脅迫時表達(dá)，這說明PeBADH1基因表達(dá)的積累與鹽脅迫存在緊密關(guān)聯(lián)，這個基因可能在胡楊細(xì)胞免受鹽脅迫壓力的損害中發(fā)揮重要作用。而PeBADH2基因在正常生長條件和鹽脅迫下的根中微弱表達(dá)，說明PeBADH2可能在胡楊抗鹽反應(yīng)中沒有發(fā)揮至關(guān)重要的作用，由于PeBADH2基因在正常生長條件下，在根、莖、葉和頂芽中均表達(dá)，說明這個基因在植物的生長發(fā)育中可能發(fā)揮著重要作用。

圖7 PeBADH1和PeBADH2蛋白的輔酶NAD＋結(jié)合位點分析Fig. 7 The NAD＋-binding sites of PeBADH1 and PeBADH2 proteins. Blue dashed lines represent hydrogen bond interaction.

BADH蛋白一般都具有輔酶NAD＋結(jié)合結(jié)構(gòu)域[16]，結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)PeBADH1和PeBADH2蛋白中有6個氨基酸殘基能與NAD＋形成氫鍵 (圖7)，說明這6個氨基酸是和輔酶NAD＋結(jié)合的關(guān)鍵活性位點氨基酸。在這6個氨基酸中，除了第159位的Thr和Trp外，其他5個氨基酸在其他物種的BADH蛋白中高度保守，而第159位的Thr在菠菜、濱藜和堿蓬BADH蛋白中被Ser替代 (圖 1)。PeBADH1和 PeBADH2蛋白的第231~480位氨基酸是催化結(jié)構(gòu)域 (圖3)，這個結(jié)構(gòu)域能特異結(jié)合不同的反應(yīng)底物，菠菜 BADH蛋白的晶體結(jié)構(gòu)顯示在催化結(jié)構(gòu)域有1個Cys殘基是結(jié)合底物的關(guān)鍵活性位點氨基酸[16]，序列比較分析顯示這個氨基酸是 PeBADH1和PeBADH2蛋白的第294位Cys殘基，這個氨基酸在所有的BADH蛋白中絕對保守 (圖1中的第297位氨基酸位點)。

PeBADH1和PeBADH2蛋白的序列相似性高達(dá)92%，雖然蛋白序列相似性很高，兩蛋白的酶學(xué)活性卻有較大差異，PeBADH2的酶活性是PeBADH1的 1.5倍，而熱力學(xué)穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)PeBADH2的熱力學(xué)穩(wěn)定性低于PeBADH1，這說明兩蛋白的生化性質(zhì)有較大的差異。另外，基因的表達(dá)模式結(jié)果也顯示PeBADH1與PeBADH2表達(dá)模式上有較大的變異。因此，本研究結(jié)果預(yù)示著胡楊PeBADH1與PeBADH2基因可能存在功能上的分化。

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