蛋白含量檢測(cè)的抗干擾新方法

董源，湯靈玲，林林，盧山

南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇省分子醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046

蛋白質(zhì)定量檢測(cè)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域廣泛涉及的重要生物化學(xué)分析內(nèi)容。多年以來(lái)，盡管有先進(jìn)的蛋白檢測(cè)方法如質(zhì)譜、熒光分析等[1-2]在不斷發(fā)展，而福林酚試劑 (Folin-Ciocalteu’s reagent)、二辛可寧酸 (Bicinchoninic acid，BCA)和考馬斯亮藍(lán) G-250 (Coomassie brilliant blue G-250，CBB，也被稱作Bradford) 等仍然是最常規(guī)使用的比色測(cè)定方法[3]。這些方法是利用氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物或者染料-蛋白質(zhì)絡(luò)合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度間存在的線性關(guān)系而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定樣品中可溶性蛋白濃度的，但在實(shí)際應(yīng)用中，常常會(huì)因?yàn)槎喾N化學(xué)物質(zhì)干擾而影響檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致使用局限[4]。

例如，福林酚試劑法會(huì)受到表面活性劑、金屬離子螯合劑、還原劑及含氮化合物[5-6]等的嚴(yán)重干擾；BCA方法雖然受表面活性劑影響小，但對(duì)金屬離子螯合劑、還原劑等的存在很敏感[5]；CBB法與福林酚試劑法類似，對(duì)表面活性劑的耐受性差[7]，所以這些方法總會(huì)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)測(cè)定液中非蛋白組分的存在而影響蛋白質(zhì)含量的精確測(cè)定，具體使用時(shí)，通常需要針對(duì)不同的干擾物質(zhì)選用不同的測(cè)定方法。如果蛋白液中存在表面活性劑，可以選用BCA方法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量；而蛋白溶液中含有金屬離子螯合劑，就需要替換為CBB法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。這樣，不僅給蛋白質(zhì)含量檢測(cè)帶來(lái)操作上的不便，也使得不同溶液中蛋白質(zhì)含量的比較分析成為困難，還可能對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性產(chǎn)生影響，因此，人們總希望能夠找到好方法解除干擾。有研究針對(duì)某些特定的樣品如骨骼肌[8]，或某些特定操作如聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳[9]，探討適宜的檢測(cè)方法；也有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)檢測(cè)850 nm吸收值對(duì)CBB法進(jìn)行藥液蛋白質(zhì)含量分析中羧乙烯聚合物 (Carbopol) 產(chǎn)生的干擾進(jìn)行校正[10]；而含糖蛋白溶液則可以通過(guò)蛋白質(zhì)沉淀又溶解的方法來(lái)去除糖分導(dǎo)致的干擾[11]等；但迄今為止，對(duì)于多種常見(jiàn)的干擾物質(zhì)并沒(méi)有很好的解決辦法，所以開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便的受多種干擾物質(zhì)影響小的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法十分必要。

本研究在廣泛使用的福林酚試劑法[12]的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)制定實(shí)驗(yàn)試劑的組成與配比以及操作程序，建立蛋白質(zhì)檢測(cè)新方法的同時(shí)又探討新方法發(fā)色產(chǎn)物的優(yōu)選檢測(cè)波長(zhǎng)以及穩(wěn)定性，還分析新方法對(duì)多種常見(jiàn)干擾物質(zhì)的包容性，能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)的快速準(zhǔn)確定量提供方便。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin，BSA)、苯甲基磺酰氟 (Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 從Sigma公司購(gòu)入，蛋白酶抑制劑混合物 (Protease inhibitor cocktail，PIC) 購(gòu)自Roche公司。聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)、?-巰基乙醇 (?-Mercaptoethanol，?-ME)和乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·Na2，EDTA) 購(gòu)自Amresco公司。二硫蘇糖醇 (Dithiothretol，DTT)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 (Ethylene glycol bis (2-aminoethyl) tetraacetic acid，EGTA)、硫酸銨(Ammonium sulfate，(NH4)2SO4) 和尿素 (Urea)購(gòu)自Bio Basic公司。福林酚試劑由上海荔達(dá)生物科技公司出品。細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清 (Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為PAA Laboratories公司生產(chǎn)，低限基本培養(yǎng)基 (Minima essential medium，MEM) 粉末購(gòu)自GIBCO公司。十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、釩酸鈉 (Na3VO4)等其他常用試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.2 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo Scientic公司)，酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司)，小型渦旋器。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

稱取一定量 BSA溶解于蒸餾水中，調(diào)配終濃度為4 g/L，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物細(xì)胞裂解液的制備及干擾物質(zhì)的添加

細(xì)胞全蛋白待測(cè)樣品是通過(guò)裂解液收集、破碎細(xì)胞而獲取的上清液[13]，因此細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定中的非蛋白干擾物質(zhì)主要來(lái)源于裂解液組分 (細(xì)胞體積可忽略不計(jì))，細(xì)胞裂解液里添加的干擾成分的含量即為待測(cè)樣品干擾物質(zhì)的濃度。首先制備 10倍基本裂解液 (200 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，1.5 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA和10% SDS)，保存于-20 ℃。使用前冰上稀釋，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分別添加不同含量的各種干擾組分如DTT或者β-ME等，以及1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF和1×PIC。當(dāng)討論表面活性劑對(duì)蛋白測(cè)定的干擾時(shí)，基本裂解液組成不包含SDS，而各表面活性劑濃度按照具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求添加。

1.2.3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及全蛋白提取

將 1.5×106人前列腺癌細(xì)胞 PC-3接種于10 mL含5% FBS-MEM培養(yǎng)基的100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，在5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，生長(zhǎng)至50%飽和以上時(shí)，用4 ℃預(yù)冷的PBS(-)洗滌2次后，加入500 mL預(yù)冷的PBS (-)，然后用刮棒冰上收集細(xì)胞，并平均分配細(xì)胞液于1.5 mL離心管，4 ℃、10 000×g離心10 min，去上清，再移入包含不同成分的細(xì)胞裂解液，渦旋振蕩，放置冰上30 min，重復(fù)離心操作，收集上清液用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定，也可以放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋白定量新方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別配制A貯存液 (含1.89 mol/L碳酸鈉和1 mol/L 氫氧化鈉)，B貯存液 (含0.25% 酒石酸鈉 (W/V)、0.125% 硫酸銅 (W/V) 和 2.5% SDS (W/V)) 及C發(fā)色液 (為2 mol/L福林酚原液的10倍稀釋液，用HCl調(diào)整pH至1) 于室溫下存放。

將 BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液按照二倍稀釋法用蒸餾水稀釋至最低濃度為0.0625 g/L的7個(gè)梯度濃度，分別取5 mL BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液各梯度樣品放入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品至少有3個(gè)重復(fù)樣，空白對(duì)照為同體積的蒸餾水；然后加入25 mL工作液 (臨用前混合50個(gè)體積A貯存液與1個(gè)體積B貯存液)。再加入200 mL發(fā)色液，混合均勻，室溫下放置 30 min，利用酶標(biāo)儀在570~630 nm范圍任一波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。獲取數(shù)值后輸入Excel軟件，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)吸光值，然后添加趨勢(shì)線，獲得線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)。另外，將標(biāo)準(zhǔn)樣品連續(xù)放置0.3、1、2、4、8、24 h后在630 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值，用于比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性。

1.2.5 蛋白定量新方法對(duì)干擾物質(zhì)的耐受性分析

進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，將與標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液同樣體積的0.1~4 g/L濃度區(qū)間的細(xì)胞蛋白樣品也加入96孔板中，每個(gè)待測(cè)樣品至少有3個(gè)重復(fù)樣；然后每個(gè)樣品添加25 mL工作液，最后加入 200 mL發(fā)色液，混合均勻，室溫下放置30 min，利用酶標(biāo)儀在590 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。獲得數(shù)值后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲取線性回歸方程，再將待測(cè)樣品吸光值導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 不同吸收波長(zhǎng)下的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線和發(fā)色產(chǎn)物穩(wěn)定性的比較

以 BSA為標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別在 570、595或630 nm波長(zhǎng)下繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其相應(yīng)的線性相關(guān)系數(shù)平方 (R2) 值分別為 0.998、0.998或 0.997，均大于通常標(biāo)準(zhǔn)曲線要求的 R2值 (0.996)[14]，說(shuō)明用該標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所求的回歸方程是有意義的，且在上述波長(zhǎng)范圍均可用作新方法的檢測(cè)波長(zhǎng)，其中595 nm處獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光值最大，為優(yōu)選波長(zhǎng)。此外，630 nm波長(zhǎng)下最高濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光值隨時(shí)間變化的曲線如圖2所示，可以看出4 h內(nèi)幾乎沒(méi)有變化，8 h后下降約1.8%，24 h后下降14%，說(shuō)明新方法獲得的發(fā)色產(chǎn)物在數(shù)小時(shí)內(nèi)顏色基本能夠保持恒定。

2.2 表面活性劑對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定的影響

細(xì)胞裂解液中 SDS含量不斷上升時(shí)，新方法對(duì)蛋白質(zhì)濃度測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖3A。SDS含量即使高達(dá)10%，細(xì)胞全蛋白濃度也幾乎沒(méi)有變化。

圖1 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 BSA standard curves for protein assay.

圖2 發(fā)色產(chǎn)物最大吸光值24 h內(nèi)的變化Fig. 2 Time course for maxi-Absorbances during 24 h.

圖3 表面活性劑存在下細(xì)胞全蛋白含量的檢測(cè)Fig. 3 Protein assay for cell lysates in the presence of 3 surfactants, respectively. (A) Lysis buffer containing SDS. (B) Lysis buffer containing NP-40 or TritonX-100.

如果采用其他的常用表面活性劑TritonX-100或 NP-40來(lái)處理細(xì)胞，則蛋白質(zhì)濃度測(cè)量結(jié)果的變化見(jiàn)圖3B，當(dāng)TritonX-100含量小于或等于1%，NP-40含量小于或等于2%，對(duì)蛋白定量沒(méi)有明顯的影響。

2.3 金屬離子螯合劑對(duì)細(xì)胞全蛋白定量的影響

不同濃度金屬離子螯合劑EDTA或EGTA存在下，新方法對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，50 mol/L EDTA使蛋白質(zhì)濃度顯著降低，而2 mmol/L EGTA使蛋白質(zhì)濃度下降了42%。但是EDTA與EGTA濃度分別為25 mmol/L或1 mmol/L及以下則對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)沒(méi)有明顯干擾。

圖4 金屬離子螯合劑存在下全蛋白含量的檢測(cè)Fig. 4 Protein assay for cell lysates in the presence of chelators, respectively. (A) EDTA. (B) EGTA.

2.4 還原劑對(duì)細(xì)胞全蛋白定量的影響

新方法對(duì)含有不同濃度DTT或β-ME的細(xì)胞蛋白裂解液進(jìn)行的定量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5，可以看出樣品溶液中包含DTT或β-ME在1 mmol/L及以下對(duì)蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)沒(méi)有顯著影響。

圖5 還原劑存在下全蛋白含量的檢測(cè)Fig. 5 Protein assay for cell lysates in the presence of reductants, respectively. (A) DTT. (B) β-ME.

2.5 含氮物質(zhì)對(duì)細(xì)胞全蛋白定量的影響

常用的含氮物質(zhì)硫酸銨和尿素存在時(shí)，細(xì)胞蛋白定量的結(jié)果如圖 6所示，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨含量小于或等于0.5 mol/L，或尿素含量小于或等于 4 mol/L 對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)不會(huì)造成顯著干擾。

圖6 含氮化合物存在下全蛋白含量的檢測(cè)Fig. 6 Protein assay for cell lysates in the presence of nitrogen-containing compunds, respectively. (A) (NH4)2SO4. (B) Urea.

3 討論

福林酚試劑法是1951年Lowry等[15]在雙縮脲反應(yīng)基礎(chǔ)上，引入福林酚試劑來(lái)擴(kuò)大反應(yīng)信號(hào)的蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法，因此又被稱作 Lowry法。主要依據(jù)是利用堿性條件下Cu2+與肽骨架的-CO-NH-基團(tuán)形成的藍(lán)色絡(luò)合物將鱗鎢酸和鱗鉬酸還原為鎢和鉬藍(lán)而進(jìn)一步呈色的結(jié)果[16]。常用的試劑組成如表1所示，首先使蛋白質(zhì)樣品置于堿性環(huán)境，然后與CuSO4試劑混合，室溫放置約15 min，再加入福林酚試劑放置45 min，660 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。此方法的主要缺點(diǎn)是對(duì)許多干擾物質(zhì)的包容性差，如表面活性劑TritonX-100或 SDS含量?jī)H達(dá)1%，金屬離子螯合劑EDTA濃度達(dá)到10 mmol/L，尿素含量達(dá)3 mol/L，或硫酸銨含量達(dá)3% (約0.227 mol/L)，以及還原劑如硫醇等的存在就會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)試結(jié)果[5-6,17]。

表1 比較新方法與目前常用的福林酚法試劑配比及組成Table 1 Comparison for reagent components between new and Folin-Ciocalteu’s reagent protein assay

長(zhǎng)久以來(lái)，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)此方法在不同領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行改良[18-20]，有的增加了操作的復(fù)雜性，但效果仍然有限。本研究探討的新方法沒(méi)有對(duì)原方法繁雜化，且將 SDS耐受性提高了約10倍。實(shí)驗(yàn)中SDS濃度沒(méi)有進(jìn)一步增加，是因?yàn)榇郎y(cè)樣品溶液的粘度隨著 SDS濃度的上升而不斷增加，幾乎已達(dá)到操作的極限，這應(yīng)該是SDS作為表面活性劑在溶液中的增稠作用所導(dǎo)致的。另外，少量TritonX-100和NP-40也不影響測(cè)定結(jié)果，可見(jiàn)新方法對(duì)表面活性劑的包容性明顯增加，這可能與B貯存液中添加的少量SDS有關(guān)聯(lián)[21]。

新方法對(duì)金屬離子螯合劑 EDTA耐受濃度增加1倍以上，這可能是因?yàn)锽貯存液的Cu2＋濃度顯著降低而減少了工作液中螯合劑能夠結(jié)合的底物，因此提高了對(duì)螯合劑的包容性。

同時(shí)，新方法對(duì)還原劑DTT和β-ME均顯示出一定的耐受性；對(duì)含氮化合物如硫酸銨的包容性增加2倍，對(duì)尿素的耐受性也有所提高，但相關(guān)機(jī)理不清楚。這可能是新方法顯著增強(qiáng)蛋白質(zhì)樣品在未加入福林酚試劑前的堿性環(huán)境，使 Cu2+與肽骨架的-CO-NH-基團(tuán)形成的藍(lán)色絡(luò)合物反應(yīng)更完全的影響；而且我們實(shí)驗(yàn)使用的蛋白質(zhì)含量檢測(cè)范圍明顯高于常用福林酚試劑法的5~100 mg/L[12]，因此新方法對(duì)干擾物質(zhì)包容性的增強(qiáng)也可能與檢測(cè)靈敏度的變化相聯(lián)系，需要將來(lái)進(jìn)一步分析驗(yàn)證。此外，本實(shí)驗(yàn)僅以細(xì)胞裂解液為測(cè)定樣品，沒(méi)有嘗試其他蛋白樣品的檢測(cè)，也沒(méi)有針對(duì)福林酚試劑法的其他干擾成分如糖類、氨基酸及多肽的影響進(jìn)行探討，因此新方法的適用范圍等還有待深入研究。

綜上所述，新方法操作簡(jiǎn)單、迅速，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，檢測(cè)范圍0.1~4 g/L，對(duì)多種常見(jiàn)干擾成分具有較好的包容性，如表2所示，適用不同裂解液制備的細(xì)胞蛋白檢測(cè)，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)具有廣泛應(yīng)用前景。

表2 新方法對(duì)常見(jiàn)干擾物質(zhì)的最大耐受濃度Table 2 Highest levels for interferences used in new assay

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