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    利用核糖體工程選育丙酮丁醇菌提高丁醇產(chǎn)量

    2012-02-09 00:55:12陳麗杰商光來袁文杰吳又多白鳳武
    生物工程學(xué)報(bào) 2012年9期
    關(guān)鍵詞:丁醇鏈霉素核糖體

    陳麗杰,商光來,袁文杰,吳又多,白鳳武

    大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧 大連 116024

    丁醇作為一種新型的生物燃料,具有其獨(dú)特的性質(zhì):能量密度高、腐蝕性低、揮發(fā)性低[1],與汽油的性質(zhì)相似,可直接用于現(xiàn)有的發(fā)動(dòng)機(jī)系統(tǒng),已受到世界各國的廣泛關(guān)注。目前丁醇發(fā)酵中,丁醇的產(chǎn)量相對(duì)較低,這加大了后續(xù)分離成本,降低了其經(jīng)濟(jì)實(shí)用性,因此提高丁醇產(chǎn)量是提高丁醇產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)性的手段之一[2]。微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中,微生物菌種起著至關(guān)重要的作用。性狀優(yōu)良的高產(chǎn)菌株可以減少發(fā)酵和產(chǎn)物分離成本,提高經(jīng)濟(jì)效益,具有良好的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和市場(chǎng)潛力[3],因此獲得一株高產(chǎn)丁醇菌株成為提高丁醇產(chǎn)量的前提。丁醇本身對(duì)發(fā)酵菌株C. acetobutylicum 具有很大的毒性。當(dāng)丁醇濃度達(dá)到10~11 g/L時(shí),菌體生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制,并大量死亡[4],從而限制更高濃度丁醇的生成,因此菌體對(duì)丁醇的耐受性低也是制約丁醇產(chǎn)量提高的重要因素[5]。

    核糖體是微生物進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的重要細(xì)胞器,與胞內(nèi)代謝活動(dòng)、基本生理過程密切相關(guān)。核糖體發(fā)生突變將嚴(yán)重影響胞內(nèi)物質(zhì)的代謝[6]。核糖體工程技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的微生物育種方法。通過向微生物核糖體組分 (核糖體蛋白和 rRNA) 引入點(diǎn)突變,調(diào)控代謝系統(tǒng),誘導(dǎo)或刺激代謝產(chǎn)物的表達(dá),獲得代謝產(chǎn)物合成能力提高的突變菌株[7-8]。通常使用鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素誘變微生物,使其核糖體發(fā)生突變。核糖體工程技術(shù)具有較好的誘變效果,目前主要用于提高微生物代謝物的產(chǎn)量及化學(xué)耐受程度等[6,9-10]。Kurosawa等[11]以枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis 168為出發(fā)菌誘變獲得鏈霉素突變株,其α-amylase和protease產(chǎn)量提高了 20%~30%。Hosokawa等[12]對(duì)惡臭假單胞菌Pseudomonas putida KH146-2進(jìn)行鏈霉素、利福平和慶大霉素的抗性誘變,篩選得到的抗生素突變株對(duì) 4-羥基苯甲酸丁酯耐受程度由出發(fā)菌的0.8%提高到5%。

    與其他的育種方法相比,核糖體工程簡(jiǎn)單易行,無需特殊設(shè)備,便于大批量的篩選。在所使用的抗生素中,鏈霉素誘變效果較好,正突變和增產(chǎn)率高,且其抗性突變?cè)谡T變育種中應(yīng)用較多[10]。核糖體工程用于C. acetobutylicum的誘變篩選,以提高丁醇產(chǎn)量目前還沒有報(bào)道。鑒于此,本文通過核糖體工程技術(shù),使用鏈霉素誘變C. acetobutylicum L7,期望獲得高產(chǎn)高耐丁醇菌株,解決丁醇產(chǎn)量低的實(shí)際問題,并為后續(xù)的研究工作奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    本實(shí)驗(yàn)室馴化保存的丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum L7。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    活化培養(yǎng)基 (g/L):葡萄糖20,胰蛋白胨30,酵母粉10。

    發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L):葡萄糖70,CH3COONH42.3,MgSO4·7H2O 0.2,K2HPO4·3H2O 0.5,KH2PO40.5,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.01,酵母粉2,生物素0.01,對(duì)氨基苯甲酸0.01,pH 5.5。

    平板培養(yǎng)基 (g/L):葡萄糖30,CH3COONH42.3,MgSO4·7H2O 0.2,K2HPO4·3H2O 0.5,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.01,胰蛋白胨6,瓊脂20,pH 6.2。

    抗生素:配制濃度為20 g/L的鏈霉素母液,保存于?20 ℃。使用時(shí)按一定比例稀釋。

    所用培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

    1.2 方法

    1.2.1 培養(yǎng)方法

    菌種活化:將1 mL冷凍保藏的菌種接種于20 mL活化培養(yǎng)基中,37.5 ℃厭氧箱 (Forma 1029,Thermo Fisher Scientific) 中活化培養(yǎng)。

    搖瓶培養(yǎng):將活化好的菌種以10% (V/V)的接種量接種于110 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,37.5 ℃厭氧箱中靜置培養(yǎng)。

    發(fā)酵培養(yǎng):1.2 L發(fā)酵培養(yǎng)基裝入3 L發(fā)酵罐(1.5BG-4-3000,上海保興生物公司) 中,通氮?dú)?0 min,保證罐內(nèi)厭氧環(huán)境。將菌種以10% (V/V)的接種量接于發(fā)酵罐內(nèi),發(fā)酵溫度37.5 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min。

    1.2.2 菌體濃度的測(cè)定

    在620 nm測(cè)量菌體的吸光度作為菌體的濃度 (OD620),空白對(duì)照為離心后的發(fā)酵液。

    1.2.3 鏈霉素最小抑菌濃度的確定

    將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液 (OD620≈1.0) 涂布于含有不同濃度 (0、2、4··10··50) mg/L的鏈霉素平板上,每個(gè)平板100 μL,相同鏈霉素濃度設(shè)置3個(gè)平行,37.5 ℃厭氧箱中培養(yǎng)2 d,觀察菌落的生長(zhǎng)情況,記錄無菌落生長(zhǎng)的最小鏈霉素濃度,即為鏈霉素對(duì)C. acetobutylicum L7的最小抑菌濃度[13]。

    1.2.4 核糖體工程誘變篩選 C. acetobutylicum L7技術(shù)路線

    使用鏈霉素對(duì)C. acetobutylicum L7進(jìn)行核糖體工程誘變育種。將活化好的菌液涂布于含有4~5倍MIC的鏈霉素平板上,培養(yǎng)4~5 d。挑取直徑較大或形態(tài)與原始菌有差異的菌落,96深孔板活化培養(yǎng)20 h,以10% (V/V)的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h,氣相色譜檢測(cè)丁醇產(chǎn)量,比較得出產(chǎn)量提高較多的菌株 (以原始菌為對(duì)照)。再以其為出發(fā)菌,涂布獲得單菌落,將其挑至鏈霉素平板上,此時(shí)濃度比前次篩選菌株時(shí)增加5 mg/L,挑取菌落進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè),重復(fù)以上步驟直到獲得高產(chǎn)菌株。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間大批量的誘變篩選,最終獲得丁醇產(chǎn)量提高率在10%左右的菌株。以上操作均在37.5 ℃厭氧箱中進(jìn)行。誘變篩選技術(shù)路線如圖1所示。

    1.2.5 氧化還原電位 (ORP) 和pH值的測(cè)定

    分別采用氧化還原電極 (Pt4805-DPAS-SCK8S, Mettler Toledo) 和 pH電極 (405-60-T-S7/ 120/9848,Mettler Toledo) 測(cè)定。

    1.2.6 糖濃度的測(cè)定

    葡萄糖濃度使用SBA-40E生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所) 測(cè)定。發(fā)酵液離心,取上清稀釋至糖濃度小于1 g/L,取25 μL稀釋液直接進(jìn)樣,讀取數(shù)值,并計(jì)算發(fā)酵液的糖濃度。

    圖1 核糖體工程篩選丁醇高產(chǎn)菌路線圖Fig. 1 Schematic diagram of screening for high butanol-yield strain by ribosome engineering.

    1.2.7 溶劑及有機(jī)酸的測(cè)定

    Agilent6890氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中各溶劑的含量。檢測(cè)條件:毛細(xì)管色譜柱 (30 m×0.25 mm× 0.50 μm),柱溫120 ℃;進(jìn)樣口溫度250 ℃;FID檢測(cè)器溫度300 ℃。H2流速40 mL/min;空氣流速 400 mL/min;N2流速 30 mL/min,進(jìn)樣量0.2 μL。采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)量,內(nèi)標(biāo)物為異丁醇。

    Waters1525液相色譜測(cè)定有機(jī)酸濃度。檢測(cè)條件:Aminex HPX-87H 有機(jī)酸分析柱(300 mm×7.8 mm),柱溫 50 ℃,二極管陣列檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,示差折光檢測(cè)器溫度50 ℃。流動(dòng)相及流速:0.005 mol/L H2SO4,0.5 mL/min,進(jìn)樣量:20 μL。

    1.2.8 發(fā)酵液粘度測(cè)定方法

    采用NDJ-1旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì) (上海方瑞儀器有限公司) 測(cè)定。選擇合適轉(zhuǎn)子,將其浸沒在待測(cè)發(fā)酵液中,室溫下調(diào)整到合適的轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液粘度進(jìn)行測(cè)定。

    1.2.9 丁醇耐性實(shí)驗(yàn)

    將活化好的菌種以 5% (V/V)的接種量接種于500 mL活化培養(yǎng)基中,37.5 ℃厭氧箱中培養(yǎng)。待菌體生長(zhǎng)到OD620≈1.0時(shí),充分混勻,分裝于4個(gè)搖瓶中,每瓶100 mL,添加丁醇至濃度為0、 6、12、14 g/L。測(cè)定不同丁醇濃度下菌體的生長(zhǎng)情況,以O(shè)D620表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 鏈霉素對(duì)C. acetobutylicum L7的最小抑菌濃度

    微生物具有一定的抗生素耐受濃度,高抗生素濃度下微生物全部被殺死,而低濃度下則發(fā)生突變的概率極低,不易獲得突變菌株[14],因此確定抗生素篩選濃度非常重要。合適的抗生素濃度將有利于誘變工作的進(jìn)行,提高誘變效率。最小抑菌濃度 MIC是反應(yīng)抗菌活性和能力的一個(gè)指標(biāo),定義抗生素的 MIC為無菌落生長(zhǎng)的最小抗生素濃度。

    按照 1.2.3方法進(jìn)行平板涂布,并記錄不同鏈霉素濃度下C. acetobutylicum L7菌落生長(zhǎng)情況,如圖2所示。從圖中可以看出,無鏈霉素的平板中,C. acetobutylicum L7生長(zhǎng)好,培養(yǎng)至2 d時(shí)菌體鋪滿整個(gè)平板,無單菌落 (圖A);在含有鏈霉素的平板上,菌體生長(zhǎng)受到抑制。10 mg/L鏈霉素濃度下,C. acetobutylicum L7在2 d內(nèi)無菌落生長(zhǎng) (圖B),確定10 mg/L為MIC;在40~50 mg/L的鏈霉素平板中,大部分菌體被殺死,培養(yǎng)至4 d只有2~4個(gè)菌落存活,形態(tài)如圖C和圖D。生長(zhǎng)出的菌落為鏈霉素抗性菌,有可能發(fā)生突變。

    在確定鏈霉素的MIC后,按照1.2.4設(shè)計(jì)的技術(shù)路線,通過平板轉(zhuǎn)接逐次提高鏈霉素濃度開始誘變篩選C. acetobutylicum L7,以獲得丁醇高產(chǎn)菌株。

    2.2 丁醇高產(chǎn)菌S3的獲得及傳代穩(wěn)定性

    得到丁醇高產(chǎn)的 C. acetobutylicum一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。通過使用鏈霉素的核糖體工程育種技術(shù)大批量篩選,共獲得 6株丁醇產(chǎn)量較高的菌株,其中7倍MIC鏈霉素抗性菌株S3丁醇產(chǎn)量最高,達(dá)到(12.00±0.10) g/L,如表 1所示。

    通過分析表中篩選結(jié)果,得出鏈霉素用于誘變C. acetobutylicum提高丁醇產(chǎn)量,效果比較理想??剐跃校琒13丁醇產(chǎn)量最低,為(11.72±0.11) g/L,提高了10.05%;其他5株菌丁醇產(chǎn)量提高率在10.14%~12.68%。

    連續(xù)傳代次數(shù)用于表達(dá)微生物菌株的使用壽命。傳代穩(wěn)定說明菌株性狀優(yōu)良,不易衰退[15]。通過核糖體工程技術(shù)篩選所獲得的6株菌,對(duì)其進(jìn)行傳代發(fā)酵實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)S3的發(fā)酵性能最穩(wěn)定,結(jié)果見表2。從表中可以看出,傳代5次,S3的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量較穩(wěn)定,分別維持在11.8 g/L和18.7 g/L左右,相比于原始菌一直穩(wěn)定高產(chǎn);丁醇在總?cè)軇┲兴急壤秊?.62~0.63。說明S3遺傳穩(wěn)定性較好,有利于后續(xù)研究的進(jìn)行。

    2.3 S3與C. acetobutylicum L7的生長(zhǎng)及發(fā)酵特性

    為考察S3生長(zhǎng)及發(fā)酵情況,將S3進(jìn)行上罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn),并與原始菌進(jìn)行了對(duì)比。兩者的生長(zhǎng)、耗糖、各溶劑、有機(jī)酸的生成及 ORP變化情況如圖3~5所示。

    圖2 鏈霉素平板中C. acetobutylicum L7的生長(zhǎng)情況Fig. 2 The growth of C. acetobutylicum L7 on streptomycin plates with different concentrations. (A) 0 mg/L streptomycin. (B) 10 mg/L streptomycin. (C) 40 mg/L streptomycin. (D) 50 mg/L streptomycin.

    表1 核糖體工程用于C. acetobutylicum L7的篩選結(jié)果Table 1 The high butanol-producing Clostridium strains by ribosome engineering

    表2 S3傳代穩(wěn)定性Table 2 The genetic stability of S3

    圖3 原始菌 (A) 和S3 (B) 的OD620、pH及殘?zhí)乔€Fig. 3 Time course of OD620, pH and residual sugars by C. acetobutylicum L7 (A) and S3 strain (B).

    圖4 原始菌 (A) 和S3 (B) 的發(fā)酵生產(chǎn)溶劑及有機(jī)酸曲線Fig. 4 Time course of solvents and acids production by C. acetobutylicum L7 (A) and S3 strain (B).

    圖5 原始菌和S3的ORP曲線Fig. 5 Time course of ORP by C. acetobutylicum L7 and S3 strain. ORP: oxidoreduction potential.

    丁醇發(fā)酵分為兩個(gè)時(shí)期:產(chǎn)酸期,菌體快速生長(zhǎng),產(chǎn)生有機(jī)酸 (乙酸和丁酸),pH降低;產(chǎn)溶劑期,菌體代謝相對(duì)緩慢,溶劑 (丙酮、丁醇和乙醇) 大量生成,并伴隨乙酸和丁酸的重吸收,pH緩慢升高。發(fā)酵過程中,菌體為維持自身代謝,消耗大量的葡萄糖。如圖3和圖4所示,S3和原始菌在產(chǎn)酸期代謝旺盛,生物量 OD620快速增加;14 h左右,二者pH降到最低,即pH拐點(diǎn),此時(shí)S3的pH值 (4.3) 和原始菌的 (4.2)相當(dāng),發(fā)酵液中積累乙酸的量分別為2.01 g/L、2.05 g/L;丁酸2.06 g/L、2.13 g/L,為發(fā)酵過程中酸積累的最大濃度。之后有機(jī)酸毒性顯現(xiàn),C. acetobutylicum開始酸的重吸收,酸濃度降低,溶劑快速生成,pH升高。隨著發(fā)酵進(jìn)行,S3和原始菌OD620達(dá)到最大,分別為3.18、3.19,此時(shí)51.4%的葡萄糖已被消耗。之后10 h, 溶劑繼續(xù)生成,丁醇毒性開始發(fā)揮作用,菌體OD620下降;此階段 S3和原始菌分別產(chǎn)生 3.78 g/L、2.26 g/L的丁醇,S3優(yōu)勢(shì)比較明顯。隨著丁醇濃度的增加,毒性進(jìn)一步加大,加上營養(yǎng)匱乏,菌體代謝停止,發(fā)酵結(jié)束,各溶劑產(chǎn)量達(dá)到最大。

    微生物代謝過程中會(huì)產(chǎn)生和消耗氧化還原力:NAD(P) 與 NAD(P)H,且胞內(nèi) NAD(P)/ NAD(P)H水平與菌體代謝和溶劑產(chǎn)生緊密相關(guān)[16-18]。氧化還原電位 (ORP) 是發(fā)酵體系氧化-還原性的外在反映[19]。分析原始菌和S3的發(fā)酵過程,發(fā)現(xiàn) ORP變化與菌體生長(zhǎng)、有機(jī)酸產(chǎn)生和重吸收、溶劑生成、pH變化密切偶聯(lián)。如圖3~5所示,菌體生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生大量有機(jī)酸,pH快速下降;同時(shí)產(chǎn)生大量能量和NAD(P)H,ORP隨之降低。當(dāng)有機(jī)酸積累到一定程度,毒性顯現(xiàn),其分子態(tài)形式可以透過細(xì)胞膜,自由進(jìn)入菌體產(chǎn)生解偶聯(lián)毒害作用[20-21]。于是開啟酸的重吸收通路,溶劑大量生成,有機(jī)酸濃度下降,pH緩慢升高,ORP趨向穩(wěn)定。隨丁醇濃度的增加,細(xì)胞代謝受到抑制,菌體加速死亡,ORP升高至發(fā)酵結(jié)束。ORP在發(fā)酵全程伴隨菌體生理代謝發(fā)生響應(yīng)變化[16]。發(fā)酵前24 h,S3的ORP表觀響應(yīng)更為迅速,在?493 mV至?470 mV之間變化,浮動(dòng)較大;隨后的15 h內(nèi),其維持在?490 mV左右,相比原始菌,此階段還原力依然較強(qiáng),產(chǎn)生5.52 g/L丁醇,而原始菌只生成 3.15 g/L,說明在產(chǎn)溶劑期為主的生理代謝階段,S3迅速積累溶劑丁醇,并具有更高的代謝通量,與 ORP的階段性穩(wěn)定 (?490 mV狀態(tài)下) 存在一定的關(guān)聯(lián)性。針對(duì)C. acetobutylicum進(jìn)行ORP調(diào)控以提高菌體發(fā)酵性能的研究已有報(bào)道[22],全程控制ORP有利于菌體提前進(jìn)入溶劑期,溶劑產(chǎn)量提高,發(fā)酵時(shí)間縮短,且 ORP的有效調(diào)控將改變細(xì)胞的代謝流及生理過程。本研究通過核糖體工程選育的菌株S3,其發(fā)酵過程ORP變化與丁醇代謝通量亦存在明顯關(guān)聯(lián),暗示若ORP控制在?490 mV,菌體丁醇代謝通量極有可能進(jìn)一步提高。

    對(duì)S3與C. acetobutylicum L7發(fā)酵終點(diǎn)時(shí),消耗糖濃、各溶劑產(chǎn)量及丁醇/糖等參數(shù)進(jìn)行了比較 (表3)。

    表3 S3與原始菌的比較Table 3 The comparison of S3 with C. acetobutylicum L7

    C. acetobutylicum發(fā)酵產(chǎn)生3種溶劑:丙酮(A)、丁醇 (B) 和乙醇 (E)。發(fā)酵終點(diǎn),A、B、E三者比例一般在3∶6∶1左右。表3數(shù)據(jù)顯示,S3和原始菌的 A/B/E比例相差不大;生長(zhǎng)過程中消耗的葡萄糖和最大生物量OD620基本相同,而最終S3生成的丁醇和乙醇比原始菌高,分別提高11.2% (1.26 g/L)、50% (0.57 g/L),丙酮相差很小,總?cè)軇┫鄳?yīng)提高9.7% (1.79 g/L);丁醇/糖轉(zhuǎn)化率由原始菌的0.19提高到0.22。S3發(fā)酵結(jié)束用時(shí)52 h,相比原始菌少9 h,發(fā)酵周期縮短,而產(chǎn)生的丁醇較多,說明S3丁醇的生產(chǎn)效率較高,達(dá)到 0.24 g/(L·h),相比提高 30.5%;因此S3在發(fā)酵中將更有優(yōu)勢(shì),可以產(chǎn)生較多的溶劑,其經(jīng)濟(jì)可行性得到提高。整個(gè)丁醇發(fā)酵過程中,有機(jī)酸的重吸收與溶劑產(chǎn)生相偶聯(lián)。S3與原始菌有機(jī)酸的重吸收量分別為2.70 g/L、2.89 g/L,相差不大;二者丙酮產(chǎn)量基本相同,而S3的丁醇與乙醇總產(chǎn)量相比原始菌高1.83 g/L,可以推測(cè)S3的丁醇與乙醇代謝通量有可能發(fā)生了變化。生成丁醇與乙醇的途徑中,丁醇脫氫酶和乙醇脫氫酶是兩個(gè)關(guān)鍵酶,且相互關(guān)聯(lián);二者結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變或活性增強(qiáng),是否為核糖體工程作用的靶點(diǎn),有待于下一步進(jìn)行研究確定。

    丁醇發(fā)酵后期,發(fā)酵液里存有大量菌體和一些其他物質(zhì),例如金屬離子、無機(jī)鹽、菌體自溶產(chǎn)生的蛋白、多糖、核酸等,致使發(fā)酵液具有一定的粘性,影響了整個(gè)發(fā)酵體系的傳質(zhì)傳熱,并增加攪拌的能量消耗[23]。若粘度較大,發(fā)酵效果和設(shè)備利用率將降低,不利于后續(xù)工作的進(jìn)行,增加溶劑分離的難度。對(duì)S3發(fā)酵液的粘度進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)其粘度由原始菌的 10 mPa·s減小到4 mPa·s,降低了 60%;這將便于溶劑分離和發(fā)酵工作的展開,從而減少發(fā)酵成本。

    2.4 S3與C. acetobutylicum L7的丁醇耐性

    微生物發(fā)酵法生產(chǎn)生物燃料時(shí)例如乙醇、1-丙醇等,目標(biāo)產(chǎn)物通常會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生很大的毒害作用,影響菌體生長(zhǎng)。丁醇發(fā)酵中,丁醇因其疏水性 (離液序列高) 堆積在細(xì)胞膜表面,干擾膜功能,其通透性和流動(dòng)性增加,使ATP、離子、磷脂、RNA、蛋白等流失,破壞適合菌體生長(zhǎng)的pH,影響胞內(nèi)新陳代謝和能量的運(yùn)輸及轉(zhuǎn)換,加速了菌體的死亡[5,24-25]。丁醇的毒性作用限制了發(fā)酵液中丁醇的濃度,增加后期的分離成本。因此對(duì)S3的丁醇耐性進(jìn)行了考察,如圖6所示不同丁醇濃度下 (0、6、12、14 g/L),C. acetobutylicum L7與S3菌體的生長(zhǎng)情況。

    圖6 不同丁醇濃度下原始菌與S3的生長(zhǎng)情況Fig. 6 Growth profles of C. acetobutylicum L7 and S3 challenged with different concentration of butanol. (A) 0 g/L butanol. (B) 6 g/L butanol. (C) 12 g/L butanol. (D) 14 g/L butanol.

    從圖中可以看出,在添加丁醇的情況下,S3的生長(zhǎng)均強(qiáng)于原始菌,同時(shí)間點(diǎn)OD620一直較原始菌大,表現(xiàn)出較強(qiáng)的丁醇耐受力。原始菌在12 g/L丁醇中,起初能夠維持生長(zhǎng),最大OD620為1.39;之后因其丁醇耐受低,菌體大量死亡。在添加14 g/L丁醇濃度下,S3菌體OD620緩慢增加,最大為 1.41;而原始菌無法存活,OD620一直減小,得出S3的丁醇耐受濃度比原始菌高,分別為14 g/L和12 g/L。

    丁醇對(duì)C. acetobutylicum的毒害作用相當(dāng)嚴(yán)重。無丁醇的培養(yǎng)基中,原始菌和S3生長(zhǎng)良好,最大OD620各為2.43、2.46;含有丁醇的情況下,原始菌與S3的生長(zhǎng)受到明顯抑制,菌體增殖緩慢,最大OD620都未能達(dá)到2.4;并且4種丁醇濃度下,出現(xiàn)正增殖的時(shí)間逐漸縮短,分別為:原始菌12 h,12 h,6 h,0;S3 15 h,15 h,9 h,6 h。在耐受丁醇極限濃度下 (原始菌 12 g/L,S3 14 g/L),OD620只能增殖到1.40,比無丁醇濃度下減小42.9%??梢缘贸?,丁醇毒性嚴(yán)重影響了菌體的生長(zhǎng)代謝。文獻(xiàn)指出[26-27],丁醇作用下,菌體細(xì)胞膜的組成發(fā)生很大改變;菌體不能維持內(nèi)部pH,ATPase活性降低?;诖?,下一步可對(duì)S3進(jìn)行丁醇耐性機(jī)理的探索,并提出提高丁醇耐受程度的策略,為進(jìn)一步提高丁醇產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

    3 結(jié)論

    本研究首次使用鏈霉素誘變 C. acetobutylicum L7提高丁醇產(chǎn)量。篩選獲得的菌株,丁醇產(chǎn)量提高率均超過10%;其中S3產(chǎn)量最高,達(dá)到12.48 g/L,丁醇耐受程度也有顯著提高,表明核糖體工程技術(shù)在篩選丁醇高產(chǎn)菌株方面有效、可行。通過分析比較 S3與C. acetobutylicum L7發(fā)酵性能差異,推測(cè)S3的丁醇及乙醇代謝通量有可能發(fā)生變化,后續(xù)研究工作將對(duì)菌株S3的抗性突變、丁醇耐受機(jī)理及代謝通路作進(jìn)一步的研究,為更大程度提高丁醇產(chǎn)能提供技術(shù)支持。

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