一株重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構(gòu)建及其高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

田靈芝，徐美娟，饒志明

江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué)應(yīng)用微生物與代謝工程研究室，江蘇 無錫 214122

γ-氨基丁酸 (簡(jiǎn)稱 GABA) 是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有效的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，具有許多重要的生理功能，如降血壓、保持神經(jīng)安定[2]、增強(qiáng)記憶、調(diào)節(jié)激素分泌、促進(jìn)生殖、保肝利腎等[3]。近年來，GABA的研究和應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外主要采用化學(xué)合成法[4]和微生物法[5]制備GABA，化學(xué)合成法反應(yīng)條件劇烈，污染嚴(yán)重[6]；微生物發(fā)酵法條件溫和、安全、成本較低，但后處理過程復(fù)雜且生產(chǎn)周期長(zhǎng)[7-8]；而全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法合成GABA可提高底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品純度，簡(jiǎn)化后處理工序、縮短生產(chǎn)周期且降低環(huán)境污染，因此受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛重視[9]。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過菌種篩選獲得一株植物乳桿菌，此菌株具有較高的谷氨酸脫羧酶活力，原始菌株搖瓶水平轉(zhuǎn)化24 h，GABA的產(chǎn)量可達(dá)到34.66 g/L[10]，原始菌株經(jīng)誘變處理后5 L發(fā)酵罐全細(xì)胞轉(zhuǎn)化24 h，GABA濃度達(dá)到65.45 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為 97.56%，產(chǎn)量明顯高于其他同類菌株。但是，由于植物乳桿菌是兼性厭氧微生物，培養(yǎng)條件較難控制且培養(yǎng)條件的變化對(duì) GABA的生產(chǎn)效率影響比較顯著；同時(shí)，GAD是生物催化 L-谷氨酸脫羧反應(yīng)生成 γ-氨基丁酸的限速酶，反應(yīng)方程式如下：

在植物乳桿菌野生菌株中各酶的表達(dá)量受到菌體自身代謝水平的調(diào)控[11]，因而其GAD的本底表達(dá)量不高導(dǎo)致了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率受限。鑒于此，本研究擬通過構(gòu)建GAD高表達(dá)型重組大腸桿菌，借助大腸桿菌生長(zhǎng)迅速、易于高密度培養(yǎng)和 GAD表達(dá)可以人工調(diào)控的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行GABA高效率生產(chǎn)。另外，通過對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，即酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及溫度、pH與酶活性的關(guān)系，幾種金屬離子對(duì)酶活的影響，來確定該酶作用的合適條件指導(dǎo)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法合成 GABA，并為工業(yè)化制備GABA提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌 Escherichia coli JMl09、BL21 (DE3) 由本實(shí)驗(yàn)室保藏，植物乳桿菌Lactobacillus plantarum GB 01-21由本實(shí)驗(yàn)室篩選并誘變獲得，克隆載體pMDl8-T購(gòu)自TaKaRa公司，質(zhì)粒pET-28a (+) 購(gòu)自Novagen公司。

1.1.2 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基

培養(yǎng)溫度37 ℃，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，氨芐青霉素濃度為100 mg/L，卡那霉素濃度為50 mg/L篩選轉(zhuǎn)化子，IPTG 誘導(dǎo)終濃度為0.5~1 mmol/L。

重組菌搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米漿1.5，NaCl 0.3，K2HPO40.1，MgSO4·7H2O 0.05。在pH 6.5~7.0、121 ℃下滅菌10 min。

重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖5.0，蛋白胨 10，玉米漿 7.5，NaCl 0.5，K2HPO40.1， MgSO4·7H2O 0.05，L-谷氨酸1.0，生物素2×10?5。pH 6.5~7.0、121 ℃下滅菌10 min。

1.1.3 主要試劑和儀器

質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。工具酶、IPTG購(gòu)自TaKaRa公司。咪唑和抗生素購(gòu)自上海Sangon公司。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺(American Promega Corporation)、廣范圍蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司。PCR引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑純。5 L發(fā)酵罐購(gòu)于上海保興生物設(shè)備工程有限公司，氨基酸自動(dòng)分析儀為日立835-50型，2619#樹脂 (陽(yáng)離子交換柱Φ 2.6 mm×150 mm)。

1.2 方法

1.2.1 谷氨酸脫羧酶基因的克隆

根據(jù) NCBI中植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ (GI：308044682)全基因組核酸序列3 254 376 bp中的lpgad基因序列設(shè)計(jì)谷氨酸脫羧酶編碼基因的引物，上游引物P1：5′-GACGGATCC ATGGACCAGAAGCTG TTAAC-3′；下游引物P2：5′-GGCGCGGCCGCCA GGTGTGTTTAAAGCTGTT-3′ (下劃線分別表示BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點(diǎn))。提取Lactobacillus plantarum染色體為模板，利用已設(shè)計(jì)好的引物PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 50 s，57 ℃ 1 min 30 s， 72 ℃2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得片段經(jīng)膠回收后與克隆載體pMDl8-T連接，轉(zhuǎn)化E. coli JMl09，經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切鑒定，將重組質(zhì)粒命名為T-Lpgad，測(cè)序由上海Sangon公司完成。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pET-28a-lpgad的構(gòu)建及 GAD在大腸桿菌BL21中的表達(dá)

將 T-lpgad用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ進(jìn)行雙酶切，膠回收l(shuí)pgad片段，將其與經(jīng)相同雙酶切處理獲得的線性化載體pET-28a (+) 混合，加入T4 DNA連接酶，16 ℃過夜連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將符合預(yù)期結(jié)果的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種至含卡那霉素 (終濃度為50 mg/L) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1%接種量轉(zhuǎn)接，37 ℃培養(yǎng)至OD600約0.6~0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)[12]。

1.2.3 SDS-PAGE

采用5%的濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳進(jìn)行蛋白分離，考馬斯亮蘭R-250染色[13]。

1.2.4 谷氨酸脫羧酶的純化

將過夜誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于10 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體，用PBS緩沖液 (pH 7.4)懸浮菌體，超聲波破碎細(xì)胞，然后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上柱，經(jīng)Ni-NTA純化[13]，得到純化后的GAD。

1.2.5 谷氨酸脫羧酶活力的測(cè)定

采用比色法[14]，首先配制底物溶液Macllvaine緩沖體系 (0.2 mol/L，pH 4.8，含0.1 mmol/L PLP，0.4 mol/L底物L(fēng)-谷氨酸鈉)，取200 μL底物溶液和100 μL酶液在30 ℃反應(yīng)一定時(shí)間，置于冰浴中，加入200 μL 0.2 mol/L硼酸緩沖液 (pH 9.0) 終止反應(yīng)；再加入1.0 mL 6%苯酚和400 μL次氯酸鈉溶液，充分振蕩后，沸水浴中反應(yīng)10 min，迅速在冰浴中冷卻顯色20 min，然后測(cè)定630 nm處吸光值變化。酶反應(yīng)體系中 GABA的量以標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，相對(duì)活力以單位時(shí)間內(nèi)A630的變化表示，一個(gè)酶活力單位 (U) 定義為在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol GABA所需的酶量。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

粗酶液蛋白質(zhì)含量采用Bradford法[15]測(cè)定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.7 谷氨酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

最適pH及pH穩(wěn)定性：配制pH 3.6~6.0的醋酸-醋酸鈉反應(yīng)緩沖液，30 ℃下將酶液分別與不同pH的反應(yīng)液混合，測(cè)定GAD在不同pH反應(yīng)體系中的酶活，考察pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響。再將一定量的酶液加入到以上不同pH的反應(yīng)緩沖液中，30 ℃下分別保溫2 h，測(cè)定剩余酶活，考察GAD在不同pH條件下的穩(wěn)定性。

最適溫度及熱穩(wěn)定性：采用pH 4.8的反應(yīng)緩沖液，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下測(cè)定酶活，研究溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響。將酶液置于以上不同溫度下保溫2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，測(cè)定剩余酶活，考察GAD在不同溫度下的穩(wěn)定性。

不同金屬離子及EDTA對(duì)酶活的影響：在反應(yīng)液中分別加入終濃度為 1 mmol/L的 Ca2+、Mg2+、K+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Na+、Ag+、Al3+、Li2+以及EDTA，30 ℃下測(cè)定GAD酶活，以不加金屬離子的反應(yīng)液作為對(duì)照，研究不同金屬離子對(duì)其酶促反應(yīng)的影響。另外，對(duì)具有明顯激活作用的金屬離子，配制不同的濃度進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

Km值及Vmax的測(cè)定：配制不同濃度的L-谷氨酸鈉底物溶液，分別與酶液在30 ℃下反應(yīng)，采用雙倒數(shù)作圖法確定GAD的Km及Vmax值。

1.2.8 重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)GABA

將斜面保藏的菌種接種至 50 mL (裝液量為10 mL) LB培養(yǎng)基中，于旋轉(zhuǎn)式搖床中37 ℃、160 r/min培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化，再以5%的接種量接入500 mL搖瓶 (裝液量為100 mL) 種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體，按上述條件培養(yǎng) 24 h得到種子液，按 10%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐 (裝液量為3 L)，先于37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再向其中添加乳糖至終濃度為1 g/L，同時(shí)在線控制pH 6.8流加葡萄糖，30 ℃誘導(dǎo)發(fā)酵14 h至OD600為13.6，發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)好的菌體全部離心收集，雙蒸水洗滌3次，用2 L乙酸-乙酸鈉緩沖液 (pH 5.0)懸浮菌體，添加底物L(fēng)-谷氨酸進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，5 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化條件：30 ℃、 250 r/min、120 L/h，轉(zhuǎn)化24 h后，加入15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，取1 mL進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定轉(zhuǎn)化液中GABA的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酸脫羧酶基因的克隆及分析

提取植物乳桿菌全基因組 DNA，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1 410 bp、編碼469個(gè)氨基酸的基因片段 (圖1)，連接pMDl8-T載體測(cè)序。Blast分析結(jié)果表明，擴(kuò)增獲得的基因核苷酸序列與 NCBI中公布的 lpgad基因序列(GenBank Accession No. ADO00011.1) 同源性高達(dá) 99.36%，其相差 9個(gè)堿基，4個(gè)氨基酸。L. plantarum GB 01-21基因 lpgad已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù) (Accession No. JN248358)。

圖1 lpgad基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of lpgad gene. 1: DL2 000 marker; 2: PCR products.

2.2 重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

將T-lpgad用BamHⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收 lpgad片段，將其與經(jīng)相同酶切線性化的pET-28a (+) 載體連接，酶切驗(yàn)證，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，釋放5 369 bp和 1 410 bp大小的片段 (圖 2)，分別對(duì)應(yīng)于pET-28a (+) 和lpgad的大小，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pET-28a (+) -lpgad。

圖2 質(zhì)粒pET-28a (+) -lpgad的酶切驗(yàn)證Fig. 2 Identification of pET-28a (+) -lpgad by enzyme digestion. M1: λDNA/Hind III marker; 1: pET-28a (+)-lpgad digested with BamH I; 2: pET-28a (+) -lpgad digested with BamH I and Not I; M2: DL2 000 marker.

2.3 lpgad基因在E. coli BL21 (DE3) 中表達(dá)與重組蛋白GAD的純化

將pET-28a (+) -lpgad轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)，在卡那霉素抗性 LB平板上挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即pET-28a (+) -lpgad/BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞，上清液SDS-PAGE分析，檢測(cè)到一條分子量約為53 kDa的特異性條帶，與報(bào)道的目標(biāo)蛋白大小一致[16]，如圖3所示。上清液測(cè)得比酶活為8.53 U/mg，是植物乳桿菌破碎細(xì)胞后粗酶液酶活的4.24倍。本實(shí)驗(yàn)選用的表達(dá)載體pET-28a (+) 中含有6·His-Tag編碼序列，采用Ni-NTA純化谷氨酸脫羧酶GAD。純化后的GAD經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3，可看出經(jīng)過純化后得到相對(duì)單一的條帶，基本上可以認(rèn)為已得到相對(duì)較純的GAD酶蛋白。純化后酶液的比酶活達(dá)到32.45 U/mg，是純化前粗酶液酶活的3.8倍，回收率達(dá)53.32%。結(jié)果見表1。

2.4 谷氨酸脫羧酶GAD的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 最適pH及pH穩(wěn)定性

GAD在pH 3.6~6.0范圍內(nèi)反應(yīng)時(shí)測(cè)定其酶活，由圖4可見，最適pH為4.8，與已報(bào)道的微生物來源的GAD反應(yīng)最適pH在4~5之間[17-19]基本一致。pH穩(wěn)定性方面，將GAD在pH 3.6~6.0不同pH條件下處理2 h后測(cè)定酶活性，GAD在pH 3.6~5.0范圍內(nèi)保溫2 h后均能保持80%以上的酶活力，pH值大于5.2，酶活降低較為明顯，說明該GAD在酸性環(huán)境下相對(duì)穩(wěn)定，具有較高的酸依賴性。

2.4.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性

在20 ℃~70 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行GAD酶促反應(yīng)，測(cè)得的酶活結(jié)果見圖5，由圖可知該GAD在低溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶活呈上升趨勢(shì)，37 ℃時(shí)酶活性達(dá)到最高，溫度再繼續(xù)升高，酶活則呈下降趨勢(shì)。熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如圖 5所示GAD在20 ℃~40 ℃較穩(wěn)定，水浴保溫10 h后相對(duì)酶活仍在85%以上，說明該酶在此溫度范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性，隨著溫度的升高，酶穩(wěn)定性逐漸下降，到達(dá)60 ℃時(shí)水浴保溫2 h，GAD迅速失活，幾乎檢測(cè)不到酶活且酶液出現(xiàn)絮狀沉淀，酶可能完全變性失活。

圖3 表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expressed and purified GAD. 1: supernatant of E. coli Bi21; 2: supernatant of E. coli B121 with recombinant plasmid pET-28a (+) -lpgad; M: protein marker (kDa); 3: purified GAD.

表l 重組蛋白GAD純化表Table l Purification of recombinant GAD

圖4 谷氨酸脫羧酶的最適pH范圍及其pH穩(wěn)定性Fig. 4 The optimal pH (A) and pH stability (B) of GAD.

圖5 谷氨酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度及其熱穩(wěn)定性Fig. 5 The optimal temperature (A) and thermal stability (B) of GAD.

2.4.3 不同金屬離子及EDTA對(duì)酶活性的影響

金屬離子經(jīng)?？梢宰鳛槊复俜磻?yīng)的輔助因子，因此在酶促反應(yīng)中經(jīng)常添加某些金屬離子來促進(jìn)酶促反應(yīng)的進(jìn)行。在GAD酶促反應(yīng)中添加各

種金屬離子以及 EDTA，其中以不加離子時(shí)的反應(yīng)液作為對(duì)照，設(shè)其酶活為100%，其對(duì)GAD酶活的影響結(jié)果見表2?？梢钥闯鯩n2+、Fe2+、Fe3+、Ag+、Cu2+均對(duì)植物乳桿菌GAD的活力有較大的抑制作用，Li+、K+、Na+等對(duì)活性影響不明顯，Ca2+、Mg2+對(duì)該酶有較強(qiáng)的激活作用。為了進(jìn)一步研究Ca2+、Mg2+對(duì)該重組酶GAD的影響，考酶活達(dá) 131%，可以考慮全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中添加Ca2+、Mg2+作為GAD酶促反應(yīng)的輔助因子，以期提高反應(yīng)體系中GAD酶活，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)GABA能力。察了兩種不同濃度金屬離子對(duì)重組酶 GAD的影響，確定最佳激活濃度，如圖6所示：2.5 mmol/L Ca2+時(shí)激活作用最明顯，相對(duì)酶活達(dá) 154%，3.5 mmol/L Mg2+對(duì)重組酶GAD的激活作用最強(qiáng)，

表2 金屬離子及EDTA對(duì)GAD酶活性的影響Table 2 Effect of metal ion and EDTA on the activity of GAD

圖6 不同濃度Ca2+、Mg2+對(duì)GAD酶活的影響Fig. 6 Effect of different concentration Ca2+ (A) and Mg2+ (B) on the activity of GAD.

2.4.4 谷氨酸脫羧酶Km值和Vmax測(cè)定

根據(jù)不同底物濃度與酶促反應(yīng)的關(guān)系，按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk作圖法，求重組GAD的表觀米氏常數(shù)，如圖7，可以得到Km為9.21 mmol/L，Vmax為7.58 mmol/(L·min)。

2.5 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的確定

圖7 重組GAD的Lineweaver-Burk作圖Fig. 7 Lineweaver-Burk plot of recombinant GAD.

通過對(duì)重組谷氨酸脫羧酶GAD酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，確定了其最適作用溫度、最適pH以及不同金屬離子和EDTA對(duì)重組GAD酶活性的影響，根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果，將轉(zhuǎn)化體系的溫度、pH分別調(diào)整至最適值，并向其中添加對(duì)重組酶GAD具有促進(jìn)作用的金屬離子，以此確定最適轉(zhuǎn)化條件為：乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.8)、2.5 mmol/L Ca2+、3.5 mmol/L Mg2+，轉(zhuǎn)化溫度37 ℃。

在進(jìn)行輸出以前，還要設(shè)置相關(guān)的求解控制參數(shù)，包括計(jì)算時(shí)間控制(設(shè)為100 ms)、輸出頻率、沙漏控制類型、沙漏系數(shù)以及缺省設(shè)置。由LS-DYNA EXPORTE模塊輸出K文件，打K文件設(shè)置內(nèi)存空間,以及為提高計(jì)算速度而適當(dāng)進(jìn)行質(zhì)量縮放[6]的修改。設(shè)置K文件中的參數(shù)需要具有一定的理論基礎(chǔ)，難度比較大，但是正確的設(shè)置會(huì)大大提高求解效率，縮短仿真時(shí)間，將復(fù)雜的仿真模型快速求解。

2.6 重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)GABA研究

將5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)至14 h的菌體進(jìn)行離心收集，雙蒸水洗滌3次后，2 L乙酸-乙酸鈉緩沖液懸浮，菌體濃度達(dá)6.2 g/L，添加底物L(fēng)-谷氨酸，分別在原始和優(yōu)化后的條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以50 g/L的投料量進(jìn)行分批投料，前期由于酶活水平較高，反應(yīng)速率較快，投料間隔為每3 h投料一次，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶活有所下降，反應(yīng)速度變慢，12 h后，投料時(shí)間間隔延長(zhǎng)到6 h，在轉(zhuǎn)速250 r/min、通氣量120 L/h的條件下轉(zhuǎn)化24 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心取上清，加入15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，取1 mL進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)得優(yōu)化前后反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物 GABA濃度分別為 143.5 g/L和204.5 g/L，轉(zhuǎn)化率分別為97.32%和97.92%，與最初轉(zhuǎn)化條件相比，相同轉(zhuǎn)化時(shí)間下，優(yōu)化后反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化液中 GABA累計(jì)濃度提高了42.5%。條件優(yōu)化前后，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定結(jié)果如圖8所示：

圖8 氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定條件優(yōu)化前后全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中L-Glu與GABA的含量圖譜Fig. 8 Map of GABA and L-Glu of whole cell transformation solutions analyzed by auto amino acid analyzer. (A) Original condition. (B) Optimized condition.

3 討論

本課題組前期研究結(jié)果表明：一方面，植物乳桿菌厭氧培養(yǎng)時(shí) GABA產(chǎn)量高于有氧環(huán)境，因此生長(zhǎng)速度較好氧微生物慢，影響了菌體的生長(zhǎng)；另一方面，植物乳桿菌中的低拷貝lpgad基因使得GAD的表達(dá)量有限，粗酶液酶活僅有2.01 U/mg，限制了GABA的生產(chǎn)效率。而增大酶的表達(dá)量及提供其合適的作用條件是提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的兩個(gè)重要策略，本文構(gòu)建了一株重組大腸桿菌BL21/pET-28a (+) -lpgad，借助其生長(zhǎng)迅速、可高密度培養(yǎng)及pET-28a表達(dá)質(zhì)粒中T7強(qiáng)啟動(dòng)子等優(yōu)點(diǎn)，在簡(jiǎn)化培養(yǎng)條件、縮短培養(yǎng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，大幅度提高了GAD的表達(dá)量，重組菌破細(xì)胞后粗酶液酶活為植物乳桿菌中GAD酶活的4.24倍。另外，利用6·His-Tag采用Ni-NTA柱親和層析法將重組菌中 GAD進(jìn)行純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，確定了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)所需的酶的最適反應(yīng)條件：最適pH為4.8，最適溫度為37 ℃，Ca2+、Mg2+作為激活劑。在此條件下，添加底物L(fēng)-谷氨酸，5 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化24 h，GABA累計(jì)濃度高達(dá)204.5 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為97.92%，在國(guó)內(nèi)外處于領(lǐng)先地位[20]，與初始轉(zhuǎn)化條件相比，轉(zhuǎn)化液中GABA累計(jì)濃度提高了 42.5%，在實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)現(xiàn)了微生物高效率生產(chǎn)GABA，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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