丹參滴注液制備工藝中的堿處理工藝優(yōu)化研究

范步高 徐國生（上海長征富民金山制藥有限公司，上海 201506）

丹參滴注液制備工藝中的堿處理工藝優(yōu)化研究

范步高 徐國生（上海長征富民金山制藥有限公司，上海 201506）

目的：在保證丹參滴注液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對原有丹參素鈉和原兒茶醛等指標(biāo)含量要求的前提下，提高丹酚酸B新增指標(biāo)的含量。方法：采用正交試驗方法，優(yōu)化堿處理工藝的相關(guān)參數(shù)。結(jié)果：最佳堿處理條件為A2B2，即pH 7.0～7.5，煮沸30 m in。結(jié)論：最佳 A2B2條件能夠減少丹酚酸B的過度降解，使丹酚酸B在丹參滴注液中含量相對較高。

丹參滴注液；丹酚酸B；堿處理；熱穩(wěn)定性；正交試驗

丹酚酸B是唇形科植物丹參（SalviamiltiorrhizaBge.）的干燥根和根莖中含量最高、且具強烈清除自由基和抗氧化作用的最強活性成分，對心、腦、肝、腎等多個器官均具有保護作用[1-4]。在中國藥典2005年版（一部）中第1次將丹酚酸B列入了丹參藥材的含量測定項目[5]，但未將其列入現(xiàn)行的丹參類單、復(fù)方注射液含量測定項目中（見表1）[6-10]，但按照國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）有關(guān)中藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高工作的要求，國家藥典委員會在原有標(biāo)準(zhǔn)制法的框架下已逐步將丹酚酸B等含量測定項目列入相關(guān)品種的提高標(biāo)準(zhǔn)草案中（見表1）[11-12]。為保證中藥制劑質(zhì)量的穩(wěn)定均一、安全有效，建立多指標(biāo)含量測定的必要性[13]已形成共識，并將作為中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的一項指導(dǎo)原則。本研究介紹的對丹參滴注液制備工藝中堿處理工藝的優(yōu)化研究，即為在丹參滴注液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高工作中所要求的在現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)制法框架下，在不過多影響丹參素鈉和原兒茶醛等原有指標(biāo)含量的前提下，最大限度提高新增指標(biāo)丹酚酸B在丹參滴注液中的含量（為方便不同產(chǎn)品或不同中間品間的相互比較，本研究的有效成分含量單位統(tǒng)一折算為mg/g生藥）。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫1100），TP6001-N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），W 501升降恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司），R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司），PZ-D-5型液體比重天平（上海良平儀器儀表有限公司），丹參滴注液生產(chǎn)用設(shè)備等。

1.2 材料

丹參藥材（河南洛陽），丹參75%醇沉液（上海長征富民金山制藥有限公司），乙醇（藥用），丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B對照品（上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心）。

表1 丹參類注射液有效成分含量要求比較

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參素鈉、原兒茶醛等含量測定

依據(jù)丹參滴注液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[8]進行測定。

2.2 丹酚酸B含量測定[11]

依據(jù)高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥD）測定。

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（KROMASIL 100-5C18，250mm×4.6mm）；以乙腈為流動相A，0.03%磷酸水溶液為流動相B，按表2進行梯度洗脫；流速為0.8 m L/min，柱溫30℃；檢測波長288 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算應(yīng)不低于10 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛和丹酚酸B對照品適量，加10%甲醇制成每1 m L含丹參素鈉0.5 mg、原兒茶醛0.05 mg和丹酚酸B 0.1 mg的混合溶液（也可制備單一的丹酚酸B對照品溶液，本法與“2.1”所檢測的丹參素鈉和原兒茶醛含量結(jié)果無顯著差異，可互為準(zhǔn)確性檢驗，本研究中丹參素鈉和原兒茶醛的含量結(jié)果采納“2.1”法），過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取相應(yīng)中間產(chǎn)品樣品用純化水稀釋至16 g生藥/250 m L或成品適量，再用純化水稀釋10倍，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定，按峰面積用外標(biāo)法計算其含量。

2.3 堿處理正交試驗

丹參滴注液標(biāo)準(zhǔn)處方：64 g丹參凈藥材經(jīng)水提、純化處理后與50 g葡萄糖混合，用注射用水配制成1 000 m L丹參滴注液，其標(biāo)準(zhǔn)制備方法[8]與一般丹參類注射液相比，最大不同之處是在丹參第1次75%醇沉液濃縮后的“pH 9煮沸水解1小時”操作，這一堿處理步驟，可以使丹酚酸B被加速分解，而目標(biāo)成分丹參素（鈉）和原兒茶醛的含量將會隨之增加[13]。所以，“堿處理”條件（pH值、煮沸時間）的優(yōu)化是提高丹酚酸B在丹參滴注液中含量的關(guān)鍵。

表2 丹參檢測梯度洗脫

2.3.1 樣品制備 樣品制備方法按SFDA頒布的丹參滴注液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行[8]。取同批次丹參第1次75%醇沉液，減壓濃縮后，按表3的因素水平表，并根據(jù)表4的試驗設(shè)計表進行pH調(diào)節(jié)和煮沸時間控制。每個試驗為500 g生藥量，水解后取樣、檢測（堿處理前原料液丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B含量分別為5.34、1.35、9.25 mg/g，總評分為 2.26）。

表3 因素水平

表4多重指標(biāo)綜合評分標(biāo)準(zhǔn)：各含量分值按含量最高值得1分，最低值得0分，中間值得分=（中間值－最低值）/（最高值－最低值）。每個試驗總評分按因素重要性分配權(quán)重（根據(jù)丹參素和原兒茶醛為丹酚酸B分解物或其他考量自定）計算，即總評分（yi）=丹參素鈉分值 +原兒茶醛分值+丹酚酸B分值×2。

表 4 L9（34）試驗計劃及試驗結(jié)果

2.3 .2 極差分析

表5 極差分析

根據(jù)表5極差分析結(jié)果，對丹參素鈉和原兒茶醛，最佳工藝為A3B3。對丹酚酸B，則最佳工藝為A1B1。而對“三者兼顧”的總評分而言，交互因子A×B則為主要因子，其因子趨勢圖（圖1）也顯示A與B有很強交互作用的“交叉”提示。

對有顯著交互作用因子A×B，可由圖1或因子A、B水平搭配表（表6）確定A2B2組合為最佳工藝條件，即調(diào)節(jié)pH至7.5，煮沸40 m in進行處理。

圖1 A×B交互因子趨勢（總評分）

表6 因子A、B水平搭配（總評分）

2.3.3 方差分析 進行方差分析（F檢驗）的假設(shè)條件是每一試驗獨立進行、每一試驗條件下的指標(biāo)服從正態(tài)分布。為提高方差分析結(jié)果的置信度，經(jīng)Shapiro-Wilk法正態(tài)性檢驗（簡稱W檢驗。當(dāng)統(tǒng)計量W＞W(wǎng)（n，α）臨界值時，樣本總體在α顯著性水平下接受正態(tài)性假設(shè)），丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、總評分等試驗結(jié)果的總體分布在α=0.01顯著性水平下均具正態(tài)性（表7）。方差分析（A×B因子列作為F值計算的分母）結(jié)果表明（表8）：A因子對丹參素鈉、原兒茶醛和丹酚酸B指標(biāo)均為關(guān)鍵因子，B因子對丹酚酸B指標(biāo)則為重要因子，而A、B因子對總評分的F值均小于1，同樣提示存在較強的A×B交互作用，分析結(jié)果及優(yōu)選方案與極差分析相同。

表7 試驗結(jié)果總體分布正態(tài)性檢驗

表8 試驗結(jié)果方差分析

2 .4 驗證試驗

根據(jù)實驗?zāi)康?，選擇“三者兼顧“的總評分分析結(jié)果的最佳堿處理工藝條件A2B2進行工業(yè)化放大試驗驗證，并根據(jù)生產(chǎn)設(shè)備等實際條件，確定堿處理條件為pH值7.0～7.5，煮沸30 m in后停止加熱，并按標(biāo)準(zhǔn)工藝[8]進行后續(xù)的生產(chǎn)操作，得丹參滴注液滅菌樣品，進行各項檢測。

3批合并投料600 kg丹參凈藥材，經(jīng)三次水煎煮、濃縮、75%醇沉、冷藏，取上清液濃縮后分成每批200 kg生藥量，3批后續(xù)操作中間產(chǎn)品及成品的含量檢測數(shù)據(jù)取其均值（表 9）。

表9 工業(yè)化放大驗證試驗含量變化

丹參滴注液堿處理工藝按上述正交試驗優(yōu)化條件進行驗證，并將所得樣品進行各項檢測均合格，表明pH 7.0～7.5煮沸30 m in的最佳堿處理工藝條件可行。若僅從優(yōu)化角度以丹酚酸B為考察指標(biāo)，則應(yīng)以取消堿處理為最佳，但丹參素鈉和原兒茶醛的含量將會有較多降低，表10為完全堿處理（按標(biāo)準(zhǔn)工藝[8]pH=9時煮沸1 h）與取消堿處理的含量變化比較（每2批小試投料640 g丹參凈藥材，至75%醇沉濃縮后均分2批，1批進行完全堿處理完成后續(xù)操作，另1批直接進行85%醇沉完成相同的后續(xù)操作，該批號用“*”標(biāo)注），結(jié)果2批完全堿處理的丹參滴注液成品的丹酚酸B含量均為0，但丹參素鈉（均值12.43 mg/g生藥）和原兒茶醛（均值1.77 mg/g生藥）的含量提高較多；取消堿處理的2批丹參滴注液成品的丹酚酸B含量均值高達7.49 mg/g生藥，而丹參素鈉（均值8.06 mg/g生藥）和原兒茶醛（均值1.20 mg/g生藥）的含量則相對降低較多，但均能符合丹參滴注液的含量測定要求[8]。

3 分析與討論

3.1 丹酚酸B的降解因素及措施

丹酚酸B是丹參中活性較強、含量最高的酚酸類有效成分。在低溫、弱酸性條件下其性質(zhì)相對穩(wěn)定，但對熱不穩(wěn)定，在水煎煮和濃縮等高溫操作過程中即已逐漸降解生成丹參素和原兒茶醛（表4、9）以及咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸等其他酚酸類有效成分[15-16]，特別是在堿性、高溫條件下則加速降解[17]，這也可由表5、8、10得到驗證。所以，生產(chǎn)中為減少丹酚酸B的“過度”降解，除應(yīng)嚴格控制pH值等關(guān)鍵工藝參數(shù)外，還需注意提高“熱處理”工作效率，防止容器局部過熱和料液受熱時間過長。

3.2 丹酚酸B“醇沉”損失的因素及措施

在2005年版和2010年版中國藥典[5,18]中，均規(guī)定丹參原藥材（干燥品）含丹酚酸B不得少于3.0%（若按規(guī)定不得過13.0%水分折算，丹酚酸B應(yīng)不少于26.1 mg/g生藥），但在丹參類注射液中丹酚酸B的含量均很少，而丹參素鈉和原兒茶醛也不是很高，尤其是注射液（小針劑）。比較表 9的操作過程，丹酚酸B和丹參素鈉在第1次75%醇沉操作中即被沉淀的雜質(zhì)“包裹”而損失很大一部分。所以，在醇沉操作中除應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)嚴格控制濃縮液的相對密度、醇沉的最終醇濃度外，加醇濃度、加醇速度及攪拌效果等相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化，也是減少丹酚酸B等有效成分醇沉損失的一個重要關(guān)注點（表10小試操作質(zhì)量有較大提高），若有發(fā)現(xiàn)醇沉渣（沉淀）形成過早、有效成分損失過大，合理地采用相同醇濃度的乙醇對醇沉渣進行一次有效成分的再提取，也是減少丹酚酸B等有效成分醇沉損失的一個有效補救措施[19]。

表10 丹參滴注液小試完全堿處理與取消堿處理的含量變化比較

致謝！本文檢測工作由倪慧芳技師等質(zhì)檢科同仁完成。

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[7]國家藥典委員會.《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中藥成方制劑第十七冊）藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：200-201.

[8]國家食品藥品監(jiān)督管理局.《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》（中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)部分）[S].2002：455-459.

[9]國家食品藥品監(jiān)督管理局.《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》（中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)部分）[S].2002：362-366.

[10]國家食品藥品監(jiān)督管理局.《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》（中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)部分）[S].2002：356-361.

[11]國家藥典委員會.關(guān)于公示丹香冠心注射液修訂標(biāo)準(zhǔn)的通知[Z/OL].2008-11-27.[2011-03-28].http://www.chp.org.cn.

[12]國家藥典委員會.關(guān)于中藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案的公示：丹參注射液[Z/OL].2011-03-14.[2011-03-28].http://www.chp.org.cn

[13]郝旭亮，張永文.中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立多指標(biāo)含量測定的必要性淺析[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2009，6（9）：31-33.

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[19]范步高.丹參醇沉渣中有效成分的再提取[J].中成藥，2011，33（11）：2005-2007.

Study on the Process Optimization of Alkali Treatment in the Preparation of Danshen Drip Liquid

Fan Bugao，Xu Guosheng（Shanghai Treeful Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shanghai201506，China）

Objective：To increase the content of the new ly added indicator of salianolic acid B on the premise of ensuring the contents of sodium danshensu and protocatechuic aldehyde according to the quality standards of Danshen drip liquid.Methods:To optimize the parameters of the process of alkali treatment through orthogonal experiment.Results:The optimized alkali treatment condition was A2B2（pH 7.0 ～ 7.5，boiling for 30 m ins）.Conclusion:The optimized condition of A2B2can reduce the over-degradation of salianolic acid B，thus the relatively high content of salianolic acid B in Danshen drip liquid can be obtained.

Danshen Drip Liquid；Salvianolic Acid B；Alkali Treatment；Thermal Stability；Orthogonal Test

范步高，男，工程師，執(zhí)業(yè)藥師。研究方向：藥品生產(chǎn)工藝、技術(shù)研發(fā)。E-mail：fanbugao@treeful.com.cn

2011-04-01）