桃金娘莖枝中沒食子酸的分離鑒定及含量測(cè)定

黃景健陳海燕駱夏王欽東陳凌波黃敏琪

（1廣西昌弘制藥有限公司，廣西 南寧，530221；2廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，530023）

桃金娘莖枝中沒食子酸的分離鑒定及含量測(cè)定

黃景健1陳海燕2駱夏1王欽東1陳凌波1黃敏琪2

（1廣西昌弘制藥有限公司，廣西 南寧，530221；2廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，530023）

目的：對(duì)桃金娘莖枝中的沒食子酸進(jìn)行提取分離鑒定并測(cè)定含量。方法：采用80%乙醇對(duì)桃金娘莖枝進(jìn)行提取，利用柱層析和重結(jié)晶對(duì)提取液進(jìn)行分離，通過理化性質(zhì)鑒別和波譜技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)；采用高效液相色譜法測(cè)定桃金娘莖枝中沒食子酸含量，色譜柱：Lichrospher C18，流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（1.5∶98.5），流速1.0m L/min，檢測(cè)波長為270 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：沒食子酸在0.1~0.6μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.999 2），平均回收率為100.6%，RSD為1.32%（n=6）。結(jié)論：該方法簡便可行，重現(xiàn)性好，可用于桃金娘莖枝中沒食子酸含量測(cè)定。

桃金娘；沒食子酸；分離；鑒定；含量測(cè)定

桃金娘（Rhodomyrtu stomentosa（Ait.）Hassk.），是桃金娘科桃金娘屬植物，別名山稔、山菍、崗稔、當(dāng)梨、稔子、豆稔，廣泛分布于我國東南部、南部及西南部，南亞、東南亞以及日本等地也有分布[1]。其葉能利濕止瀉，生肌止血[2]；果實(shí)能健脾胃、補(bǔ)血虛、止血痢[3]；桃金娘油具有抗炎作用[4]。桃金娘莖枝理氣止痛，利濕止瀉，去瘀止血，益腎養(yǎng)血，主治消化不良，勞傷出血，風(fēng)濕痹痛，血虛體弱等[2]。文獻(xiàn)報(bào)道含黃酮苷[5]、花色苷[6-8]等黃酮類成分以及植物多糖成分和沒食子酸等化合物[9]。目前關(guān)于桃金娘莖枝藥材的質(zhì)量控制方法，文獻(xiàn)報(bào)道甚少，為有效地開發(fā)和利用桃金娘莖枝藥材，更好地控制桃金娘莖枝藥材及含有桃金娘莖枝制劑的質(zhì)量，對(duì)桃金娘莖枝藥材的質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PG328A萬分之一分析天平；KQ5200B型超聲清洗器；Waters高效液相色譜儀515泵+2487雙波長紫外吸收檢測(cè)器；Agilent Syr.LC 25μL FN微量進(jìn)樣器；威瑪龍色譜工作站。

1.2 試藥

桃金娘莖枝藥材采集自廣西，且經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院中藥研究所鑒定為Rhodomyrtus tomentos a.，沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)110831-200302，原中國藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用）。對(duì)照藥材，由廣西中醫(yī)藥研究院中藥研究所提供。流動(dòng)相中的水為超純水，甲醇為色譜純。其他試劑均為分析純。

2 分離與鑒定

2.1 分離提取

桃金娘莖枝藥材粗粉6 Kg，80%乙醇回流提取4次，每次2 h，濾液合并，回收乙醇，濃縮蒸干，干膏用乙酸乙酯回流提取7次，每次2 h，濾過，濾液合并，回收溶劑，蒸干，得乙酸乙酯提取物，將提取物進(jìn)行硅膠柱層析分離，采用石油醚-乙酸乙酯（100∶0→60∶40）混合溶液，梯度洗脫，在石油醚-乙酸乙酯（7∶3）洗脫的第425流分中，析出結(jié)晶，經(jīng)石油醚-乙酸乙酯混合溶液重結(jié)晶，得到經(jīng)薄層色譜（TLC）檢查為單一斑點(diǎn)的成分。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

白色結(jié)晶，熔點(diǎn)（mp）238~240℃，溶于水、甲醇、乙醇， UV（乙醇）nm：215、270； IR（KBr） cm-1：3 495、3 280、3 060、2 655、1 649、1 614、1 545、1 452、1 325、1 220、866；1H·NMR ppm：7.18（2H，s）；MS（EI）m/z：170（M+，100）、153、135、125、113、107、96、79、51、45、39。 與 沒 食 子 酸 對(duì) 照 品 進(jìn) 行TLC對(duì)照，比移值（Rf值）一致。經(jīng)理化性質(zhì)鑒別和光譜數(shù)據(jù)鑒定，與文獻(xiàn)[10]相符，確定該化合物為沒食子酸。

3 薄層色譜定性分析

取干燥桃金娘莖枝藥材粉碎，稱取2 g，加水煮1 h，趁熱濾過，濾液用濃鹽酸調(diào)pH值至2，用乙醚萃取2次，每次30m L，取乙醚層，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?m L使溶解，作為供試品溶液。另取桃金娘對(duì)照藥材同法制成對(duì)照藥材溶液。再取沒食子酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 m L含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照《中國藥典》2005年版（一部）薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述各種溶液各1~2μL，分別點(diǎn)于同一含羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯（水飽和）-甲酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開劑，展開，取出晾干，噴以5%FeCl3溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，Rf=0.44，見圖1。經(jīng)多批樣品試驗(yàn)，薄層色譜的重現(xiàn)性好，可作為桃金娘莖枝的定性鑒別方法。

圖1 TLC圖

4 定量分析

4.1 色譜條件

色譜柱：Lichrospher C18，流動(dòng)相：甲醇 -0.2%磷酸水溶液（1.5∶98.5），流速 1.0m L/m in，檢測(cè)波長為270 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μL；理論塔板數(shù)按沒食子酸計(jì)算不低不于3 000。色譜圖見圖2、3。

4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，加甲醇制成30μg/m L的對(duì)照品溶液。

圖2 沒食子酸對(duì)照品HPLC圖

圖3 桃金娘莖枝藥材供試品HPLC圖

4.3 供試品溶液的制備

取桃金娘莖枝藥材粉末精密稱定0.50 g，置具塞錐形瓶中，精密加入 50%甲醇 30 m L，搖勻，稱定重量，超聲1 h，放冷加50%甲醇補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm有機(jī)相微孔濾膜濾過，即得。

4.4 線性關(guān)系的考察

精密稱取沒食子酸對(duì)照品25 mg，置25 m L量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1mg/m L標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6m L至10 m L量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 Y=63 287 X+17 776（n=6），r=0.999 2。表明，對(duì)照品在0.1~0.6μg范圍呈良好線性關(guān)系。

4.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，沒食子酸峰面積平均值為1 943 222，RSD=0.36%。

取供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，沒食子酸峰面積平均值為1 346 718，RSD=0.33%。

4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品，每隔2 h進(jìn)樣，進(jìn)行了10 h考察，結(jié)果沒食子酸含量的RSD=1.85%。

4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次桃金娘莖枝藥材粉末樣品各6份，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算，結(jié)果沒食子酸的平均含量為1.233 5mg/g，RSD=0.95%。

4.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已測(cè)知含量的藥材樣品（沒食子酸平均含量為1.233 5mg/g）0.25 g，共6份，精密稱定。精密加入1.0mg/m L的沒食子酸對(duì)照品溶液0.31m L，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算，結(jié)果沒食子酸的加樣平均回收率為100.6%，RSD=1.32%。

4.9 樣品含量測(cè)定

收集不同產(chǎn)地的桃金娘莖枝藥材，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件依法測(cè)定沒食子酸含量，結(jié)果見表1。

表1 桃金娘莖枝藥材樣品中沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

5 結(jié)論

桃金娘藥用用途及保健功能廣，特別是新發(fā)現(xiàn)對(duì)高血壓特別是腎性高血壓有確切的療效[11-12]，引起醫(yī)藥科技工作者的高度重視。通過對(duì)主要化學(xué)成分沒食子酸提取分離、分析與質(zhì)量控制方法研究，為桃金娘莖枝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及含桃金娘莖枝制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

[1]侯寬昭.廣州植物志[M].北京：科技出版社，1956：200-201.

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Isolation，Identification and Content Determination of Gallic Acid in Stem and Branch of Rhodomyrtus Tomentosa（Ait.）Hassk.

Huang Jingjian1，Chen Haiyan2， Luo Xia1，Wang Qindong1，Chen Lingbo1， Huang M inqi2（1 Guangxi Changhong Pharmaceutical Co.，Ltd.， GuangxiNanning 530221， China；2 Guangxi Health Vocational College， 530023）

Objective:To isolate and determine gallic acid in stem and branch ofRhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk..M ethods:Gallic acid was extracted by 80%ethanol， isolated and purified by column chromatography， and recrystallized from the stem and branch ofRhodomyrtus to mentosa（Ait.） Hassk..A HPLC method was set up to determine the content of gallic acid inRhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk.， using Lichrospher C18（4.6mm× 250mm，5μm）column， and methanol-0.2%-phosphoric acid water solution(1.5∶98.5)as themobile phase， the UV detection wavelength was at 270 nm，with the flow rate of 1.0 mL/min at room temperature.Results:A good linear was obtained in the range of 0.1~0.6μg and the average recovery was 100.6%（RSD=1.32%，n=6）.Conclusion:Themethod is simple with a good reproducibility for the determ ination of gallic acid inRhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk..

Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk.；Gallic Acid；Isolation；Identification；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.08.004

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（桂科自0640077）

黃景健，男，高級(jí)工程師。研究方向：中藥心腦血管新藥。E-mail：huangshan831@sohu.com陳海燕，女，講師。研究方向：中藥活性成分及制劑。通訊作者E-mail：chy1371@163.com

2011-12-31）