抑癌基因WWOX和FHIT在膀胱尿路上皮癌中的表達及其臨床意義

陜 光 夏 樾＊ 唐 甜

（1武漢大學人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科；2武漢大學人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科 武漢430060）

近年來發(fā)現的抑癌基因WW結構域（WWOX）和脆性組氨酸三聯體（FHIT）中各包含著一個最活躍、最不穩(wěn)定、易發(fā)生斷裂、重排和基因重組的常見脆 性 位 點 FRA16D 和 FRA3B［1－2］。 有 研 究 發(fā) 現WWOX／FRA16D和FHIT／FRA3B與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關，且二者減少在多種腫瘤中具有協同性［3］。

本文采用免疫組化和圖像分析方法檢測和分析了膀胱尿路上皮癌組織中WWOX和FHIT的表達以及二者的表達與膀胱尿路上皮癌臨床病理因素的關系，以期能進一步闡明膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學機理，尋找早期預測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學標記物，有望能為膀胱尿路上皮癌的診治提供新的靶點。

材料和方法

1.材 料

收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2006-2009年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經病理學證實為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50.3歲，另5例癌旁組織距瘤緣3-5cm。

1.1 標本均經 HE染色，光鏡觀察診斷，按WHO尿路腫瘤組織學分類（2004），浸潤性尿路上皮癌30例。非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌，高級別15例，低級別5例。按UICC臨床分期，T1 31例，T2 11例，T3-4 8例。其中未經化療的初發(fā)腫瘤28例，化療后復發(fā)腫瘤22例。

1.2 主要試劑

即用型兔抗人WWOX多克隆抗體；即用型兔抗人FHIT多克隆抗體；超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒；DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中杉生物技術有限公司）

2.方 法

2.1 HE染色

常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 免疫組織化學SP法檢測 WWOX和FHIT相關抗原

具體操作步驟：按說明書新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應時間（約3-5min），蘇木素復染，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為 WWOX和FHIT的陽性對照組。

2.3 免疫組織化學結果判斷

（1）WWOX和FHIT以細胞核或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應，陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。

（2）采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對 WWOX和FHIT的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應的總面積／單位面積中細胞的總面積×100%）

3.統(tǒng) 計學處理

對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗，檢驗水準α為0.05。

結 果

1.H E染色

非浸潤型尿路上皮癌：癌組織呈乳頭狀，移行上皮較厚，細胞層次較多，細胞核大小不一致，有些核較大染色較深，可見核分裂相，有些癌細胞可浸潤至固有層（圖1）。

浸潤性尿路上皮癌：癌細胞高度未分化，細胞大小、形態(tài)不一，排列紊亂。很少或無乳頭狀結構有的形成不規(guī)則的巢狀，有的分散。常有多數瘤巨細胞。多數核不規(guī)則，染色深，核分裂相較多。癌組織多浸潤到膀胱壁肌層（圖2）。

2.W WOX的表達

非浸潤型膀胱尿路上皮癌細胞內可見少量棕黃色顆粒，WWOX表達弱，呈陰性（圖3）；浸潤性尿路上皮癌細胞內可見少量棕黃色顆粒，WWOX表達弱，呈陰性（圖4）；癌旁組織胞核內可見較多的棕黃色顆粒，WWOX表達強，呈陽性（圖5）。圖像分析結果見表1。經q檢驗，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，WWOX的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05，表1）。

3.F HIT的表達

非浸潤型膀胱尿路上皮癌細胞中可見少量的棕黃色顆粒，FHIT表達弱（圖6）；浸潤性尿路上皮癌細胞內可見少量棕黃色顆粒，FHIT表達弱，呈陰性（圖7）癌旁組織中可見密集分布的棕黃色顆粒，FHIT呈陽性表達（圖8）。圖像分析結果見表2。經q檢驗，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，FHIT的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05，表2）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織WWOX表達的平均光密度和陽性面積率 （ˉx±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of WWOX in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue （ˉx±s）

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織FHIT表達的平均光密度和陽性面積率 （ˉx±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of FHIT in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue （ˉx±s）

討 論

膀胱尿路上皮癌是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤，在世界范圍內，每年大約有357 000例新發(fā)病例，同時，有大約145 000例患者死于膀胱癌［4－5］，目前發(fā)病率呈上升趨勢。這其中，大部分是膀胱尿路上皮癌。新發(fā)膀胱尿路上皮癌中75%的病例是表淺的腫瘤［6］。有資料顯示術后2年內有大約60-85%的病例復發(fā)，并且有約15-23%的復發(fā)腫瘤進展成為肌層浸潤的高分期腫瘤［7－8］。因此，研究與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機理，尋找早期預測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學標記物，為膀胱癌的發(fā)生和復發(fā)的預測提供一定的參考依據具有重要的臨床意義。

CFS家族包含常見基因如FHTI、WWOX、Parkin、GRDI2、DMD、CNTNAP2、LRPIB、CTNNA3等，其中脆性位點基因FHTI、WWOX、Parkin是三個最活躍的基因。FHTI基因是最早發(fā)現的脆性位點抑癌基因，它位于脆性位點FRA3B內，多種腫瘤細胞和腫瘤組織中發(fā)現其等位基因的缺失［9－12］。然后，許多腫瘤中發(fā)現Fhit蛋白表達缺失或減少。FHIT基因和WWOX基因作為較早確定且與脆性位點相聯系的抑癌基因，在抑癌基因家族中地位舉足輕重。大量文獻證實FHTI基因和WWOX基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，與腫瘤的預后密切相關［13－15］。

在多種腫瘤中，存在著FHIT表達缺失或降低，如肺癌、食管癌、消化道癌等，FHIT過表達能促進細胞凋亡［16－18］。研究還發(fā)現FHIT與引起癌癥發(fā)生的關鍵蛋白質如cyclinD1和src之間有著交互作用［19］。FHIT基因變異是癌或癌前病變的早期事件，在癌癥發(fā)生早期即存在著FHIT表達缺失或降低說明其有發(fā)生轉移的更大可能性。

我們采用免疫組織化學的方法，對膀胱尿路上皮癌組織中FHIT基因和WWOX基因的表達進行檢測，旨在探討它們與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關系。結果表明：FHIT基因和WWOX基因在膀胱尿路上皮癌中呈低表達，癌旁組織中呈高表達。提示：WWOX基因在膀胱尿路上皮癌中表達明顯缺失，是膀胱尿路上皮癌組織中的頻發(fā)事件，但在正常膀胱上皮組織中高表達。WWOX在膀胱移行細胞癌的早期發(fā)生及發(fā)展中有重要作用，并可能成為診斷膀胱尿路上皮癌的早期診斷指標。膀胱尿路上皮癌中FHTI基因失活的機制認為：基因組的穩(wěn)定性由高度保守的錯誤修復序列如hMSH2等維護，當這些序列發(fā)生突變時，將導致抑癌基因失活，腫瘤發(fā)生。

有研究表明，FHTI基因在細胞凋亡和細胞周期中發(fā)揮重要作用，在FHTI基因缺失的腫瘤細胞中導入FHTIDcNA使FHTI蛋白重新表達，可引起阻滯于S期和GO／G1期的細胞數增多，凋亡細胞數增多，致癌性下降。不同細胞系中轉染FHTI基因的研究表明FHTI基因可能啟動了不同于P53和Rb基因的凋亡途徑發(fā)揮了抑癌［20］作用。最近的研究表明，FHTI蛋白主要定位于細胞核及質膜，推測它可能作為信號分子發(fā)揮作用，但具體的作用通路尚不清楚。有關FHTI蛋白的功能及作用機制有待進一步研究。

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圖 版 說 明

圖1 非浸潤型尿路上皮癌：癌組織呈乳頭狀，移行上皮較厚，細胞層次較多，可見核分裂相。（HE×200）

圖2 浸潤性尿路上皮癌：癌細胞大小、形態(tài)不一，排列紊亂。很少或無乳頭狀結構，有的形成不規(guī)則的巢狀。多數核不規(guī)則，染色深，核分裂相較多。（HE×200）

圖3 WWOX的表達：非浸潤型尿路上皮癌 細胞核和胞漿內可見極少量的棕黃色顆粒，WWOX呈陰性表達。（S-P×200）

圖4 WWOX的表達：浸潤性尿路上皮癌 細胞內可見少量棕黃色顆粒，WWOX表達弱，呈陰性。（S-P×200）

圖5 WWOX的表達：癌旁組織 細胞核和胞漿內可見較多棕黃色顆粒，WWOX呈陽性表達 。（S-P×2000）

圖6 FHIT的表達：非浸潤型尿路上皮癌 細胞核和胞漿內可見極少量的棕黃色顆粒，FHIT呈陰性表達。（S-P×200）

圖7 FHIT的表達：浸潤性尿路上皮癌 細胞內可見少量棕黃色顆粒，FHIT表達弱，呈陰性。（S-P×200）

圖8 FHIT的表達：癌旁組織 細胞核和胞漿內可見較多棕黃色顆粒，FHIT呈陽性表達。（S-P×200）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Noninvasive type urothelial carcinoma：carcinoma tissues is a papillary，transitional epithelium is thicker and the cellular level is more，nuclear division is visible in Noninvasive type urothelial carcinoma.（HE ×200）

Fig.2Invasive urothelial carcinoma：cancer cell size、shape is differ and arranging is disorderly.papillary structure is Little or no，some form irregular nests.Most nuclear is irregular with darker，nuclear division is more than.（HE x 200）

Fig.3The expression of WWOX Noninvasive type urothelial

carcinoma：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed WWOX expressed negative.（S-P×200）

Fig.4The expression of WWOX invasive type urothelial carcinoma：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed WWOX expressed negative.（S-P×200）

Fig.5The expression of WWOX：cancer side tissue.There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed WWOX expressed positive.（SP×200）

Fig.6The expression of FHIT Noninvasive type urothelial carcinoma：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed FHIT expressed negative.（S-P×200）

Fig.7The expression of FHIT invasive type urothelial carcinoma：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed FHIT expressed negative.（S-P×200）

Fig.8The expression of FHIT：cancer side tissue.There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed FHIT expressed positive.（S-P×200）