兩種有胃魚消化道6種內(nèi)分泌細(xì)胞的免疫組織化學(xué)比較研究

金顯文 黃 山 吳孝兵

兩種有胃魚消化道6種內(nèi)分泌細(xì)胞的免疫組織化學(xué)比較研究

金顯文1黃 山2吳孝兵3＊

（1淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ；2淮北師范大學(xué)體育學(xué)院 安徽235000；3安徽師范大學(xué)生命科學(xué)院 蕪湖241000）

目的 應(yīng)用6種胃腸激素抗血清對胡子鯰（Clarias fuscas）和瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli Richardson）消化道內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行了免疫組織化學(xué)比較。方法 應(yīng)用鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法）免疫組織化學(xué)方法。結(jié)果 除胡子鯰后腸外，五羥色胺細(xì)胞在兩種魚的消化道各段均有分布，其中賁門部或幽門部密度最高，前中腸次之，食道最少；胡子鯰消化道中生長抑素細(xì)胞主要分布于胃賁門部和胃部，食管、胃幽門及腸道內(nèi)未見分布，而瓦氏黃顙主要分布于食管和胃部，腸道內(nèi)未見分布；胃泌素細(xì)胞在胡子鯰消化道內(nèi)只在腸內(nèi)檢測到，瓦氏黃顙只在幽門胃和前腸兩個部位檢測到；胰多肽細(xì)胞只在瓦氏黃顙的幽門胃和前腸兩個部位有分布；胰高血糖素和P-物質(zhì)兩種細(xì)胞在兩種魚的消化道各段均未見其分布。結(jié)論 兩種有胃魚消化道中六種內(nèi)分泌細(xì)胞的分布既有一定的共性，體現(xiàn)了兩者消化生理的共同點(diǎn)；同時又存在較大的種間差異，與各自食性及生活環(huán)境相適應(yīng)。

胡子鯰；瓦氏黃顙魚；消化道；內(nèi)分泌細(xì)胞；免疫組織化學(xué)

國內(nèi)外學(xué)者對魚類胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的鑒別和定位已作了大量的研究工作，在硬骨魚類胃腸中先后發(fā)現(xiàn)了15種免疫活性內(nèi)分泌細(xì)胞［1］，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對魚類胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行定位研究已有一些報道［2-20］，這些研究表明，魚類消化系統(tǒng)中免疫活性內(nèi)分泌細(xì)胞的種類和分布型非常復(fù)雜，充分顯示其在魚類消化道中分布的多樣性。胡子鯰（Clarias fuscas）和瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli Richardson）瓦氏黃顙魚同屬鯰形目（Siluriformes），其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價值極高，是極具市場潛力的養(yǎng)殖品種。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用6種抗哺乳動物血清對胡子鯰和黃顙魚胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位研究，旨在進(jìn)一步豐富魚類消化道比較內(nèi)分泌學(xué)資料，為其營養(yǎng)和消化生理以及人工飼料的科學(xué)配方研究提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1.材料

胡子鯰和瓦氏黃顙魚雌雄各5尾，2007年5月購自安徽省蕪湖吉合菜市場。置于清水中暫養(yǎng)24小時后迅速解剖，按下列消化道各段取材：食道、胃賁門部、胃體、胃幽門部、前腸、中腸和后腸。生理鹽水洗凈，用無冰醋酸的Bouin氏液固定18-24h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片5-6μm，貼片，370C溫箱烘干備用。

2.主要試劑

6種胃腸激素的兔抗血清詳見表1，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（Streptavidin peroxidase，SP）免疫組織化學(xué)試劑盒購于北京中杉生物技術(shù)公司。

3.免疫組織化學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)采用S-P（Streptavidin peroxidase）免疫組織化學(xué)法。常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2甲醇溶液孵育5min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸溜水浸洗，PBS浸泡5min，滴加正常山羊血清（1∶10）室溫孵育10min，封閉非特異性反應(yīng)部位。傾去血清，滴加一抗，4℃過夜。PBS浸洗3次×5min，滴加即用型生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG抗血清），室溫孵育15min，PBS浸洗3次×5min，滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育15分鐘。PBS浸洗3次×5分鐘，DAB-H2O2顯色，自來水洗凈，脫水，透明，封片。陰性對照分別用正常羊血清和PBS代替一抗，其余步驟同上。

表1 胃腸激素抗血清一覽表Table 1 Details of the gut hormone anisera

4.觀察與計數(shù)

在OlympusBX51系統(tǒng)顯微鏡下觀察，拍照，并對每個部位的切片隨機(jī)取10個400倍視野下計數(shù)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±SD）表示內(nèi)分泌細(xì)胞的分布密度，并對同一種內(nèi)分泌細(xì)胞在消化道不同部位的分布密度用Duncan多重比較的方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，同時又對消化道的不同部位的內(nèi)分泌細(xì)胞的分布密度用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行t檢驗(yàn)（用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件）。

結(jié) 果

光學(xué)顯微鏡下，兩種有胃魚消化道具有典型的四層結(jié)構(gòu)，免疫陽性細(xì)胞DAB-H2O2顯色呈深棕色，與淺藍(lán)或淡黃色背景容易區(qū)分。陰性對照切片均未見深棕色細(xì)胞。雌雄個體間內(nèi)分泌細(xì)胞種類及分布無差異，所有對照片均為陰性。6種胃腸激素抗血清在胡子鯰和黃顙魚消化道顯示的內(nèi)分泌細(xì)胞種類及分布密度見表2。

表2 胡子鯰和瓦氏黃顙魚消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的分布密度（個／400倍視野）Table 2 distribution and density of the endocrine cells in the digestive tract ofClarias fuscas and Pelteobagrus vachelli（unit／400times visiual field）

1.5 -HT-IR

結(jié)果表明，五羥色胺免疫活性細(xì)胞（5-hydroxytryptamine immunoreactive，5-HT-IR）在胡子鯰消化道各段除后腸外均有分布，以胃幽門部和中腸密度最高（P＜0.05），胃體、胃賁門部其次，前腸和中腸部較少，食道和前腸最少；在瓦氏黃顙魚消化道各段都有分布，以胃賁門部密度最高（P＜0.05），胃體、胃幽門部其次，前腸和中腸部較少，食道和直腸最少，分布差異顯著（P＜0.05）。食道和腸5-HT-IR細(xì)胞主要位于上皮細(xì)胞之間，細(xì)胞呈橢圓形、楔形或長梭形（圖1、2、4、5），有的細(xì)胞有較長的胞突伸向腸腔（圖3）。胃5-HT-IR細(xì)胞主要分布于胃腺部，在腺泡外圍或腺上皮之間，胃上皮中偶見（圖8、9）。細(xì)胞呈圓形、橢圓形或楔形，有的細(xì)胞有較長的胞突伸向鄰近細(xì)胞，胞突中可見囊狀膨大（圖6、7、10）。

2.SS-IR

生長抑素免疫活性細(xì)胞（synthetic cyclic somatostatin immunoreactive，SS-IR）胡子鯰消化道中只分布于賁門胃及胃體部分，分布密度差異均不顯著（P＞0.05），食管、幽門胃及腸道中未見；在瓦氏黃顙魚消化道中主要分布于食管和胃，幽門部最多，胃體部分最少，各段分布差異顯著（P＜0.05），腸道中未見。SS-IR細(xì)胞主要分布于胃粘膜上皮細(xì)胞之間，細(xì)胞多呈橢圓形或梭形（圖11、12），游離端也有突起伸向胃腔。

3.Gas-IR

胃泌素免疫細(xì)胞（gastrin immunoreactive，Gas-IR）分布在胡子鯰的腸道中，自前腸往后逐漸減少，各段分布差異顯著（P＜0.05）；瓦氏黃顙魚只少量地分布在幽門和前腸處，分布密度差異均不顯著（P＞0.05）。細(xì)胞主要位于上皮細(xì)胞與杯狀細(xì)胞之間，多呈細(xì)長形或不規(guī)則形，有的可見游離端有胞突伸向腸腔（圖13、14、15）。

4.PP-IR

胰多肽細(xì)胞（Pancreatic Polypeptide immunoreactive，PP-IR）只分布在瓦氏黃顙魚的胃幽門部和前腸，分布密度差異顯著（P＜0.05）。多數(shù)橢圓形，位于上皮基部或粘膜下層，少數(shù)呈蝌蚪狀且具有單個胞突；在胡子鯰消化道中則未見分布。

5.Glu-IR和SP-IR

胰高血糖素（Glu-IR）和P-物質(zhì)（SP-IR）二種免疫活性細(xì)胞兩種魚消化道各段均未檢出陽性細(xì)胞。

討 論

5-HT-IR細(xì)胞是存在于神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)和胃腸激素。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胃腸壁受到化學(xué)和物理剌激時，5-HT-IR細(xì)胞分泌5-HT釋放到胃腸腔，刺激和增進(jìn)胃腸的蠕動［14］。5-HT-IR細(xì)胞在魚類胃腸道的分布情況，有胃真骨魚和無胃真骨魚存在很大差別。5-HT-IR細(xì)胞在幾種無胃魚的腸道中均未發(fā)現(xiàn)［3，4］，而有胃魚的消化道雖均有分布，但分布特點(diǎn)各有不同。黑鯛（Sparus macrocephalus）［5］、花 鱸 （Lateolabrax japonicus）［6］分布在食管和胃中，腸道中未見分布，大彈涂魚（Periophthalmus cantonensis）在食管、賁門胃和后腸中有分布［7］，而黃鱔（Monopterus albus）僅在幽門部見到［8］。本試驗(yàn)中，除胡子鯰后腸外兩種有胃真胃魚消化道各段均有5-HT-IR細(xì)胞分布，這與黃鰭鯛（Sparus latus）［9］、日本鰻鱺 （Anguilla japonicus）［10］、鱖 魚 （Siniperca chuatsi）［11］、歐 洲 鰻 鱺（Anguilla anguilla L）［12］和 褐 牙 鲆 （Paralichthys olivaceus）［13］等種類相似，而且5-HT-IR細(xì)胞大都集中在有胃魚胃腸道幽門部，隨后分布密度逐漸降低，本實(shí)驗(yàn)也證明了這點(diǎn)，說明除了胃和前腸是消化食物的主要場所，在瓦氏黃顙魚和胡子鯰等有胃真骨魚消化道中，中腸仍有著重要的消化功能。胡子鯰和瓦氏黃顙魚同屬鯰形目，但前者消化道各段的平均密度比后者大，且后腸未見分布，這可能與胡子鯰貪食且喜食腐蝕質(zhì)食物有一定的關(guān)系。5-HT細(xì)胞有突起伸向鄰近細(xì)胞或腸腔，其可能通過旁分泌、外分泌的方式釋放而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。

SS-IR細(xì)胞在有胃魚類消化道的分布已有一些報道，但分布型亦有差別。黑鯛［5］、大彈涂魚［7］SSIR細(xì)胞僅存在食管和胃體的前部，幽門部和腸道中未見分布，這與本實(shí)驗(yàn)兩種有胃魚的分布相似，Rombout等人也曾做大量研究并認(rèn)為SS-IR細(xì)胞僅存在于有胃真骨魚類的胃中［15］。但日本鰻鱺、鱖魚、歐洲鰻鱺、鯔魚（Mugil cephalus L）整個胃腸道均有SS-IR細(xì)胞分布［10-12，16］。但在有胃魚鲇（Silurus asotus）、烏鱧（Channa argus）和大口黑鱸（Micropterus salmoides）的食管和胃各部消化道黏膜則均未見到SS-IR細(xì)胞［17］。SS的生理作用是當(dāng)胃pH值下降時，SS-IR細(xì)胞受刺激而釋放生長抑素，從而抑制G細(xì)胞釋放胃泌素，降低壁細(xì)胞的胃酸分泌等［14］。胡子鯰和瓦氏黃顙魚消化道SS-IR細(xì)胞的分布特點(diǎn)，對胃腸道激素分泌和抑制活動達(dá)到動態(tài)平衡起重要的調(diào)節(jié)作用。

Gas-IR細(xì)胞在魚類消化道分布的研究報道較多。幾種鯉科魚類的腸道中，Gas-IR細(xì)胞大多位于前 腸 前 段［4，18，19］；在 有 胃 魚 鱖 魚、大 口 黑 鱸 （Micropterus salmoides）、尼羅非鯽（Oreochromisniloticus）和短蓋巨脂鯉（Colossoma brachypomum）胃腸道中均未發(fā)現(xiàn) Gas-IR 細(xì)胞［11，17，20］，而日本鰻鱺、歐洲鰻鱺、鯔魚、烏鱧的胃腸道均有Gas細(xì)胞分布［10，12，16，17］。在本 實(shí) 驗(yàn) 中 胡 子 鯰 胃 腸 道 中 Gas-IR細(xì)胞分布僅在腸道中出現(xiàn)而瓦氏黃顙魚僅分布在幽門和前腸中，Gas細(xì)胞可能感受腸腔內(nèi)容物的刺激而產(chǎn)生外分泌作用。

PP-IR細(xì)胞在胡子鯰消化道各段均未檢出陽性細(xì)胞，這與黑鯛、歐洲鰻鱺和花鱸胃腸道的情況相同［5，6，12］，瓦氏黃顙魚與黑鯛、花鱸相同分布在前腸和中腸中［5，6］，可能與這些魚的胃容量小有關(guān)，通過內(nèi)分泌活動來促進(jìn)胃排空以增加進(jìn)食頻率有關(guān)。但在大彈涂魚［7］及黃鰭鯛［9］的幽門部、前腸及中腸中有PP-IR細(xì)胞的分布。

本實(shí)驗(yàn)中的兩種有胃魚胃腸道中Glu-IR、SPER細(xì)胞未檢出陽性細(xì)胞，這與黃鱔［8］、日本鰻鱺［10］、鱖魚［11］以及歐洲鰻鱺［12］一致。

綜上所述，胡子鯰和瓦氏黃顙魚胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的分布既存在一定的共同點(diǎn)，體現(xiàn)了兩種魚消化生理的某些共同之處，同時由于棲息環(huán)境、食性等方面的適應(yīng)性差異，消化道內(nèi)分泌細(xì)胞在動物消化道中的存在與分布有很大的種的特異性。

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圖 版 說 明

圖1 食道圓形5-羥色胺細(xì)胞×400

圖2 前腸橢圓形的5-羥色胺細(xì)胞×400

圖3 前腸中有長胞突伸向消化腔的長梭形的5-羥色胺細(xì)胞×400

圖4 中腸中橢圓形5-羥色胺細(xì)胞×400

圖5 中腸中楔形5-羥色胺細(xì)胞×400

圖6 胃賁門中長胞突伸入消化腔的梭形5-HT-IR細(xì)胞×400

圖7 胃體中梭形的5-HT-IR細(xì)胞×400

圖8 胃體部腺泡上皮中橢圓形的5-HT-IR細(xì)胞×400

圖9 幽門部腺泡上皮中楔形的5-HT-IR細(xì)胞×400

圖10 胃幽門部圓形五羥色胺細(xì)胞×400

圖11 胃賁中梭形的SS-IR細(xì)胞×400

圖12 胃體中橢圓形SS-IR細(xì)胞×400

圖13 中腸中橢圓形的Gas-IR細(xì)胞×400

圖14 前腸中橢圓形的Gas-IR細(xì)胞×400

圖15 后腸中不規(guī)則的Gas-IR細(xì)胞×400

Ep：上皮；L：消化道腔；LP：固有膜；SG：胃腺

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Round 5-HT immunoreactive cells in the oesophagus×400

Fig.2 oval 5-HT immunoreactive cells in the foregut.×400

Fig.3 long shuttle shape 5-HT immunoreactive cells in the foregut，the long cytoplasmic process extending to its lumen of the digestive tract×400

Fig.4 oval 5-HT immunoreactive cells in the midgut.×400

Fig.5 The wedge-shaped 5-HT immunoreactive cells in the midgut×400

Fig.6 shuttle shape5-HT immunoreactive cells in the stomachus cardiacus，the long cytoplasmic process extending to its lumen of the digestive tract×400

Fig.7 oval 5-HT immunoreactive cells in the stomachus corpus×400

Fig.8 oval 5-HT immunoreactive cells in the epithelial acinar of stomachus corpus×400

Fig.9 The wedge-shaped 5-HT immunoreactive cells in the epithelial acinar of stomachus pyloricus×400

Fig.1 0 round 5-HT immunoreactive cells in the stomachus pyloricus×400

Fig.1 1 shuttle shape SS immunoreactive cells in the stomachus cardiacus×400

Fig.1 2 oval SS immunoreactive cells in the stomachus corpus×400

Fig.1 3 oval Gas immunoreactive cells in the midgut×400

Fig.1 4 oval Gas immunoreactive cells in the foregut×400

Fig.1 5 irregular Gas immunoreactive cells in the hindgut×400

Ep：epithelium；L：the lumen of the digestive tract；LP：lamina porpria；SG：stomach gland

Comparative Immunohistodhemical Study of Six Kinds of Endocrine Cells in the Digestive Tract of Two Species of Stomach-containing Teleosts

Jin Xianwen1，Huang Shan2，Wu Xiaobing3＊
（1College of Life Science，Huaibei Normal University；2College of Physical Education，Huaibei Normal University，Anhui 235000；3College of Life Science，Auhui Normal University，Wuhu 241000，China）

ObjectiveComparative study immunohistochemical staining of endocrine cells in the gastrointestinal tract of Clarias fuscas and Pelteobagrus vachelli were studied with six gut hormone antisera.MethodsThe streptavidin biotin-peroxidase complex （SABC） method was used.ResultsThe 5-hydroxytryptamine immunoreactive cells were distributed throughout the digestive tract except the hindgut of the Clarias fuscas.The distribution density was the highest in the cardiacus or pyloricus，Then the foredgut and hindgut，and the lowest in the oesophagus.The somatostatin immunoreactive cells were distributed only in the stomachus cardiacus and the body of stomach，but not in the oesophagus，stomachus pyloricus and intestine of Clarias fuscas.But the SS-IR cells were distributed only in the oesophagus and the stomach of Pelteobagrus vachelli.The Gas-IR cells were observed only in the intestine of Clarias fuscas and stomachus pyloricus and foregut of Pelteobagrus vachelli.The PP-IR cells were observed only in the stomachus pyloricus and foregut of Pelteobagrus vachelli.The SP-IR and Glu-IR cells were not found in the digestive tract of two species of stomach-containing teleosts.ConclusionComparing with two species of stomach-containing teleosts，we found some common features in the distribution of 6kinds of endocrine cells in the gastrointestinal tract，which reflect their similarity in digestive physiology.However，the difference is also significant，Which may be related to their feed habit and habitation.

Clarias fuscas；Pelteobagrus vachelli Richardson；Digestive tract；Endocrine cells；Immunohistochemistry

Q954

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.019

2011-08-15

2011-10-10

金顯文，男（1970年），漢族，副教授。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）