TGFβ1及其受體在大鼠整胚及軟骨雛形發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

郭 瓊 姜孝芳 陳 艷 王 磊

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院：1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2科研中心，3生化教研室，烏魯木齊830001；4新疆烏魯木齊兵團(tuán)醫(yī)院創(chuàng)傷科 烏魯木齊830002）

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorbeta，TGFβ1）是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 TGFβs家族中最具代表性的一個(gè)，它廣泛存在于從線蟲(chóng)到哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞內(nèi)，參與了諸多不同類型細(xì)胞的生命活動(dòng)，同時(shí)在妊娠中也具有調(diào)節(jié)功能，因而在胚胎生長(zhǎng)、器官發(fā)育，尤其在以軟骨及骨組織的發(fā)育中表現(xiàn)出了更為突出的作用［1，2］。TGFβs家族成員均為分泌型的多肽信號(hào)分子，TGFβ1必須與其特異性I、II型受體（transforming growth factorβtype I、II receptor，TβRI、TβRII）形成四聚體復(fù)合物，經(jīng)受體將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。以往對(duì)TGFβ1及TβRI、TβRII在胚胎發(fā)育正常過(guò)程中所起的作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用半定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色方法觀察TGFβ1及TβRⅠ、TβRⅡ在大鼠整胚不同時(shí)段及軟骨雛形發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，以期更進(jìn)一步了解上述因子與組織器官發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為胚胎及胚胎時(shí)期軟骨雛形的發(fā)育規(guī)律提供一些參考。

材料和方法

1.材 料

健康雌、雄性SD大鼠各50只（雌性240-260g，雄性260-280g，均為8-10月齡，由華西動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供）。動(dòng)情期，雌雄于晚1：1合籠，次晨檢查陰栓，有陰栓者記為第0d胚胎。孕鼠斷頸處死，迅速打開(kāi)腹腔取出子宮，置于冰冷的9g／L生理鹽水內(nèi)解剖出胚胎，剝離羊膜和胚外膜。共收集13～17d胎齡胚胎40只（大鼠孕19-21d生產(chǎn)，13-17d是胚胎迅速生長(zhǎng)發(fā)育階段），每日8只。

2.方 法

2.1 半定量RT-PCR①引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)NCBI GeneBank中大鼠目的基因序列行引物設(shè)計(jì)βactin上游引物：5′-ccgtaaagacctctgccaac-3′，下游引物：5′-actcatcgtactcctgcttgct-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物 227bp；TGFβ1上游引物：5′-accgacccttcctgctcctcat-3′，下游引物：5′-ggagcgcacgatcatgttgga-3′，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 398 bp；TβRⅠ上游引物：5′-ccgagaggcagagatatcag-3′，下游引物：5′-ggggccatataccttttagtgc-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物414 bp；TβRⅡ 上游引物：5′-cccaggggccggtctatga-3′，下游引 物：5′-cggtggacacgaacagtagaaga-3′，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物615bp。引物交由大連寶生物公司合成。②總RNA的提取及cDNA的合成 快速取出整胚，用液氮研磨至粉末狀，立即放入Trizol（Invitrogen公司）中進(jìn)行抽提。用Eppendorf核酸蛋白定量分析儀測(cè)定RNA濃度和A260／280值，判斷其質(zhì)量，分裝于液氮中保存。cDNA的合成按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（MBI公司Fermentas試劑盒）。③PCR過(guò)程 樣本cDNA 2μL，β-actin上下游引物各1μL（106mol／L），待擴(kuò)增目的片段的引物上下游各1μL（106mol／L），2×Taq PCR MasterMix 25μL（天為時(shí)代）用ddH2O將體積補(bǔ)至50μL。預(yù)變性94℃4min，變性94℃40s，退火48℃45s，延伸72℃40s，共28個(gè)循環(huán)，再延伸72℃10min。

2.2 免疫組化SABC染色 抗體及SABC染色相關(guān)試劑購(gòu)自武漢博士德公司。

40g／L多聚甲醛固定胚胎，制作3-5μm厚連續(xù)石蠟切片，常規(guī)脫蠟，水化。30mL／L H2O2處理10min，PBS洗滌；92-98℃，EDTA液行微波抗原修復(fù)10min；室溫下50g／L BSA封閉40min，直接滴加稀釋的一抗（兔多抗TGFβ1、TβRⅠ、TβRⅡ，稀釋濃度均為1：100），4℃濕盒過(guò)夜后PBS洗滌；滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫下孵育40min，PBS洗滌；滴加SABC，室溫下孵育40min，PBS洗滌；DAB顯色，鏡下控制顯色強(qiáng)度，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)及其半定量分析軟Quantity-One，分析各泳道中不同天數(shù)目的條帶與相對(duì)應(yīng)β-actin條帶的密度比值（表示該因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量），將數(shù)據(jù)輸入SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用單因素方差法分析TGFβ1，TβRⅠ，TβR II在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量的差異。均數(shù)的兩兩比較用q檢驗(yàn)（SNK法）。

結(jié) 果

1.半 定量RT-PCR

1.1 瓊脂糖凝膠電泳 以DNA Marker DL 2000（TaKaRa）為標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增產(chǎn)物及內(nèi)參大小正確（圖1）。

圖1 大鼠13-17d全胚中TGFβ1 及TβRⅠ、TβRⅡ的半定量RT-PCR電泳圖。A：擴(kuò)增TGFβ1，長(zhǎng)度398bp；B：擴(kuò)增TβRⅠ，長(zhǎng)度414bp；C：擴(kuò)增TβRⅡ，長(zhǎng)度615bp。擴(kuò)增內(nèi)參β-actin，長(zhǎng)度227bp。1泳道：13d胚胎；2泳道：14d胚胎；3泳道：15d胚胎；4泳道：16d胚胎；5泳道：17d胚胎。Fig1Agarose gel electrophoresis of half-quantity RT-PCR figures of TGFβ1and TβRⅠ，TβRⅡin the 13th-17th days of rat entire embryo A：TGFβ1398bp；B：TβRⅠ 414bp；C：TβRⅡ 615bp.β-actin 227bp.1：13d；2：14d；3：15d；4：16d；5：17d.

1.2 半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)所得灰度值，采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件制圖（圖2），結(jié)合方差分析可以看出，TGFβ1在13-16d中表達(dá)是逐漸增加的，其中15、16d是高峰，17d明顯下降；TGFβRⅠ在14、15 d之間的表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05）但在該發(fā)育階段表達(dá)總趨勢(shì)為遞增，其中17d是高峰；TGFβⅡ在13、14d之間，14、15、16d之間的表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05）但在該階段總體趨勢(shì)仍為遞增，其中17d為高峰。

圖2 大鼠13-17d全胚中 TGFβ1 及 TβRⅠ、TβRⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)圖Fig.2The tendency of relative mRNA expressions of TGFβ1，TβRⅠand TβRⅡin the 13th-17th days of rat entire embryo

2.組 織學(xué)及免疫組織化學(xué)結(jié)果觀察

2.1 組織學(xué)觀察 軟骨雛形是形成骨和軟骨的前體結(jié)構(gòu)，本次觀察選擇椎骨和肋骨發(fā)育初始階段的軟骨雛形進(jìn)行觀察。從13d開(kāi)始至17d，可見(jiàn)在要形成軟骨雛形的部位間充質(zhì)細(xì)胞密度增加，使得細(xì)胞密集成團(tuán)，團(tuán)塊內(nèi)細(xì)胞較為幼稚，核染色較深，即為軟骨骨祖細(xì)胞。隨時(shí)間推移，該細(xì)胞不斷分裂增殖，細(xì)胞體積變大為球形或不規(guī)則形、細(xì)胞繼續(xù)聚集，形成軟骨雛形中心。該區(qū)域內(nèi)，靠外周的細(xì)胞較為幼稚，中心區(qū)域細(xì)胞較為成熟。隨著中心內(nèi)幼稚軟骨細(xì)胞不斷成熟，其產(chǎn)生基質(zhì)的能力也不斷增強(qiáng)，故軟骨雛形內(nèi)細(xì)胞相對(duì)會(huì)變得稀疏，而軟骨雛形體積會(huì)增大。17d時(shí)明顯可見(jiàn)團(tuán)塊中心相對(duì)成熟的軟骨細(xì)胞位于各自的陷窩內(nèi)，而胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)類似空泡狀脂滴，有時(shí)可見(jiàn)2-3個(gè)細(xì)胞聚集形成群。在發(fā)育過(guò)程中始終可見(jiàn)在軟骨雛形形成中心周圍有由間充質(zhì)形成的數(shù)層扁平或梭形細(xì)胞，此即為以后形成的外膜（圖3-5）。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 陽(yáng)性反應(yīng)物為棕色或黃色顆粒，分布在胞質(zhì)和胞膜，對(duì)照組全部陰性。

①TGFβ1表達(dá)結(jié)果 13d時(shí)，在軟骨雛形形成區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞中未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)顆粒，軟骨雛形之間的細(xì)胞數(shù)量稀疏，也無(wú)陽(yáng)性表達(dá)顆粒。14d細(xì)胞成團(tuán)的趨勢(shì)明顯，團(tuán)塊內(nèi)與13d的表達(dá)情況類似，但在團(tuán)塊外周邊緣處的細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在陽(yáng)性表達(dá)顆粒（圖A）。15d時(shí)，在形成軟骨雛形的部位有明顯的細(xì)胞團(tuán)，其內(nèi)細(xì)胞排列疏散；越靠近中心，細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)顆粒越明顯，同時(shí)可見(jiàn)胞內(nèi)空泡狀的脂滴。而外周膜中的細(xì)胞有微弱陽(yáng)性表達(dá)顆粒。軟骨雛形之間細(xì)胞密集，無(wú)陽(yáng)性表達(dá)顆粒（圖B）。17d時(shí)，可見(jiàn)界限清晰的雛形橫切面，外周細(xì)胞相對(duì)增多，形成明顯膜，其陽(yáng)性表達(dá)不明顯；中心內(nèi)肥大的軟骨骨祖細(xì)胞進(jìn)一步成熟，陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，數(shù)個(gè)細(xì)胞有聚集傾向。雛形之間的結(jié)締組織，細(xì)胞數(shù)量有所減少，其內(nèi)的絲狀纖維中出現(xiàn)微弱陽(yáng)性表達(dá)顆粒（圖C）。

②TβRⅠ表達(dá)結(jié)果 13d時(shí)，在軟骨雛形形成區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)散在深棕黃色顆粒。14d，軟骨雛形內(nèi)細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)較13d增多，在外周膜中細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)散在的棕黃色顆粒，軟骨雛形之間的結(jié)締組織內(nèi)也出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)顆粒（圖D）。15d時(shí)，可見(jiàn)處于不同發(fā)育階段的軟骨雛形。在發(fā)育相對(duì)成熟的軟骨雛形內(nèi)，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度較幼稚軟骨雛形高，但細(xì)胞密度較低（圖E）。16d-17d，隨著軟骨雛形的進(jìn)一步發(fā)育，其內(nèi)部細(xì)胞和外周膜中的陽(yáng)性表達(dá)趨勢(shì)也隨之增加；而軟骨雛形之間結(jié)締組織內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)增加不如軟骨雛形內(nèi)細(xì)胞明顯（圖F）。

③TβRⅡ表達(dá)結(jié)果 13d時(shí)，整個(gè)軟骨雛形中心及周圍均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。到14d，在軟骨雛形中心的一些細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)顆粒，但表達(dá)數(shù)量不多；軟骨雛形之間的間充質(zhì)組織內(nèi)則出現(xiàn)廣泛的弱陽(yáng)性表達(dá)顆粒（圖G）。從15d開(kāi)始到16d，可見(jiàn)軟骨雛形內(nèi)的軟骨骨祖細(xì)胞中，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度迅速增高，外周膜中細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)顆粒，而周圍間充質(zhì)形成的結(jié)締組織中陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)趨勢(shì)不明顯（圖H）。17d在軟骨雛形區(qū)域內(nèi)形成軟骨，明顯見(jiàn)到幼稚軟骨細(xì)胞過(guò)渡為成熟軟骨細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)程度無(wú)明顯變化，但細(xì)胞形態(tài)則由小的扁梭形變?yōu)榇蟮膱A形或橢圓形，軟骨陷窩明顯，有時(shí)可見(jiàn)脂滴（圖I）。

圖3 大鼠胚胎軟骨雛形中TGFβ1陽(yáng)性表達(dá)（標(biāo)尺＝220μm）A圖：14d胚胎；B圖：15d胚胎；C圖：17d胚胎。sc：脊髓；bv：血管；efc：軟骨雛形；pc：軟骨膜；cc：肋軟骨；mt：間充質(zhì)組織圖4大鼠胚胎軟骨雛形中TβRⅠ陽(yáng)性表達(dá)（標(biāo)尺A、B＝220μm；C＝100μm）A圖：14d胚胎；B圖：15d胚胎；C圖：16d胚胎。bv：血管；e：表皮；mt：間充質(zhì)組織；sc：脊髓efc：軟骨雛形圖5大鼠胚胎軟骨雛形中TβRⅡ陽(yáng)性表達(dá)（標(biāo)尺A、B＝220μm；C＝439μm）A圖：14d胚胎；B圖：16d胚胎；B圖：17d胚胎。bv：血管；mt：間充質(zhì)組織；efc：軟骨雛形；sc：脊髓；pc：軟骨膜；cc：肋軟骨Fig 3TGFβ1positive expressions in embryonicform of cartilage（bar＝220μm）A：14d；B：15d；C：17d.sc：spinal cord；bv：blood vessel；efc：embryonic form of cartilage；pc：perichondrium；cc：costal cartilage；mt：mesenchymal tissueFig 4TβRⅠ positive expressions in embryonicform of cartilage（barA、B＝220μm；C＝100μm）A：14d；B：15d；C：16d.bv：blood vessel；e：epidermis；mt：mesenchymal tissue；sc：spinal cord；efc：embryonic form of cartilageFig 5TβRⅡ positive expressions in embryonic form of cartilage（barA、B＝220μm；C＝439μm）A：14d；B：16d；B：17d.bv：blood vessel；mt：mesenchymal tissue；efc：embryonic form of cartilage；sc：spinal cord；pc：perichondrium；cc：costal cartilage

討 論

TGFβ1及其TβRⅠ、TβRⅡ在哺乳動(dòng)物胚胎及器官形成中起著重要作用，但在某一階段連續(xù)觀察上述3個(gè)因子的報(bào)道甚少。本研究中我們用半定量RT－PCR方法檢測(cè)13-17dSD胎鼠TGFβ1及其TβRⅠ、TβRⅡ基因表達(dá)變化情況發(fā)現(xiàn)，它們?cè)?3-17d中均有表達(dá)。13-16d3個(gè)因子表現(xiàn)出不同程度的遞增趨勢(shì)，TGFβ1遞增幅度最大，TβRⅠ次之，TβRⅡ較低。17d開(kāi)始TβRⅠ與TβRⅡ依然遞增，只是TβRⅡ幅度較之TβRⅠ更大，而TGFβ1則轉(zhuǎn)為下降趨勢(shì)。該現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因是：①TGFβ1多表達(dá)在胚胎早期、損傷或疾病的組織器官內(nèi)；②胚胎通過(guò)自分泌或旁分泌的機(jī)制，使TGFβ1在胚胎發(fā)育早中期自我表達(dá)的同時(shí)，上調(diào)TβRⅠ和TβRⅡ表達(dá)；③發(fā)育晚期，細(xì)胞的TβRⅠ和TβRⅡ有可能隨特定組織器官細(xì)胞數(shù)目的增多而增加［3］。本實(shí)驗(yàn)中我們用半定量RT-PCR觀察SD大鼠胚胎中TGFβ1及TβRⅠ、TβRⅡ的整體水平變化特點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)與以往的報(bào)道有所不同，即TβRⅡ與TGFβ1的表達(dá)量不成正比關(guān)系。可能因?yàn)橐酝芯慷嘟⒂谀[瘤、炎癥、外傷等疾病模型之上進(jìn)行，而此次實(shí)驗(yàn)完全是在一個(gè)正常的生理前提下實(shí)施。Forbes K等［4］用免疫組織化學(xué)檢測(cè)人胚胎中上述三個(gè)因子的表達(dá)情況，結(jié)果出現(xiàn)與本次實(shí)驗(yàn)相類似的趨勢(shì)，只是在表達(dá)時(shí)間上比本次實(shí)驗(yàn)的時(shí)間有所提前，其原因可能是物種不同所致。

軟骨是機(jī)體胚胎時(shí)期的主要支架，隨著胚胎發(fā)育，成體后除了殘留的部分軟骨外，絕大多數(shù)都被骨取代。哺乳動(dòng)物胚胎時(shí)期的軟骨來(lái)源于軟骨雛形，雛形則來(lái)源于間充質(zhì)，在軟骨雛形的基礎(chǔ)上，軟骨以軟骨內(nèi)生長(zhǎng)（間質(zhì)性生長(zhǎng)）或軟骨膜下生長(zhǎng)（附加性生長(zhǎng)）進(jìn)行擴(kuò)展，最終形成與機(jī)體需要所一致的結(jié)構(gòu)：骨或者軟骨。本次實(shí)驗(yàn)中觀察到，在以后形成椎骨或者肋軟骨的部位，軟骨雛形是以軟骨內(nèi)生長(zhǎng)為主。同時(shí)免疫組織化學(xué)染色顯示：14-17d中，軟骨雛形內(nèi)細(xì)胞中的TGFβ1表達(dá)是隨胎齡的增加而增加，但雛形中心外膜上表達(dá)一直為陰性；TβRⅠ在表達(dá)上與TGFβ1趨近一致，但外膜上的陽(yáng)性表達(dá)較早，且隨胎齡增加而增強(qiáng)；TβRⅡ的表達(dá)與TβRⅠ則趨近一致。3個(gè)因子在軟骨雛形之間的間充質(zhì)內(nèi)表達(dá)均隨時(shí)間增強(qiáng)，其中TGFβ1的表達(dá)及增強(qiáng)強(qiáng)度最弱，TβRⅡ次之，TβRⅠ最強(qiáng)?？傊甌GFβ1及其Ⅰ、Ⅱ受體介導(dǎo)的信號(hào)對(duì)胚胎和軟骨雛形細(xì)胞的分化、增殖和成熟以及周圍基質(zhì)的合成可能具有重要的調(diào)控作用。該信號(hào)抑制雛形中細(xì)胞的肥大性分化及增殖，同時(shí)又可刺激諸多受體后分子磷酸化，并調(diào)控核內(nèi)各種靶基因的表達(dá)［5，6］。本次實(shí)驗(yàn)觀察 TGFβ1及其受體在信號(hào)傳導(dǎo)初始階段表達(dá)變化情況，試圖為將來(lái)的基因治療和組織工程技術(shù)提供一些基礎(chǔ)性的研究依據(jù)。綜上，TGFβ1與TβRⅠ、TβRⅡ隨著大鼠胚胎時(shí)期軟骨雛形的發(fā)育，不同部位階段有著不同時(shí)相性的表達(dá)規(guī)律。如何解釋這一現(xiàn)象？是否可以推測(cè)它們?cè)谲浌请r形發(fā)育特殊時(shí)期普遍存在某些分泌模式，還是用發(fā)現(xiàn)存在于不同種屬內(nèi)的TGFβ1與TβRⅠ、TβRⅡ具有相互獨(dú)立的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)解釋？

TGFβ1作為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的多功能細(xì)胞因子，在受體數(shù)量增多或減少的同時(shí)都可引發(fā)后續(xù)不同信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活或抑制［7］。結(jié)合半定量RT-PCR與免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個(gè)因子在全胚中的變化與在軟骨雛形中的變化不一致，因?yàn)門GFβ1主要分布于中胚層來(lái)源的組織細(xì)胞，具有促進(jìn)和抑制生長(zhǎng)的雙重作用，何種作用占優(yōu)勢(shì)取決于細(xì)胞類型、TGFβs信號(hào)通路部件濃度以及與TGFβs信號(hào)途徑相互作用的其它信號(hào)途徑［8，9］。在起源不同的組織結(jié)構(gòu)中，TGFβ1和它的受體執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能。當(dāng)然TGFβ1作用的發(fā)揮一方面依賴于分泌水平的高低，另一方面受體的表達(dá)及分布對(duì)其功能的發(fā)揮也起著重要的調(diào)節(jié)作用。

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