CyclinE和cdk2在眼瞼基底細胞癌組織中的表達及其意義

陳志雄 黃 瓊

（1武漢大學(xué)人民醫(yī)院老年病科； 2武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科 武漢430060）

眼瞼基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC）是眼瞼惡性腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，約占眼瞼惡性上皮性腫瘤的85%-95%。眼瞼基底細胞癌是生長緩慢的腫瘤，病程一般較長，最長可達20年。雖然其發(fā)病緩慢，惡性程度和轉(zhuǎn)移性較低，但發(fā)病人數(shù)的逐年增多，已引起人們高度重視［1］。

近年來，隨著細胞周期的分子調(diào)控機制研究的深入及闡明，細胞周期紊亂在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用受到人們重視［2］。細胞周期蛋白E（cyclinE）和細胞周期蛋白依賴性激酶2（cdk2）是細胞周期中G1期和S期重要調(diào)節(jié)因子［3］，但目前兩者與眼瞼基底細胞癌之間的關(guān)系尚不清楚。

采用免疫組織化學(xué)方法研究CyclinE和cdk2在眼瞼基底細胞癌組織中的表達，探討CyclinE和cdk2在BCC發(fā)生、發(fā)展機制中的作用，為治療基底細胞癌提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.材 料

1.1 標本來源

收集武漢市中心醫(yī)院和武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2002-2009年手術(shù)切除及活檢的眼瞼基底細胞癌（basalcell carcinoma，BCC）標本共20例，另取癌周圍正常組織5例作對照。基底細胞癌發(fā)病年齡20-68歲。所有標本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)HE染色，光鏡觀察，病理檢查確診。

1.2 主要試劑

1.2.1 濃縮型兔抗人CyclinE多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）

1.2.2 濃縮型兔抗人cdk2多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）

1.2.3 超敏即用型S-P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新生物有限公司）

1.2.4 顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中山生物技術(shù)有限公司）

1.3 主要儀器

YWY781型醫(yī)用微波儀，250W，50Hz，浙江臨安電子器材廠生產(chǎn)；家用高壓鍋。

2.方 法

2.1 常規(guī)HE染色

取材、固定、脫水、透明、切片和HE染色。

2.2 免疫組織化學(xué)S-P法檢測CyclinE和cdk2抗原

主要步驟：組織切片5μm，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗；3%過氧化氫，37℃孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗4×5min；p53采用微波抗原修復(fù)（3檔，10min），PBS洗4×5min；正常羊血清37℃孵育10 min以減少非特異性反應(yīng)；一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；生物素標記的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶復(fù)合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

3.免 疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

3.1 CyclinE和cdk2抗原以胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照除細胞核染成藍色外，胞核和胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。

3.2 采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對CyclinE和cdk2的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細胞的總面積×100%）

4.統(tǒng) 計學(xué)處理

對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和SNK－q檢驗，檢驗水準α為0.05。對眼瞼基底細胞癌及癌旁組織的CyclinE和cdk2表達的陽性面積率作雙變量相關(guān)分析，檢驗水準α為0.05。

結(jié) 果

1.CyclinE的表達

基底細胞癌組織中可見癌細胞胞漿內(nèi)有密集分布的棕黃色顆粒，CyclinE表達強（圖1）；癌旁組織的細胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，CyclinE表達弱（圖2）。圖像分析結(jié)果經(jīng)q檢驗，眼瞼基底細胞癌與癌旁組織之間，CyclinE的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05﹚見表1。

表1 基底細胞癌與癌旁組織CyclinE表達的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of CyclinE in eyelid basal cell carcinoma and cancer side tissue（ˉx±s）

圖1 CyclinE的表達 基底細胞癌組織中可見癌細胞胞漿內(nèi)有密集分布的棕黃色顆粒，CyclinE表達強（SP×200）；圖2 CyclinE的表達 癌旁組織的細胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，CyclinE表達弱（SP×200）；圖3 cdk2的表達 基底細胞癌組織中可見癌細胞胞漿內(nèi)有密集分布的棕黃色顆粒，cdk2表達強（SP×200）；圖4 cdk2的表達 癌旁組織的細胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，cdk2表達弱（SP×200）。Fig.1The expression of CyclinE in eyelid basal cell carcinoma .There were plenty of brown particles in the cytoplasm，which showed CyclinE expressed strongly.S-P×200Fig.2The expression of CyclinE in cancer side tissue.There were few brown particles in the cytoplasm ，which showed CyclinE expressed weakly.S-P×200Fig.3The expression of cdk2in eyelid basal cell carcinoma.There were plenty of brown particles in the cytoplasm，which showed cdk2expressed strongly.S-P×200Fig.4The expression of cdk2in cancer side tissue.There were few brown particles in the cytoplasm ，which showed cdk2 expressed weakly.S-P×200

2.cdk2的表達

基底細胞癌組織中可見癌細胞胞漿內(nèi)有密集分布的棕黃色顆粒，cdk2表達強（圖3）；癌旁組織的細胞胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，cdk2表達弱（圖4）。圖像分析結(jié)果經(jīng)q檢驗，眼瞼基底細胞癌與癌旁組織之間，cdk2的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05﹚見表2。

表2 基底細胞癌與癌旁組織cdk2表達的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of CyclinE in eyelid basal cell carcinoma and cancer side tissue（ˉx±s）

討 論

基底細胞癌是眼瞼最常見惡性腫瘤，約占眼瞼惡性上皮性腫瘤的85%-95%。通常發(fā)生于暴露日光的皮膚上，男性略多，眼瞼基底細胞癌是生長緩慢且無疼痛的腫瘤，病程一般較長，最長可達20年。BCC（basal cell carcinoma）一般只局部侵襲，很少轉(zhuǎn)移，但若不及時治療，腫瘤可侵及眼輪匝肌、瞼板和眶骨，并可經(jīng)眼眶向顱內(nèi)侵犯［4－5］。近年來隨著人口的高齡化，眼瞼基底細胞癌有逐漸增多的趨勢［6－7］。如能從分子水平更快更準確地對BBC進行早期診斷，則能最大限度的提高患者的生產(chǎn)率。

細胞周期是細胞物質(zhì)積累和細胞分裂的循環(huán)過程，其有序進行受到嚴密的調(diào)節(jié)和控制。細胞周期的調(diào)控主要依賴于由各種細胞周期蛋白（cyclin）和相應(yīng)的細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent-kinase，CDK）組成的蛋白激酶復(fù)合物來完成，其中CyclinE-CDK2在G1／S期的轉(zhuǎn)折中起著重要作用［8－9］。

近年來，隨著細胞周期調(diào)控機制的闡明，細胞周期調(diào)控因子在惡性腫瘤發(fā)病機制中的作用受到人們重視。研究已表明絕大多數(shù)腫瘤細胞都存在著若干細胞周期調(diào)控基因的改變。cyclinE和cdk2是細胞周期中重要調(diào)控因子，主要作用于G1期和S期，是DNA復(fù)制的重要啟動因子。正常情況下，cyclinE合成出現(xiàn)在G1中期，S初期含量最高而后逐漸降解消失，但在腫瘤細胞中其表達可見于整個細胞周期；cdk2的表達水平在整個細胞周期中保持不變。兩者異常表達將驅(qū)使細胞超越G1／S期限制點而導(dǎo)致細胞周期縮短、細胞增殖增加［11－13］。cyclin E 和cdk2表達異常與乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［14－16］，但對于兩者在眼瞼基底細胞癌中發(fā)病機制中的作用目前了解甚少。

我們的實驗結(jié)果顯示：20例眼瞼基底細胞癌組織中cyclin E和cdk2表達水平明顯高于癌旁組織，差異有顯著性（P＜0.05），實驗結(jié)果表明cyclin E和cdk2的過度表達可促進腫瘤細胞過度增殖，導(dǎo)致腫瘤的形成，其作用機制推測：真核細胞的分裂必須通過G1-S期轉(zhuǎn)換開始進行DNA合成，通過G2-M期轉(zhuǎn)換進入有絲分裂期，其中CyclinE與G1期密切相關(guān)，CyclinE可與CDK2結(jié)合形成復(fù)合體，隨著CDK活化激酶活化而被激活，激活的復(fù)合體與CyclinE／CDK2復(fù)合體一起使Rb磷酸化，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，驅(qū)動細胞由G1期進入S期，促進細胞增殖。CyclinE的過表達可導(dǎo)致pRb蛋白的磷酸化修飾提前實現(xiàn)，并加速細胞從G1-S期轉(zhuǎn)變過程。當CyclinE占優(yōu)勢與CDK2結(jié)合時，過度刺激細胞分裂，使細胞呈失控性生長，而形成腫瘤。提示cyclinE／cdk2復(fù)合物參與眼瞼基底細胞癌的發(fā)生過程，cdk2還可能通過其它機制影響眼瞼基底細胞癌的發(fā)生發(fā)展，其確切機制有待進一步探討。

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