動(dòng)脈粥樣硬化患者基質(zhì)金屬蛋白酶-9及其抑制物-1基因表達(dá)與痰濁證素的相關(guān)性研究*

談曉東 蘇 偉 高 楓 周春剛 陸 曙

（南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院 無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214001）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過(guò)程，其發(fā)展始終伴隨炎癥反應(yīng)。AS的形成是動(dòng)脈對(duì)內(nèi)膜損傷做出的炎癥-纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果。有研究認(rèn)為循環(huán)血液中基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP-9）與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物－1（TIMP-1）水平可作為反映AS嚴(yán)重程度的良好指標(biāo)［1］。筆者就AS痰濁證素與MMP-9及TIMP-1的關(guān)系進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年6月至2010年2月南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院（無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院）心血管科AS住院患者78例，男性32例，女性46例；年齡（69.91±10.94）歲，痰濁證素30例，非痰濁證素48例。另從本院體檢中心匹配年齡與性別，選取60例健康人作為健康對(duì)照組。中醫(yī)證素的辨證結(jié)合2002年衛(wèi)生部《中藥新藥治療高血壓病的臨床研究指導(dǎo)原則》［2］和《中藥新藥治療胸痹（冠心病心絞痛）臨床研究指導(dǎo)原則》［2］、《中醫(yī)診斷學(xué)》［3］相關(guān)內(nèi)容，確定 AS 患者的中醫(yī)“證素”診斷標(biāo)準(zhǔn)。由同一位具有多年臨床經(jīng)驗(yàn)的主任中醫(yī)師對(duì)該部分患者運(yùn)用中醫(yī)望、聞、問(wèn)、切四診，進(jìn)行中醫(yī)證素評(píng)估，準(zhǔn)確、全面收集證素。

1.2 MMP-9及TIMP-1基因表達(dá)的測(cè)定方法 （1）全血總RNA抽提。取入組者晨空腹血2 mL，經(jīng)EDTA-2Na抗凝，0.3 mL全血采用3S柱離心式血液總RNA抽提試劑盒（K3620上海博彩生物科技有限公司）抽提RNA，RNA提取物-80℃保存。（2）MMP-9及TIMP-1 mRNA表達(dá)水平測(cè)定。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。全血總RNA合成cDNA使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（DRR037S大連寶生物工程有限公司）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRRPremix Ex Taq TM，1~100 ng cDNA，50 pmol/μL引物。兩步法PCR循環(huán)條件：預(yù)變性95℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)，變性95℃ 5 s，退火/延伸 60℃ 20 s共 40個(gè)循環(huán)。 溶解曲線分析95℃ 1 s，65℃ 15 s，95℃ 1 s。

1.3 相對(duì)定量分析 相對(duì)定量分析采用Light Cycler Relative Quantification（Version1.5）軟件，標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)算公式采用2-△△CT法，△CT （患者樣本）=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，△CT（校正品）=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，△△CT=△CT（患者樣本）-△CT（校正品）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以）標(biāo)準(zhǔn)差表示；經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)主要觀察指標(biāo)均符合正態(tài)分布。計(jì)量指標(biāo)兩組間、組內(nèi)比較采用student-t雙尾檢驗(yàn)；多組計(jì)量指標(biāo)均數(shù)間比較，方差齊時(shí)采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)，采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)K－S秩和檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-9及TIMP-1基因片段電泳結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的內(nèi)參基因GAPDH的片段大小為94 bp左右，TIMP-1基因片段的大小為102 bp左右，MMP-9基因片段的大小為108 bp左右。如圖1。

圖1 MMP-9、TIMP-1及GAPDH基因片段電泳圖

2.2 MMP-9、TIMP-1和GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線 （Tm） 分析溶解曲線顯示MMP-9、TIMP-1和GAPDH的PCR產(chǎn)物均具有一明顯而尖峭的峰，其溶解溫度 MMP-9為 86.40℃，TIMP-1為 87.10℃，GAPDH為87.80℃。峰溶解溫度為77℃的曲線為未加模板的陰性對(duì)照樣本，具有一個(gè)弱而寬的峰，說(shuō)明此峰為引物二聚體。峰圖說(shuō)明MMP-9、TIMP-1和GAPDH特異性PCR產(chǎn)物形成固定溶解溫度的曲線峰，當(dāng)反應(yīng)中含有諸如引物二聚體之類的非特異性副產(chǎn)物時(shí)，溶解曲線可能出現(xiàn)兩個(gè)峰。見圖2。

2.3 MMP-9及TIMP-1基因片段的測(cè)序結(jié)果 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆，送南京金斯瑞生物科技公司測(cè)序，經(jīng)比對(duì)，該兩種基因與GENBANK上人MMP-9 mRNA（GenBank：NM_004994.2）與 TIMP-1 mRNA（Gen Bank：NM_003254.2）基因片段完全一致。結(jié)果見圖3、4。

圖2 MMP-9、TIMP-1和GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線（Tm）圖

圖3 MMP-9基因片段序列圖

圖4 TIMP-1基因片段序列圖

2.4 痰濁證素與非痰濁證素組MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)水平指標(biāo)比較 痰濁證素組MMP-9基因表達(dá)水平大于非痰濁證素組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.418，P＜0.05）；痰濁證素組TIMP-1基因表達(dá)水平大于非痰濁證素組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.180，P＜0.05）。 見表 1。

表1 兩組MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)水平比較

表1 兩組MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)水平比較

與痰濁證素組比較，△P＜0.05。

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3 討 論

運(yùn)用證素進(jìn)行組合辨證，都有助于摒棄紛繁復(fù)雜的表象的干擾，直接把握疾病本質(zhì)，提高中醫(yī)辨證論治的可操作性、準(zhǔn)確性，對(duì)臨床診治具有很大指導(dǎo)意義。目前發(fā)現(xiàn)，AS的發(fā)生、發(fā)展與MMP-9及TIMP-1基因表達(dá)水平有著重要的關(guān)系［4］。因此，監(jiān)測(cè)血清MMP-9、TIMP-1的基因表達(dá)水平可用于預(yù)測(cè)AS發(fā)生、發(fā)展，有利于及早采取臨床干預(yù)降低死亡率及改善預(yù)后。

目前認(rèn)為，患者先天稟賦不足，陽(yáng)無(wú)以化氣，陰無(wú)以成形，導(dǎo)致膏脂過(guò)多，滲入血中，發(fā)生高脂血癥而致AS。AS患者多為老年患者，腎虛不能化氣行水，水泛而為痰；肺氣不足，肺失宣降，津液不得通調(diào)輸布，津液留聚而生痰。無(wú)錫地處長(zhǎng)江以南，依山傍水，氣候宜人，居民喜食甜膩之品，易礙脾傷胃，故AS的證素分布多以痰濁偏多。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，“痰濁”與高脂血癥和高凝狀態(tài)相關(guān)［5］，而脂質(zhì)代謝紊亂是AS形成的重要因素，AS患者中合并脂質(zhì)代謝異常的比例較高。一般認(rèn)為，痰濁是高脂血癥的基本病機(jī)，而血漿化學(xué)成分改變可引起血漿黏度增高，并能直接影響AS的發(fā)生。血脂代謝紊亂等病理因素導(dǎo)致的血管硬化、管腔狹窄，加上血液的流變性異常，血流緩慢，造成組織器官供血不足而缺血缺氧，代謝產(chǎn)物堆積，有可能是痰濁作為中醫(yī)病理產(chǎn)物在腦動(dòng)脈硬化過(guò)程中發(fā)生作用的病理機(jī)制之一［6］。脂代謝異常等可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能與結(jié)構(gòu)損傷，血管壁發(fā)生慢性炎癥，受到致病原侵襲的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，吸引大量炎癥細(xì)胞移行進(jìn)入內(nèi)皮層下，單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，后吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，啟動(dòng)了AS過(guò)程。泡沫細(xì)胞不斷分泌釋放包括MMPs在內(nèi)的各種細(xì)胞因子，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。

本研究顯示，AS痰濁證素組的MMP-9基因表達(dá)水平明顯大于非痰濁證素組，提示AS不同證素有著共同的病理變化，加強(qiáng)對(duì)MMP-9的臨床研究在心血管疾病的防治中有其特殊意義，可將MMP-9基因水平檢測(cè)作為AS病情發(fā)展的一種監(jiān)測(cè)指標(biāo)和AS中醫(yī)辨證分型的客觀指標(biāo)。而痰濁證素組的TIMP-1基因表達(dá)水平明顯大于非痰濁證素組，這個(gè)結(jié)論同樣也可以支持這一觀點(diǎn)。TIMP-1基因表達(dá)水平可反映AS的嚴(yán)重程度，其值隨證素的演變而變化。因此，TIMP-1基因表達(dá)水平可作為中醫(yī)痰濁證素的客觀指標(biāo)。

［1］ Pradhan AD，Ridker PM.Do atherosclerosis and type 2 diabetes shares a common inflammatory basis［J］.Eur Heart J，2002，23（6）：831.

［2］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（第1 輯）［S］.1993.

［3］ 陳文彬.中醫(yī)診斷學(xué)［M］.5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：341－342.

［4］ Faia KL，Davis WP，Marone AJ，et al. Matrixmetalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in hamster aortic atherosclerosis：correlation with insituzymography［J］. Atherosclerosis，2002，160（2）：325-330.

［5］ 程小曲.痰濁型冠心病與血脂、脂蛋白、載脂蛋白的關(guān)系及痰濁形成機(jī)理的探討［J］.新中醫(yī)，1994，26（3）：7-9.

［6］ 陳文強(qiáng)，李宗信，黃小波，等.影響腦動(dòng)脈硬化患者痰證的多因素分析［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2006，26（12）：1618-1619.