膽紅素對(duì)新生兒臍血單核細(xì)胞分泌趨化蛋白-1和白細(xì)胞介素-12的影響

陳昌輝，陳 敏，劉會(huì)領(lǐng)，牛會(huì)琴，李茂軍，吳 青

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院兒科，四川 成都 610072)

黃疸是新生兒期常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象，低水平的血清膽紅素是人體內(nèi)自由基清除劑之一，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用［1］。但膽紅素水平顯著升高時(shí)，則產(chǎn)生明顯的毒性作用［2］。單核巨噬細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。本課題組前期研究表明，高濃度膽紅素可抑制單核巨噬細(xì)胞的免疫功能。本研究采用不同濃度膽紅素孵育新生兒臍血單核細(xì)胞(cord blood monocyte，CBMC)，觀察CBMC單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)水平的變化，旨在進(jìn)一步探討膽紅素對(duì)單核細(xì)胞免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇在成都市婦產(chǎn)科醫(yī)院剖宮分娩、胎齡37～42周、出生體重2500～4000 g、Apgar評(píng)分正常的新生兒10例作為研究對(duì)象，并取得家長(zhǎng)知情同意，其母孕期無(wú)特殊疾病史。在無(wú)菌操作條件下，用一次性采血袋采集新生兒的臍血80～150 ml，在4 h內(nèi)分離細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，脂多糖(LPS)為Solarbio公司產(chǎn)品，膽紅素為Fluka公司產(chǎn)品，白蛋白和明膠為Sigma公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD14單克隆抗體為Caltag公司產(chǎn)品，MCP-1和IL-12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒由深圳晶美公司提供。

1.2.2 CBMC的分離與鑒定 先通過(guò)密度梯度離心法分離得到臍血單個(gè)核細(xì)胞(cord blood mononuclear cell，CB-MNC)，用含20%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基把CB-MNC配制成濃度為(2～5) ×106/ml的細(xì)胞懸液。再參照Freundlich［3］的方法，將細(xì)胞懸液接種于2%明膠和自體血漿包被過(guò)的塑料培養(yǎng)瓶中孵育1 h，貼壁細(xì)胞即為CBMC。洗去未貼壁細(xì)胞，加入5mM的EDTA溶液消化得到貼壁細(xì)胞。臺(tái)盼蘭檢測(cè)其活性，流式細(xì)胞儀分析其純度。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整活細(xì)胞數(shù)為1×107/ ml備用。

1.2.3 膽紅素和LPS孵育臍血單核細(xì)胞 將分離得到的CBMC接種于24孔塑料培養(yǎng)板中，每例分為8個(gè)組:空白對(duì)照組(A組)、LPS對(duì)照組(B組)、6 mg/dl膽紅素對(duì)照組(C組)及5個(gè)不同濃度的膽紅素干預(yù)組［2.5 mg/dl膽紅素+LPS組(D1組)、6 mg/dl膽紅素+LPS組(D2組)、9 mg/dl膽紅素+ LPS組(D3組)、12.9 mg/dl膽紅素+LPS組(D4組)和18 mg/dl膽紅素+LPS組(D5組)］。細(xì)胞先經(jīng)不同濃度膽紅素溶液(內(nèi)含有牛血清白蛋白30 mg/L)避光孵育1 h后(反應(yīng)體系為1 ml)，吸出孵育液，再加入LPS溶液(100 μg/ml)，其中A組和C組加入完全培養(yǎng)基2 ml，B組和D組加入1.98 ml完全培養(yǎng)基和0.02 ml LPS溶液(反應(yīng)體系為2 ml，LPS最終濃度1 μg/ml)，混勻。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，收集上清液備用。

1.2.4 MCP-1和IL-12水平的測(cè)定 采用雙抗體夾心的ELISA法檢測(cè)上清液中MCP-1和IL-12水平，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用PEMS 3.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。原始數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，各組方差齊，采用q'檢驗(yàn);各組方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)。兩變量間相關(guān)分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單核細(xì)胞的鑒定及活性檢測(cè) 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，CD14陽(yáng)性細(xì)胞率為(93.99±2.48)%; 0.4%臺(tái)盼蘭檢測(cè)細(xì)胞活性為(93.86±1.79)%，表明所得到的單核細(xì)胞純度及活性均可滿(mǎn)足試驗(yàn)需要。

2.2CBMC分泌MCP-1水平的比較

2.2.1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌MCP-1水平比較 表1顯示，LPS可促進(jìn)CBMC MCP-1的分泌。6 mg/dl濃度的膽紅素單獨(dú)即可抑制CBMC MCP-1的分泌。先經(jīng)不同濃度(2.5、6、9、12.9和18 mg/dl)膽紅素孵育，CBMC MCP-1的分泌受到不同程度的抑制，再接受LPS刺激，不能糾正膽紅素的這種抑制作用。

2.2.2 CBMC分泌MCP-1水平與膽紅素濃度的直線相關(guān)分析 CBMC分泌MCP-1水平與膽紅素濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.761，P＜0.05);即隨膽紅素濃度升高，膽紅素對(duì)CBMC分泌MCP-1水平的抑制作用越明顯。

表1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌MCP-1水平比較 ［pg/ml(%)］

2.3 CBMC分泌IL-12水平的比較

2.3.1 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌IL-12水平比較 表2顯示，LPS單獨(dú)作用可促進(jìn)CBMC IL-12的分泌。膽紅素單獨(dú)作用可抑制其分泌IL-12，當(dāng)膽紅素為6 mg/dl時(shí)，這種抑制作用已經(jīng)存在。先經(jīng)不同濃度(2.5 mg/dl、6 mg/dl、9 mg/dl、12.9 mg/dl、18 mg/dl)膽紅素孵育，CBMC IL-12的分泌受到不同程度的抑制;再接受LPS刺激，可促進(jìn)低濃度(2.5 mg/d和6 mg/dl)膽紅素孵育后的CBMC IL-12的活化恢復(fù)，高濃度(12.9 mg/ dl和18 mg/dl)膽紅素孵育后的CBMC IL-12的活化仍然受抑制，當(dāng)膽紅素濃度由12.9 mg/dl上升至18 mg/dl時(shí)，IL-12的分泌受抑制程度的差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 不同濃度膽紅素與LPS共同作用后CBMC分泌IL-12水平比較 (pg/ml)

2.3.2 CBMC分泌IL-12水平與膽紅素濃度的直線相關(guān)分析 CBMC分泌IL-12水平與膽紅素濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.748，P＜0.01)。結(jié)合D1～D5組區(qū)組的秩和檢驗(yàn)結(jié)果可知，隨膽紅素濃度升高，對(duì)CBMC分泌IL-12的抑制作用越強(qiáng)。

2.4 CBMC分泌MCP-1和IL-12水平的相關(guān)分析 結(jié)果顯示，CBMC分泌MCP-1和IL-12水平呈正相關(guān)(r=0.653，P＜0.05)，即在相同濃度的膽紅素作用下，CBMC分泌MCP-1的水平隨IL-12水平的增高而增多。

3 討論

MCP-1是趨化因子CC亞家族中的一員，由不同類(lèi)型的免疫和非免疫細(xì)胞分泌而成，對(duì)多種細(xì)胞均有趨化作用，可以引起單核巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)游離鈣水平升高、呼吸暴發(fā)、粘附分子的表達(dá)、溶酶體酶及超氧陰離子的釋放并促使組織因子和促炎細(xì)胞因子的生成［4，5］。單核巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生IL-12的主要細(xì)胞，IL-12能夠促進(jìn)幼稚輔助性T淋巴細(xì)胞(Th0)向Th1細(xì)胞發(fā)展，促進(jìn)Th1細(xì)胞IL-12Rβ2鏈的表達(dá)，促進(jìn)Th細(xì)胞因子特別是干擾素-γ(IFN-γ)的合成和分泌，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。IFN-γ又可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化，這樣就產(chǎn)生以細(xì)胞因子 IL-12和IFN-γ為代表的細(xì)胞因子與免疫細(xì)胞之間以免疫增強(qiáng)循環(huán)，在保持機(jī)體的免疫功能方面發(fā)揮重要作用［6］。膽紅素的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)是其產(chǎn)生細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)。未結(jié)合膽紅素具有親脂性，分子量小，呈可超濾性，容易透過(guò)不同組織的脂性細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的膜相結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致質(zhì)膜脆性增加、膜磷脂損失和膜脂成分改變，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷［7］。

本研究通過(guò)體外培養(yǎng)CBMC，經(jīng)膽紅素和LPS孵育處理后，采用ELISA檢測(cè)MCP-1和IL-12的水平。結(jié)果表明:LPS可促進(jìn)CBMC分泌MCP-1和IL-12。膽紅素可抑制CBMC分泌MCP-1和IL-12，隨膽紅素濃度的升高，這種抑制作用越明顯。其中低濃度(2.5 mg/d和6 mg/dl)膽紅素孵育后，再接受LPS的刺激，CBMC IL-12的分泌能力可以部分恢復(fù)，MCP-1的分泌水平恢復(fù)不明顯。當(dāng)膽紅素濃度≥12.9 mg/dl時(shí)，MCP-1和IL-12的水平均不能恢復(fù)。

膽紅素抑制CBMC分泌MCP-1和IL-12的機(jī)制可能為:①膽紅素在生物膜積聚與沉積，擾亂膜結(jié)構(gòu)，通過(guò)抑制線粒體酶(如蘋(píng)果酸脫氫酶)隨后影響線粒體功能，引起能量代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而引起分泌的減少［8，9］。②有研究表明，機(jī)體可以通過(guò)活化Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并以NF-κB依賴(lài)的途徑促進(jìn)黏附分子ICAM-1等，分泌趨化因子MCP-1，IL-8等，還可以通過(guò)活化該途徑活化單核巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其分泌IL-12，腫瘤壞死因子-2、TNF-α等炎癥性因子和細(xì)胞因子［10］。本課題組前期研究表明，高濃度膽紅素可抑制單核細(xì)胞NF-κB活化，降低單核細(xì)胞表面分子TLRs的表達(dá)，故膽紅素可能通過(guò)抑制單核細(xì)胞NF-κB活化［11］，降低TLRs的表達(dá)［12］，從而影響MCP-1和IL-12的分泌。③電鏡下，膽紅素孵育的單核細(xì)胞變?yōu)辄S色鋸齒狀，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹，形成空泡，引起核濃縮、核碎裂、核溶解等細(xì)胞壞死性改變［13］。推測(cè)膽紅素抑制MCP-1和IL-12分泌的機(jī)制為其破壞細(xì)胞膜及細(xì)胞核，引起細(xì)胞壞死，抑制信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致其合成受阻，分泌減少。④膽紅素可引起細(xì)胞凋亡增多［14］，最終導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌減少。

研究提示，膽紅素進(jìn)入細(xì)胞后，可通過(guò)線粒體膜上氧化酶氧化而被清除［15］，這就說(shuō)明，當(dāng)細(xì)胞處于低濃度膽紅素中時(shí)，雖線粒體有一定程度抑制，但功能尚存在，仍能清除部分膽紅素。然而當(dāng)膽紅素濃度升高到一定程度(12.9 mg/dl)，對(duì)細(xì)胞的毒性作用已經(jīng)很明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞膜、核膜被破壞、細(xì)胞核碎裂［13］，嚴(yán)重影響了細(xì)胞功能，導(dǎo)致線粒體功能障礙，無(wú)法清除，故由12.9 mg/dl上升至18 mg/dl時(shí)，對(duì)CBMC的活化抑制作用并沒(méi)有進(jìn)一步增強(qiáng)。

綜上所述，膽紅素的細(xì)胞毒性顯而易見(jiàn)，濃度過(guò)高可顯著抑制免疫系統(tǒng)，可能是高膽紅素血癥患兒易并發(fā)感染的原因之一。究竟在哪一個(gè)濃度范圍內(nèi)的膽紅素會(huì)在人體中發(fā)生毒性作用，目前尚無(wú)明確的界限。因此，臨床工作者應(yīng)在積極降低血中膽紅素水平的同時(shí)，如何阻止膽紅素?fù)p傷細(xì)胞功能，是有待進(jìn)一步深入研究的課題。

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