蛙腿骨骼肌電機械興奮的超聲標測

孟慶國，尹立雪，郭智宇，岳文勝，白 艷，劉會若

(1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院超聲醫(yī)學中心，四川 成都 610072;2.GE公司，四川 成都 610016; 3.川北醫(yī)學院，四川 南充 637007;4.四川省婦幼保健院，四川 成都 610072;5.河南中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

目前，心臟起搏再同步化治療已成為心力衰竭非藥物治療的主要技術方法。國內(nèi)外學者［1，2］已經(jīng)對心臟單腔、雙腔起搏、同步化起搏治療效果進行了系列評價。各種起搏治療均存在各自的不足之處，其原因主要是:起搏電刺激介導的電機械傳導在時間和空間上與心臟生理性或基礎狀態(tài)最佳電機械傳導時空順序的不匹配，導致心臟電機械傳導不恰當?shù)闹貥?，從而造成各種臨床起搏治療效果不佳或失敗。因此，優(yōu)化起搏位點、尋找最佳的起搏治療方式以達到最接近生理狀態(tài)心臟電機械興奮過程依然是亟待解決的重要臨床問題。本研究應用M型組織多普勒超聲觀測離體蛙腿骨骼肌在不同電刺激方式下電傳導時間、電機械延遲時間和機械收縮傳導時間的變化差異及其相關關系，旨在深入揭示電刺激與機械興奮和電傳導的時空變化規(guī)律，為臨床優(yōu)化心臟起搏治療提供相關基礎實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 實驗材料:132只重量0.25～0.35 kg牛蛙，［(0.28±0.03)kg］。設備儀器:Acuson512彩色多普勒超聲診斷儀，7v3c型心臟探頭，發(fā)射頻率為7 MHz;Lead2000多通道電生理儀(成都錦江電子，實際刺激電壓范圍為1～8V;刺激頻率范圍為1～999 ms);本實驗電刺激參數(shù)分別設為電壓1～5V，頻率:電刺激間期為900 ms。

1.2 實驗方法 室溫下，將牛蛙斷髓去皮、上肢和頭后用大頭釘固定軀干及下肢足部于干燥平面木板上。超聲診斷儀心電信號導聯(lián)線與固定軀干和下肢足部處的金屬大頭釘相連，記錄電脈沖刺激信號;將自制電刺激導線(內(nèi)徑1 mm絕緣銅線)一端連接電生理儀發(fā)放電脈沖刺激信號線源，另一端刺入蛙大腿腹側肌內(nèi)(本實驗中電極置入位置為蛙大腿中外側，刺激肌群為股三頭肌和縫匠肌。見圖1)。發(fā)放電脈沖刺激前用手上下、左右微動電刺激導線，通過二維灰階超聲及彩色組織多普勒顯像準確觀察并確定導線頭端位置。將超聲探頭通過支架固定于蛙大腿上方約1 cm(用輕薄紙巾圍合醫(yī)用耦合劑使超聲探頭與蛙腿保持穩(wěn)定距離避免直接接觸)以防止因操作者手疲勞抖動造成的圖像采集失真。實驗過程中，用生理鹽水間斷濕潤蛙大腿骨胳肌，以延緩其生理功能喪失的速度。組織多普勒超聲速度量程分別設定為0.009 m/s和0.11 m/s兩級。采用M型組織多普勒采集圖像時，目標掃描速度設為100 m/s。 Lead2000電生理儀發(fā)放電壓以1 V為間距，從1 V開始逐步提高到5 V為止(改變刺激電壓幅度采集圖像，中間沒有設定時間間隔)。參數(shù)設定后，進行單點單極電極和雙點單極電極電脈沖刺激。M型組織多普勒超聲分別取樣刺激點1～2點和/或接收點3～4點(圖2、圖3)，采集連續(xù)4個電脈沖刺激周期的圖像，獲取并測量以下參數(shù):電機械延遲時間(t1)(圖2)、機械收縮傳導時間(t2)(圖3)、機械收縮持續(xù)時間(Tm)及兩電極點間電傳導時間差(T) (圖4)等，為減少測量誤差，所有分析參數(shù)均為4個電脈沖刺激周期測量參數(shù)的均數(shù)。實驗流程:①單點單極電極刺激，兩電極位點相距2 cm。電刺激位點和探頭置于1～2點時，觀測電與機械傳導延遲(t1)。探頭移到3～4點，觀測機械傳導時間(t2)。②單點單極電極刺激，兩電極位點相距2 cm，在兩電極位點中間位點注入0.2 ml濃度75%的酒精，觀察蛙大腿肌局部注射酒精部位顏色變白后，觀測t2、T和Tm(圖5)。③雙點單極電極刺激，兩電極位點相距3 cm，將探頭固定于兩電極點中點位置。于1～2位點和3～4位點同時發(fā)放電脈沖刺激，觀測雙點單極電極刺激方式下，t2以及Tm變化(圖6)。

圖1 a.箭頭所指為超聲確定電極頭的位置;b.可以清楚觀察到紅色電脈沖信號從電極頭處開始，M型組織多普勒取樣線通過電極頭處，獲取所需時間測量參數(shù)同圖7。

圖2 單點單極電極刺激示意圖 兩電極點間距2 cm，(+)(1～2)點為電極脈沖發(fā)射點和探頭位置，(－)(3～4)為電極脈沖接收點。t1:電機械延遲時間，Tm:組織多普勒M型紀錄1～2點機械收縮持續(xù)時間。

圖3 單點單極電極刺激示意圖 兩電極點間距2 cm，探頭置于3～4點。t2:機械收縮傳導時間，Tm:組織多普勒M型紀錄3～4點機械收縮持續(xù)時間。

圖4 電生理儀測量兩電極點間時間(T) 黃色線為1～2點電脈沖發(fā)放點電位記錄，綠色線為3～4點接收點電位記錄:所測即為T值。 圖5 注射酒精電機械傳導阻滯后重復圖3試驗兩電極位點中間位注射酒精后，1－2點發(fā)放電脈沖刺激信號，超聲探頭置于3～4點(接收點)，觀測t2和Tm

圖6 雙點單極電極刺激方式示意圖 兩電極位點分別距探頭1.5 cm，兩實線電極同時發(fā)放電脈沖刺激，觀測t2和Tm。

圖7 實際測量t1、t2及Tm:黃色線為1～2點電脈沖發(fā)放點和接收點測量t1、t2方法;綠色箭頭:Tm的測量方法

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件。所有參數(shù)均經(jīng)過正態(tài)檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差表示，各組組內(nèi)各參數(shù)進行配對t檢驗，分析電、機械傳導與刺激電壓幅度改變間的差異及關聯(lián)關系;各組組間采用獨立樣本t檢驗，比較刺激方式、刺激電壓幅度改變對各時間參數(shù)的影響;同時對T、t1、t2及Tm進行Pearson雙變量相關性分析，以確立電、機械收縮在時間和空間的關聯(lián)關系。以上參數(shù)分析P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 單點單極電極組、雙點單極電極組t1、t2的比較 各組組內(nèi):不同刺激電壓，單點單極電極組和雙點單極電極組刺激，t2差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);t1總體趨勢差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)，見表1，保持刺激距離、電壓不變單純把組織多普勒速度量程由低到高改變，t2差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各組組間:相同刺激電壓，單點單極電極組和雙點單極電極組刺激，t2總體上差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。①相同組織多普勒速度標尺且刺激電壓幅度相同時，單點單極電極刺激t2與雙點單極電極刺激t2之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);不同組織多普勒速度標尺、相同刺激電壓時，t1、t2差異均有統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)為:降低組織多普勒速度標尺，t1和t2均明顯延長(P＜0.05)，見表2。②相同組織多普勒速度標尺、刺激電極距探頭相同距離情況下，單點單極刺激電壓為1V和2V時，二者分別與不同電壓的雙點單極電極刺激相比較，雙點單極刺激組隨著刺激電壓升高，t2相對單點單極組明顯縮短(P＜0.05)，見表3。

2.2 Tm的比較 各組組內(nèi):生理狀態(tài)下，Tm沒有隨著刺激電壓幅度改變而出現(xiàn)明顯的變化(P＞0.05);各組組間:1～2點(刺激點)和3～4點(接收點)的Tm差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表4。

2.3 相關性分析 Tm與t1、t2間沒有顯著相關性(P＞0.05)，見表5、表6。T與t1、t2、Tm間沒有顯著相關性(P＞0.05)，見表7。

2.4 注射酒精前后對比 注射酒精前后，組織多普勒速度標尺設定為0.009 m/s時，t2出現(xiàn)明顯統(tǒng)計學差異，表現(xiàn)為:注射酒精造成電機械傳導阻滯后t2明顯縮短(P＜0.05)，Tm沒有明顯的變化(P＞0.05)。組織多普勒速度標尺設定為0.11 m/s時，注射酒精后t2沒有明顯的變化(P＞0.05)，Tm表現(xiàn)為明顯延長(P＜0.05)，見表8、表9。

表1 單點單極電極在不同電壓刺激下t1、t2比較 (ms)

表2 單點單極電極與雙點單極電極刺激模式t2間比較 (ms)

表3 單點單極電極刺激與不同電壓的雙點單極電極刺激模式T2間比較 (ms)

表4 相同刺激電壓下，刺激點和接收點間Tm的比較 (ms)

表5 不同刺激電壓下，Tm與t1間的相關性分析

表6 不同刺激電壓下，Tm與t2間的相關性分析

表7 T與t1、Tm的相關性分析

表8 t2注射酒精前、后自身對比 (ms)

表9 Tm注射酒精前、后自身對比 (ms)

3 討論

不同類型肌纖維在收縮、電傳導和收縮速度等方面存在明顯差異。而不論何種肌纖維，電刺激與整體和局部肌纖維機械收縮發(fā)生和傳導均必定存在著多種尚未完全認知的時空關聯(lián)關系。此前，有Neher等［7～9］通過膜片鉗技術、激光共聚焦技術、細胞內(nèi)微電技術等方法對鈣離子、膜電位變化和收縮偶聯(lián)機制等微觀方面進行了深入地研究。結果發(fā)現(xiàn):鈣火花興奮-收縮偶聯(lián)的關鍵環(huán)節(jié)。從鈣火化產(chǎn)生至到達峰值，骨骼肌和心肌平均需時分別約為5 ms和10 ms。Yong-Jin［10］通過雙向紅外線探測器-計算機控制的電刺激與超低溫快速冷凍固定同步技術發(fā)現(xiàn)蛙腿骨胳肌在受到電刺激后產(chǎn)生收縮約需時8 ms。以上研究均是在微觀方面對電機械收縮加以闡釋，而應用臨床組織多普勒M型超聲可視化技術手段觀察骨骼肌電機械時空關系研究鮮有報道。

M型組織多普勒超聲時間分辨率極高，每秒可達2000～4000幀以上，間期觀察以個位數(shù)毫秒計，能區(qū)分和捕獲組織運動時相的微小差異。本研究嘗試應用可視化的M型組織多普勒超聲觀測離體蛙腿骨骼肌在不同方式、不同電壓 電脈沖刺激下，t1、t2、T以及Tm的變化情況。試驗中為了嘗試剔除一些影響因素，從組織多普勒速度最低起逐步提高量程，當彩色混疊恰好和或彩色干擾消失，我們對超聲儀器組織多普勒速度標尺設定了兩種狀態(tài)(彩色靶標標尺調(diào)為0.009和0.11)采集圖像，以期捕獲更多的研究信息。結果發(fā)現(xiàn):組織多普勒速度標尺相同、電壓相同，即使刺激電極點位置、方式改變時，電機械延遲時間、電機械傳導時間以及機械傳導時間等均沒有明顯的差異;在不同速度標尺的情況下，即使應用相同電壓刺激，t1、t2也會明顯出現(xiàn)明顯差異。說明儀器參數(shù)的設定對研究觀察結果有一定的影響;當組織多普勒速度標尺設為0.11時，得到的電機械延遲時間更接近10 ms，說明通過可視化組織多普勒超聲技術可以觀察并基本接近前面眾多學者通過顯微微觀技術手段觀測的結果。

我們首先采用單點單極電極刺激模式，并改變刺激電壓幅度，結果發(fā)現(xiàn):t1、t2和Tm均沒有明顯差異，說明骨骼肌細胞在發(fā)生動作電位后，機械收縮傳導時間在一定的空間內(nèi)傳播沒有明顯的衰減，電機械傳導延遲時間同樣沒有隨著刺激電壓改變而有所變化，也間接證實了細胞膜電位的全或無變化;細胞收縮傳導與刺激電位強度的增加沒有明顯關聯(lián)關系，即機械收縮傳導時間并沒有隨著電壓幅度的增大而加快。但改變電極刺激方式，采用雙點單極電極刺激后，隨著刺激電壓的變化雙點單極電極刺激導致肌纖維機械興奮傳導速度明顯比單點單極電極刺激的快;說明肌纖維發(fā)生動作電位后，盡管肌肉收縮傳導與刺激位點電壓大小無關，但增加刺激位點(采用雙點單極電極刺激模式)同時增加刺激電壓幅度后，肌纖維機械興奮收縮傳導時間比單點單極刺激明顯縮短。說明采用雙點單極電極刺激t2明顯縮短，是因為它相對于單點單極電極刺激t2是空間上矢量的疊加;但是，隨著單點單極組刺激電壓幅度的逐漸增大，這種差異性卻又消失了。推測:這可能是因為當刺激強度過小時，不能引起肌肉發(fā)生收縮反應，此時為閾下刺激;逐漸增加刺激強度，收縮的幅度逐漸增大;當全部肌肉均發(fā)生最大收縮時，此時的最小刺激值為最適刺激;超過最適刺激之后，肌肉收縮的幅度不會再增大［11］;亦可能是因為離體肌肉組織在持續(xù)電刺激下無氧做功，肌肉更容易發(fā)生疲勞，從而降低Na-K泵功能，泵功能的降低會影響肌肉的收縮峰值幅度［12，13］;David等證實:機械引起的疲勞遠小于電刺激引起的，所有感受器部位對刺激的反應效果不一致，1/3神經(jīng)單位代謝率增加持續(xù)時間很短，刺激起始的潛伏時間的加速率與刺激強度成反比。從而出現(xiàn)上述在增大刺激電壓t2反而沒有差異性的結果。

我們采用組織多普勒加速度超聲技術就已經(jīng)觀察了電刺激和心肌纖維收縮運動的時空關系，發(fā)現(xiàn)電-機械延遲時間約為7 ms［14］。這與前面所述研究［10］結果基本一致。為了更多了解當改變刺激電壓后電機械的關聯(lián)關系以及改變電刺激模式，電機械傳導有無不同變化。結果發(fā)現(xiàn):在相同刺激強度情況下，針對相同距離位置點，采用單點單極電極刺激與雙點單極電極刺激并沒有引起t2、Tm的明顯改變。對T、t1、t2以及Tm的彼此相關性分析發(fā)現(xiàn)，單點單極電極組、雙點單極電極組均沒有建立起良好的相關性。前面我們業(yè)已證實:只要刺激引起蛙腿肌細胞發(fā)生動作電位后，即使提高刺激電壓幅度，細胞間的電傳導速度、電傳導時間不發(fā)生改變;在傳導距離不變的情況下，根據(jù)距離=速度×時間公式，得出肌肉收縮速度不發(fā)生變化(因為結果中t2和Tm沒有發(fā)生明顯的差異)，因此也就未能在它們之間建立起良好的關聯(lián)性;

在生理狀態(tài)下，Tm于各組內(nèi)及組間比較幾乎為恒定不變，說明肌纖維細胞受到閾上刺激后，無論改變刺激電壓還是刺激模式，動作電位產(chǎn)生的機械收縮運動產(chǎn)生力學效果不再發(fā)生改變;從而說明臨床各種方式起搏治療之所以沒有取得預期療效，很大程度取決于起搏器電極放置位置的不理想，未能使起搏電刺激介導的電機械傳導在時間和空間上與生理性或病理狀態(tài)最佳電機械傳導時空順序達到匹配。這就需要臨床尋找一種刺激方式保證受損肌細胞在閾上刺激后能和周圍正常肌細胞保持時間同步性，只有這樣才能使電刺激產(chǎn)生的力學效果表現(xiàn)為最佳，也就是臨床上所說同步性收縮。

試驗中，我們亦嘗試了在保證蛙腿骨骼肌新鮮狀態(tài)下，在兩電極點中點位置注射酒精人為造成電機械傳導阻滯，采用以上同樣刺激方式觀察T、t1、t2和Tm。結果發(fā)現(xiàn)，刺激電壓為1V和2V時，M型組織多普勒超聲未能觀察到機械收縮傳導信號，提示:注射酒精后，蛙大腿肌細胞內(nèi)環(huán)境被改變或破壞，甚至導致部分肌細胞喪失了動作電位，結果電產(chǎn)生機械傳導信號敏感性降低或者被阻斷;當刺激電壓升高到3V以上時，才出現(xiàn)機械收縮波信號。并發(fā)現(xiàn):較低多普勒速度標尺下的t2與未施加干預條件下前的蛙腿肌纖維電刺激比較出現(xiàn)明顯差異，表現(xiàn)為注射酒精造成電機械傳導阻滯后t2明顯比注射酒精前生理狀態(tài)下的要縮短。有實驗［15］表明只要處于恒流源所形成的電場下，有肌肉收縮就一定有肌組織的阻抗變化，二者同步發(fā)生，收縮越強，阻抗變化亦越大;各單元的收縮越同步，阻抗變化越大。當局部肌組織損傷后，首先直接破壞了興奮得傳遞，因而影響了整體肌收縮的同步性。同步性降低，阻抗變化越小，那么相同距離情況下電傳導時間就相對長。而提高多普勒速度標尺后，這種差異性又消失了。這個現(xiàn)象通過Wood等［16］提出的假說似乎可以解釋:除了細胞外鈣離子內(nèi)流以外，細胞內(nèi)貯存點相結合的和動作電位釋放的鈣離子量，是收縮力的主要決定者。在動作電位復極化的當時和以后，鈣離子再結合到細胞內(nèi)貯存點的過程按指數(shù)速率下降。結合的鈣離子量決定著細胞收縮幅度的變化，隨著不斷的刺激再結合的鈣離子減少就越明顯，收縮幅度降低就會明顯。那么在收縮幅度降低的情況下提高多普勒速度標尺，低速信息是否就會被漏掉，結果造成縮短的t2沒有表現(xiàn)出來，這還需要進一步實驗證實。同時，實驗中發(fā)現(xiàn)Tm和t2出現(xiàn)完全相反的狀況:在較高多普勒速度標尺的情況下，注射酒精后Tm明顯比注射前延長。這可能是因為正常肌細胞在傳導電興奮產(chǎn)生收縮時逐步、逐個興奮臨近細胞的，注射酒精前兩個電極點間是沒有“障礙”存在的，興奮可以沿細胞間連接直線直接傳導過去;而注射酒精后，電傳導興奮產(chǎn)生收縮則不能直接通過，它要使接收點觀察到電機械興奮則只能繞過“障礙”，從旁邊正常細胞傳導過去;再有部分細胞功能受到影響后，除極時鈣離子較慢地釋放至收縮結構(引起緩慢激活)和復極時鈣離子下降速度緩慢(引起緩慢舒張)［17］。故注射酒精后Tm出現(xiàn)延長。還有一種可能是因為蛙腿暴露時間相對較長，在持續(xù)電刺激下，肌肉出現(xiàn)疲勞，導致骨骼肌收縮和舒張能力的下降。代謝產(chǎn)物在肌細胞內(nèi)大量堆積，從而導致運動單位動作電位的傳導速度減慢［18，19］。當然這只是推測，尚需今后進一步試驗研究證實。

本研究的不足之處:為了在探頭與蛙腿肌肉表面間排除空氣干擾，人為增加的耦合劑具有一定重量，可能造成骨骼肌前負荷的差異;每次選擇刺激點與蛙腿骨骼肌纖維走向可能存在差異等。

總之，本研究只是初步對蛙腿肌纖維在電刺激下，通過高幀頻M型組織多普勒超聲觀察電、機械收縮傳導和機械收縮功能在時間上的一些差異以及二者的相關性，為今后臨床進一步改進心臟起搏治療研究提供了基礎實驗數(shù)據(jù)。

［1］LecLercq C，VicTor F，Alonso C，et al.Comparative effects of permanent biventricular pacing for refractory heart failure in patients with stable sinus rhythm or chronic atrial fibrillation［J］.Am J Cardiol，2000，85:1154-1159.

［2］SaKsena S，Prakash A，Madan N，et al.Prevention of atrial fibrillation by pacing in:Barold ss，M ugicu J，eds recent advances in cardiac pacing［M］.New York:future publishing company，1998:101-114.

［3］Askenazi J，Alexand JH，Koenighserg DI，et al.Alteration of left ventricular performance by left bundle branch block stimulated with atrio-ventricular sequential pacing［J］.Am J Cardiol，1984，53:99-104.

［4］Cirnes CL，Bashor TM，Boudoulas H，et al.Functional abnormalities in isobated left bundle branch block:the effect of inter-ventricular asynchrony［J］.Circulation，1989，79:845-853.

［5］Lupi G，Brignole M，Oddone D，et al.Effects of left ventricular pacing on cardial performance and on quality of life in patients with drug refractory heart failure［J］.Am J Cardiol，2000，86(11):1267-1270.

［6］Morris Thurgood JA，Turner MS，Night-Ngale AK，et al.Pacing in heart failure:improved ventricular interation in diastole rather than systolic-syschronization［J］.Euro Pace，2000，2(4):271-276.

［7］Neher E.Ion channels for communication between and with in cell［J］.Neuron，1992，(8):605-612.

［8］Cheng-Zhi N.Immunoblotting observation on changes of myosin degradation metabolism in toad gastrocnemius muscle electric stmulation under simulated exercise load［J］.Space Medicine＆Medical Engineering，1999，12(6):426-430.

［9］趙婷，魏勝，方華強.鈣火花研究進展和展望［J］.生物物理學報，2007，23(4):265-274.

［10］Yong-Jin Y，Chang-Hai L，Yue-W.Study on the instant changes of ultrastructural morphological during excitation-contraction coupling in skeletal muscles［J］.A Cad J Sec Mil Med Univ，1999，20(3): 151-153.

［11］倪紅.蛙類骨骼肌與心肌生理特性的比較研究［J］.生命科學學院，2006，30(1):157.

［12］StorJnik V，Komi PV.Neuromuscular fatigue after maximal stretchshorting cycle exercise［J］.J Apple physiol，1998，84:344-350.

［13］Clausen T.Na-K.Pump regulation and skeletal muscle contractility［J］.Physiol，2003，83:1269-1324.

［14］Li-Xue Y，Chun-Mei L，Qin-Gue F.Ventricular excitation maps using tissue Doppler acceleration imaging:potential clinical application［J］.J Am Coll Cardiol，1999，33:782-787.

［15］Zhao-Kang Y，Yi-Ming Z，Guo-Bao N.Changes of impedance during the contraction of isolated toad's gastrocnemius and its significance［J］.Journal of the Fourth Military Medical University，1994，15(1):56-59.

［16］蒙卡斯爾.醫(yī)學生理學［M］.北京:科學出版社，1990.

［17］尹立雪.現(xiàn)代超聲心臟電生理學［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2007.

［18］Jing-Guo ZH，Jin-Wen L.Effects of temperature on contractility of toad-gastracrmius muscle［J］.Shandong TiYuKeJi(Shandong Sport Sci Technol)，2002，24(3):36-37.

［19］Westerblad H，Allen DG，Lannergren J.Muscle fatigue:lactic acid or inorganic phosphate the major cause［J］.News Physiol Sci，2002，17:17-21.

［20］Toru T，Jun S，Kazue M.Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-never preparations in vitro after eccentric contraction［J］.J Neurophysiol，2005，94:2822-2831.

［21］David A，Joel DG.Peripheral coding of tonic mechanical cutaneous pain:comparison of nociceptor activity in rat and human phychophysics［J］.J Neuraphysiol，1999，82:2641-2648.