糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)在人氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)及對MAPK信號(hào)通路的影響①

劉靜月 符 州 張明香 劉恩梅 羅征秀 王莉佳

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心，重慶400014)

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)在人氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)及對MAPK信號(hào)通路的影響①

劉靜月②符 州 張明香 劉恩梅 羅征秀 王莉佳②

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心，重慶400014)

目的:探討糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)在人氣道上皮細(xì)胞9HTE0中的表達(dá)以及對MAPK信號(hào)通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2的影響。方法:采用RT-PCR及Western blot法檢測地塞米松(Dex)作用后GILZ mRNA及蛋白的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞免疫熒光法檢測GILZ蛋白的定位;合成三條GILZ-SiRNA分別轉(zhuǎn)染人氣道上皮細(xì)胞9HTE0，用Q-PCR及Western blot法篩選出沉默效果最佳的一條;Western blot法檢測MAPK信號(hào)通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白及其總蛋白的表達(dá)。結(jié)果:Dex能夠明顯刺激人氣道上皮細(xì)胞9HTE0GILZ mRNA及蛋白的表達(dá)，GILZ蛋白主要定位在細(xì)胞漿中，Dex抑制了Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表達(dá)，而GILZ-SiRNA轉(zhuǎn)染后，Raf-1.Mek1/2、Erk1/2磷酸化水平有所回升。結(jié)論:糖皮質(zhì)激素作為支氣管哮喘一線用藥，雖然能夠誘導(dǎo)GILZ表達(dá)并發(fā)揮一定的抗炎作用，但同時(shí)GILZ卻抑制了在氣道上皮修復(fù)中起重要作用的MAPK信號(hào)通路的激活，這為臨床上研究哮喘防治新措施提供了理論依據(jù)。

糖皮質(zhì)激素;GILZ;氣道上皮細(xì)胞;MAPK;支氣管哮喘

糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是一類由腎上腺皮質(zhì)分泌的甾體激素，它調(diào)節(jié)著糖、脂肪以及蛋白質(zhì)的生物合成和代謝，同時(shí)還有抗過敏、抗炎以及免疫抑制的作用。在哮喘治療中GC作為一線藥物在臨床上被廣泛應(yīng)用，其中糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(Glucocorticoid-induced leucine zipper，GILZ)是GC重要的抗炎介導(dǎo)者[1]，但同時(shí)它還能與促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員相互作用，抑制信號(hào)通路的磷酸化，從而抑制氣道上皮損傷后修復(fù)的過程[2，3]。在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中，氣道變化貫穿著整個(gè)病理過程，氣道上皮是外部環(huán)境與機(jī)體內(nèi)環(huán)境相互作用的屏障，本研究通過地塞米松(Dexamethasone，Dex)處理人氣道上皮細(xì)胞9HTE0，觀察GILZ的表達(dá)情況及其對MAPK信號(hào)通路的影響，為臨床上進(jìn)一步研究哮喘防治新措施提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人氣道上皮細(xì)胞9HTE0(美國模式培養(yǎng)物保藏所，ATCC)，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院研究所呼吸研究室保存，胎牛血清、OPTI-MEM購自Gibco公司，Dex購自Sigma公司，總RNA快速提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒購自 Bioteke公司，PrimeScript RT reagent Kit購自TaKaRa公司，RealMasterMix(SYBR Green)購自天根公司，Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司，GILZ、β-actin、GAPDH 引物、GILZ-SiRNA 等合成自Invitrogen公司，小鼠抗人GILZ單克隆抗體購自Santa Cruz公司，兔抗人 p-Raf-1、Raf-1、p-Mek1/2、Mek1/2、p-Erk1/2、Erk1/2單克隆及多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，抗β-actin鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠DyLight488熒光二抗購自康為世紀(jì)公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠/兔二抗購自聯(lián)科生物公司，全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL檢測試劑盒購自凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 9HTE0細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中37℃、5%CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下定時(shí)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。每2～3天待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的80%～90%左右消化傳代。

1.2.2 RT-PCR 法檢測 GILZ mRNA 在9HTE0細(xì)胞中表達(dá)情況 將9HTE0細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞鋪于6孔板中，貼壁后加入終濃度10 μmol/L Dex培養(yǎng)6、12、24小時(shí)，按說明書提取細(xì)胞總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。引物為:GILZ(F:5′-TGGTGGTTCTGCGGTGTAAGTG-3′，R:5′-CTCCTCGTGAGATGATGCTTGG-3′，擴(kuò)增長度為 115 bp)，β-actin(F:5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，R:5′-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3′，擴(kuò)增長度為303 bp)。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性 4分鐘，94℃變性 30秒，64℃ 復(fù)性(GILZ)/60℃復(fù)性(β-actin)30秒，72℃延伸45秒，35次(GILZ)/30次(β-actin)循環(huán)，72℃再延伸5分鐘。將擴(kuò)增產(chǎn)物110 V下行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光法(ICC)檢測GILZ蛋白在9HTE0細(xì)胞中的表達(dá)定位 將9HTE0細(xì)胞懸液以5×104個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)鋪于有小玻片的24孔板中，貼壁后加入終濃度10 μmol/L Dex培養(yǎng)6小時(shí)，4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，0.1%TritonX-100室溫透膜10分鐘，5%BSA室溫封閉30分鐘，滴加一抗4℃過夜后，滴加二抗37℃孵育45分鐘，DAPI染核，漂洗，抗淬滅劑封片，熒光觀察。

1.2.4 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染9HTE0細(xì)胞 用無抗無血清DMEM培養(yǎng)9HTE0細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書按比例加入OPTI-MEM和SiRNA(GILZ-SiRNA1:5′-GGAUCUGGUGAAGAAUCAUTT-3′，GILZ-SiRNA2:5′-GAACUCCCAGCUAGAGCGUTT-3′，GILZ-SiRNA3:5′-GUUCCAGUCCUGUCUGAGCTT-3′)的混合液于培養(yǎng)基中輕輕混勻，6小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基，24小時(shí)時(shí)加入終濃度10 μmol/L Dex刺激，48小時(shí)時(shí)提取細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)成cDNA，-20℃保存及提取蛋白BCA測蛋白濃度后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Q-PCR檢測 3條 GILZ-SiRNAs沉默后的GILZ mRNA水平 將保存的cDNA取出，用SYBR Green 檢測各組(GILZ-SiRNA1、GILZ-SiRNA2、GILZSiRNA3、陰性對照、GAPDH陽性對照)GILZ mRNA水平。GAPDH 引物:F:5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，擴(kuò)增長度為203 bp。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3分鐘，40次循環(huán)[95℃變性30秒，64℃退火(GILZ)/60℃退火(GAPDH)30秒]兩步法。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測GILZ蛋白的表達(dá)情況及其對Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白及總蛋白的影響 按蛋白分子量配制相應(yīng)濃度的SDS-PAGE凝膠，蛋白于100℃沸煮5分鐘后，取總蛋白100μg在濃縮膠60 V、分離膠120 V下電泳，電泳結(jié)束后將蛋白半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%的BSA室溫下封閉1小時(shí)，TBST洗膜10分鐘×3次，用封閉液稀釋的 GILZ(1∶100)/β-actin(1∶2 000)/ p-Raf-1、Raf-1、p-Mek1/2、Mek1/2、p-Erk1/2、Erk1/2 (1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜10分鐘×3次，再用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠/兔二抗(1∶5 000)室溫下孵育1～2小時(shí)，TBST洗膜10分鐘×3次，按ECL顯色試劑盒說明書操作曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行組間方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dex誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞9HTE0GILZ mRNA的表達(dá) RT-PCR檢測人氣道上皮細(xì)胞9HTE0在10 μmol/L Dex作用6、12及24小時(shí)后，6小時(shí) GILZ mRNA即出現(xiàn)顯著增高，12、24小時(shí)仍明顯高于正常組，如圖1所示。

2.2 Dex誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞9HTE0GILZ蛋白的定位 細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)GILZ蛋白主要定位于細(xì)胞漿中，10 μmol/L Dex作用6小時(shí)后可見GILZ蛋白表達(dá)明顯高于正常組，如圖2所示。

2.3 Dex誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞9HTE0GILZ蛋白的表達(dá) 人氣道上皮細(xì)胞9HTE0在10 μmol/L Dex作用6、12、24小時(shí)后，可見正常組GILZ蛋白無明顯表達(dá)，6小時(shí)時(shí)表達(dá)即出現(xiàn)明顯增高，12小時(shí)達(dá)到高峰，如圖3所示。

2.4 GILZ-SiRNAs轉(zhuǎn)染人氣道上皮細(xì)胞9HTE0后GILZ mRNA的沉默效果鑒定 Q-PCR檢測三條GILZ-SiRNAs的沉默效果，control組(0.61 ±0.24)與 Si-negative組(0.51 ±0.20)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);GILZ-SiRNA1、GILZ-SiRNA3 分別為(0.27 ±0.06)、(0.22 ±0.04)，與 Si-negative 組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);GILZ-SiRNA2為(0.36±0.12)，與 Si-negative組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由此可以看出GILZ-SiRNA3的沉默效果最佳，相對Si-negative組的沉默效率可達(dá)到55.8%，故選用GILZ-SiRNA3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如圖4所示。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)GILZ mRNA RT-PCR圖Fig.1 RT-PCR of GILZ mRNA in different times

圖2 GILZ蛋白免疫熒光的觀察(×400)Fig.2 The fluorescence expression of GILZ protein(×400)

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)GILZ蛋白在9HTE0中表達(dá)Fig.3 The expression of GILZ protein in different times in 9HTE0

2.5 GILZ-SiRNA3轉(zhuǎn)染人氣道上皮細(xì)胞9HTE0后GILZ蛋白的表達(dá) 將GILZ-SiRNA3轉(zhuǎn)染9HTE0后，WB檢測其蛋白沉默情況，可見GILZ-SiRNA3蛋白表達(dá)量較對照組明顯減少，蛋白沉默效果佳，如圖5所示。

2.6 GILZ對MAPK信號(hào)通路因子 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化及總蛋白的表達(dá)影響 GILZ-SiRNA3轉(zhuǎn)染9HTE0后WB檢測MAPK信號(hào)通路相關(guān)因子，可見在磷酸化水平上，Dex刺激組均抑制了MAPK信號(hào)通路相關(guān)因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表達(dá)，而GILZ-SiRNA沉默組則減輕了Dex的抑制作用，提示 GILZ具有抑制 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化的作用;而在 Raf-1、Mek1/2、Erk1/2總蛋白水平上，各組無明顯差異，提示GILZ不影響總蛋白表達(dá)，如圖6所示。

圖4 GILZ-SiRNAs轉(zhuǎn)染9HTE0后GILZ mRNA的表達(dá)Fig.4 The expression of GILZ mRNA after GILZ-siRNAs transfected 9HTE0

圖5 GILZ-SiRNA3轉(zhuǎn)染9HTE0后GILZ蛋白的表達(dá)Fig.5 The expression of GILZ protein after GILZ-SiRNA3 transfected 9HTE0

圖6 MAPK信號(hào)通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化及總蛋白的表達(dá)Fig.6 The expression of phosphorylated and total proteins of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2

3 討論

支氣管哮喘是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病，其發(fā)病率和死亡率仍呈逐年上升的趨勢，GC作為治療支氣管哮喘的常用藥物，雖然能有效控制氣道炎癥，但研究顯示其對氣道損傷后的修復(fù)有抑制作用。1997年意大利科學(xué)家D′Adamio等[4]在用Dex處理小鼠胸腺淋巴細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)GILZ的表達(dá)后，對GILZ的研究隨之展開。GILZ屬于轉(zhuǎn)錄因子TSC-22家族，含有N末端結(jié)構(gòu)域、中間的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和C末端的多聚脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域，可被臨床上廣泛使用的GC所誘導(dǎo)產(chǎn)生，并能在許多組織及細(xì)胞中被快速誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)著增殖、分化以及凋亡等功能[5]，同時(shí)GILZ還抑制炎癥分子NF-κB和AP-1的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化、IL-2的產(chǎn)生、抑制Raf-1信號(hào)通路以及增加上皮鈉通道的數(shù)量等[2，6-8]。國外有研究顯示Dex能夠快速誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中GILZ的產(chǎn)生，同時(shí)在4小時(shí)內(nèi)能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞GILZ的表達(dá)并具有時(shí)間依賴性[9，10]。本文通過Dex作用于人氣道上皮細(xì)胞9HTE0，發(fā)現(xiàn)正常組中GILZ的 mRNA表達(dá)含量較低，而幾乎檢測不到蛋白的表達(dá)，但在Dex刺激6小時(shí)時(shí)即可見明顯的GILZ mRNA及蛋白的升高，提示 GC能夠快速誘導(dǎo) GILZ的表達(dá)。

氣道上皮作為機(jī)體內(nèi)外環(huán)境相互作用的屏障，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性是維持氣道局部微環(huán)境的重要條件。氣道上皮的損傷是哮喘的重要病理基礎(chǔ)，長期使用GC可能是導(dǎo)致氣道上皮損傷的重要危險(xiǎn)因素，GILZ雖然在哮喘抗炎中發(fā)揮一定的作用，但同時(shí)GILZ也通過抑制Raf-1磷酸化阻斷了MAPK信號(hào)通路的激活[2，11]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí) GILZ 抑制了MAPK信號(hào)通路因子Raf-1、Mek1/2、Erk1/2蛋白磷酸化水平，從而影響了MAPK信號(hào)通路的傳導(dǎo)，而氣道上皮損傷后修復(fù)又主要是通過表皮生長因子與其受體相互作用，通過激活MAPK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的[12]，故GILZ在抗炎的同時(shí)也抑制了氣道上皮的損傷后修復(fù)，為哮喘的治療增加了難度。因此，如何發(fā)揮GILZ抗炎作用的同時(shí)，尋找到干預(yù)GILZ抑制氣道上皮損傷后修復(fù)的藥物，達(dá)到既控制哮喘氣道炎癥又促進(jìn)氣道上皮損傷后修復(fù)的目的，是我們下一步亟待研究的主要方向。

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[收稿2012-03-29]

(編輯 許四平)

The expression of glucocorticoid-induced leucine zipper(GILZ)and its effect to MAPK signaling pathway in human airway epithelial cells

LIU Jing-Yue，F(xiàn)U Zhou，ZHANG Ming-Xiang，LIU En-Mei，LUO Zheng-Xiu，WANG Li-Jia.Respiratory Center，Children’s Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China

Objective:To explore the expression of glucocorticoid-induced leucine zipper and the effect of GILZ to Raf-1，Mek1/2，Erk1/2 of MAPK signaling pathway in human airway epithelial 9HTE0cells.MethodsRT-PCR was used to detect GILZ mRNA.GILZ protein was tested by Western blot and located by immunofluorescence.Three synthetic GILZ-SiRNAs were respectively transfected into 9HTE0cells to screen out the best GILZ-SiRNA.Western blot assayed the phosphorylated and total proteins of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2.ResultsGILZ mRNA and protein increased obviously with Dexamethasone stimulation and GILZ protein mainly expressed in cell cytoplasm of 9HTE0cells.The phosphorylation of Raf-1，Mek1/2，Erk1/2 protein of which Dexamethasone inhibited the expression rebounded after GILZ-SiRNA was transfected.ConclusionGlucocorticoid as the fist line treatment of asthma induced the expression of GILZ that played a certain anti-inflammatory effect，but GILZ inhibited the activation of MAPK signaling pathway which promoted the repair process of airway epithelial cells.This provided a theoretical basis for new therapeuticmeasures of clinical research in asthma.

Glucocorticoid;GILZ;Airway epithelial cell;MAPK;Asthma

R725.6

A

1000-484X(2012)08-0737-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.014①本文受國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81070014)和重慶市衛(wèi)生局重點(diǎn)項(xiàng)目(2010-01-46)資助

②重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400014

劉靜月(1985年-)，女，在讀博士，主要從事哮喘發(fā)病機(jī)

理及防治的研究，E-mail:liujingyue219@yahoo.com.cn;通訊作者及指導(dǎo)教師:符 州(1963年-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事小兒呼吸疾病的研究，E-mail:fu_ zhou79@yahoo.com.cn。