Rab7負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞中CpG誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)①

王 娜 王玉珍 萬(wàn)永青 謝基明 康鴻斌 劉春霞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

Rab7負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞中CpG誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)①

王 娜 王玉珍 萬(wàn)永青 謝基明②康鴻斌③劉春霞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

目的:研究Rab7過(guò)表達(dá)及失活突變(Rab7T22N)對(duì)CpG刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中分泌細(xì)胞因子的影響。方法:采用RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中Rab7在CpG刺激下表達(dá)模式。將Rab7真核表達(dá)質(zhì)粒及失活突變質(zhì)粒Rab7T22N通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，G418穩(wěn)定篩選，Western法鑒定表達(dá)效果。用CpG刺激穩(wěn)定表達(dá)Rab7的RAW264.7細(xì)胞系，RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IFN-β的表達(dá)量變化。結(jié)果:CpG刺激RAW264.7后，Rab7 mRNA表達(dá)水平逐漸增高，在8小時(shí)達(dá)到高峰，表達(dá)增高近4倍。Rab7過(guò)表達(dá)后，CpG刺激后產(chǎn)生的IL-6、IL-1β、IFN-β顯著降低。巨噬細(xì)胞中Rab7失活突變后，在CpG刺激后IL-6、IL-1β、IFN-β的表達(dá)又顯著增加。結(jié)論:CpG促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞中Rab7 mRNA的表達(dá)，Rab7抑制了CpG刺激的巨噬細(xì)胞中IL-6、IL-1β、IFN-β的表達(dá)，該抑制作用的發(fā)揮與其酶活性的GTP結(jié)合有關(guān)。該研究為進(jìn)一步闡明Rab7在CpG/TLR9信號(hào)通路中的作用奠定了基礎(chǔ)。

Rab7;CpG;Rab7T22N;RAW264.7細(xì)胞

Rabs(Ras related proteins in brain)蛋白是Ras樣GTP酶超家族中一個(gè)較大分支。Rab蛋白家族成員的一個(gè)顯著特征是特異的定位于細(xì)胞質(zhì)中的某些亞細(xì)胞器，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)所有的膜運(yùn)輸過(guò)程[1]。Rab蛋白能在 GDP結(jié)合的非活性形式和GTP結(jié)合的活性形式之間轉(zhuǎn)換，調(diào)控著囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，如囊泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、錨著以及融合等過(guò)程。

Rab7屬Rab蛋白家族，在早期內(nèi)體到晚期內(nèi)體以及晚期內(nèi)體到溶酶體的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了重要的作用[2]。Rab7通過(guò)促進(jìn)溶酶體的運(yùn)輸還可以清除胞內(nèi)病毒[3]。Rab7除了調(diào)控內(nèi)吞過(guò)程的晚期運(yùn)輸外，還參與了受體的轉(zhuǎn)運(yùn)，如將血管緊張素Ⅱ受體1A、表皮生長(zhǎng)因子受體轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解[4，5]。但關(guān)于Rab7是否或怎樣參與調(diào)節(jié)天然免疫中TLR9信號(hào)通路還有待探索。

CpG DNA是細(xì)菌、分枝桿菌和其它原核生物DNA中含有的一些具有免疫學(xué)活性的短核苷酸序列，大多含有非甲基化的CpG結(jié)構(gòu)[6]，它與人工合成的寡脫氧核糖核酸CpG ODN均可以刺激多種哺乳動(dòng)物的免疫細(xì)胞。大量的研究表明，CpG具有種屬特異性，即不同序列的CpG具有不同的免疫活性，相同序列的CpG對(duì)于不同動(dòng)物的免疫活性也不同。國(guó)內(nèi)外的研究人員經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)，明確了5′-GACGTT-3′的CpG基序是對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞最具有免疫增殖效應(yīng)的，而對(duì)人的淋巴細(xì)胞有最佳刺激活性的是5′-GTCGTT-3′，5′-TCCATCACGTTCCTGACGTT-3′(CpG1826)和5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′(CpG2006)。且CpG誘導(dǎo)的活化效應(yīng)是由TLR9介導(dǎo)的[7]。TLRs是一類重要的模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRR)，主要是通過(guò)識(shí)別病原微生物中保守的病原體相關(guān)的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，從而構(gòu)成了機(jī)體免疫反應(yīng)的第一道防線[8]。然而，TLRs的過(guò)分活化或者活化不正常則可能使自身免疫疾病惡化，或?qū)е孪到y(tǒng)性細(xì)胞因子的大量釋放而導(dǎo)致機(jī)體死亡[9]。例如DNA-Ig免疫復(fù)合體可使TLR9活化且產(chǎn)生過(guò)量的Ⅰ型干擾素，可以引起系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生[10]。因此，為了防止TLRs的不恰當(dāng)活化，對(duì)于TLRs信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。

本試驗(yàn)采用小鼠單核/巨噬細(xì)胞株RAW264.7作為模型，研究Rab7在TLR9配體CpG刺激下的表達(dá)模式;并通過(guò)構(gòu)建的Rab7的過(guò)表達(dá)和失活突變載體，研究Rab7過(guò)表達(dá)和失活突變后對(duì)CpG激活的巨噬細(xì)胞RAW264.7中Ⅰ型干擾素和炎性因子的影響。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究Rab7在TLR9信號(hào)通路中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù);DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司;含有CpG基序的寡核苷酸序列CpG ODN(5′-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3′)，由上海生工生物工程有限公司合成，全鏈硫代修飾; Rab7抗體，actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;細(xì)胞總RNA抽提試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶來(lái)自TaKaRa;SYBR RTQ-PCR試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞株接種于含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中;置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 天傳代一次。pcDNA3.1、pcDNA3.1/mRab7、pcDNA3.1/tRab7三種質(zhì)粒參照Lipofectamine 2000的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用800 μg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基穩(wěn)定篩選。置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2天傳代一次。

1.3 細(xì)胞總RNA的提取，cDNA的制備及定量分析 總RNA采用Trizol試劑根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行抽提。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，測(cè)定RNA濃度后用1 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR和Real-time PCR使用的引物序列為:Rab7-sense:5′-ACAATAGGAGCGGACTTTCTGACC-3′;Rab7-antisence: 5′-TTGGCACTGGTCTCGAAGTAAGG-3′;IL-6-sence:5′-TTCTTGGGACTGATGCTG-3′;IL-6-antisence:5′-GAC TCTGGCTGGCTTTGTCTTTCT-3′;IL-1β-sence:5′-TTGGGGTCC GTCAACTTC-3′;IL-1β-antisence:5′-CTAATAGGCTCATCTGGG-3′;IFN-β-sence:5′-CGTTCCTGCTGTGCTTCT-3′;IFN-β-antisence:5′-GTCCGCCCTGTAGGTGAG-3′。Real-time PCR 采 用 ABI 7300 (Applied Bio-systems，USA)和 SYBR RT-PCR kit檢測(cè)分析，計(jì)算方法采用 2-ΔΔct法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著差異，P＜0.01時(shí)認(rèn)為具有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 CpG刺激 RAW264.7細(xì)胞后 Rab7 mRNA水平表達(dá)時(shí)效關(guān)系研究 本實(shí)驗(yàn)首先研究在CpG誘導(dǎo)TLR9信號(hào)通路時(shí)是否會(huì)影響Rab7的表達(dá)。通過(guò)CpG刺激RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間后用RT-PCR研究Rab7 mRNA的表達(dá)變化。如圖1A所示，CpG刺激后Rab7的mRNA表達(dá)水平在8小時(shí)的時(shí)候表達(dá)量最高，Rab7 mRNA表達(dá)水平的總體趨勢(shì)為先增高后再恢復(fù)。接著我們通過(guò)Real-time PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。如圖1B所示，CpG刺激4小時(shí)后Rab7的表達(dá)水平是初始表達(dá)的兩倍多，而8小時(shí)時(shí)Rab7的表達(dá)水平達(dá)到最高，是初始表達(dá)的4倍。以上結(jié)果均顯示CpG正向調(diào)控Rab7的表達(dá)。由此我們推測(cè)Rab7可能參與了CpG/TLR9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Rab7的表達(dá) 將篩選好的穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株通過(guò)Western blot進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞株是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染Rab7過(guò)表達(dá)和失活突變質(zhì)粒的細(xì)胞Rab7的表達(dá)量明顯大于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞。因此可以說(shuō)明三種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株均可以使用。

2.3 Rab7抑制CpG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IL-6和IL-1β的表達(dá) 為了闡明Rab7在CpG誘導(dǎo)的TLR9的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，我們首先觀察了Rab7對(duì)CpG刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。IL-6、IL-1β的分泌主要是受MyD88依賴的途徑調(diào)控。如圖3和圖4所示，Rab7過(guò)表達(dá)后，顯著地抑制了CpG誘導(dǎo)的 RAW264.7細(xì)胞 IL-6、IL-1β的分泌。相反的，失活突變的Rab7可以促進(jìn)IL-6、IL-1β的分泌。這些結(jié)果說(shuō)明，Rab7對(duì)CpG誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞IL-6、IL-1β的抑制作用依賴于其與GTP結(jié)合的活性形式。

2.4 Rab7抑制了CpG誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá) 前面的研究結(jié)果顯示，Rab7能夠通過(guò)結(jié)合GTP的活性形式抑制CpG誘導(dǎo)的IL-6和IL-1β的分泌，而這兩個(gè)細(xì)胞因子的釋放是依賴TLR9-MyD88信號(hào)通路的。而IFN-β是受轉(zhuǎn)錄因子IRF7調(diào)控，因此，我們通過(guò)RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)了Rab7過(guò)表達(dá)和失活突變后對(duì)CpG刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生的影響。如圖5A、B所示，Rab7過(guò)表達(dá)后，顯著地抑制了 IFN-β的表達(dá)，而失活突變的Rab7卻能促進(jìn)IFN-β的表達(dá)，說(shuō)明Rab7對(duì)CpG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IFN-β的抑制作用依賴于其與GTP結(jié)合的活性形式。

圖1 CpG刺激RAW264.7不同時(shí)間后Rab7的變化Fig.1 Detection of Rab7 expression in RAW264.7 macrophages with CpG stimulation for indicated time

圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Rab7表達(dá)水平圖Fig.2 Detection of Rab7 expression in transformed cells

圖3 Rab7抑制了RAW264.7細(xì)胞中CpG誘導(dǎo)的IL-6的表達(dá)Fig.3 Rab7 inhibited the expression of IL-6 in RAW 264.7 after stimulation with CpG

圖4 Rab7抑制了RAW264.7細(xì)胞中CpG誘導(dǎo)的IL-1β的表達(dá)Fig.4 Rab7 inhibited the expression of IL-1β in RAW 264.7 after stimulation with CpG

圖5 Rab7抑制了RAW264.7細(xì)胞中CpG誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)Fig.5 Rab7 inhibited the expression of IFN-β in RAW 264.7 after stimulation with CpG

3 討論

Rabs蛋白家族的一個(gè)顯著特征是能夠在GTP結(jié)合的活性形式和GDP結(jié)合的非活性形式之間轉(zhuǎn)換。在之前Rab7的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，將Rab7第22位的蘇氨酸(T)突變?yōu)樘於０?N)即Rab7T22N后，該突變體可以降低與GDP/GTP的親和力，Rab7表現(xiàn)為功能喪失。即野生型Rab7能夠與GTP結(jié)合，而突變體 Rab7T22N不能與 GTP結(jié)合，因此Rab7T22N被稱為失活突變體[11]。但關(guān)于Rab7以及Rab7T22N與TLR9信號(hào)通路之間的關(guān)系，還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)之前構(gòu)建的Rab7過(guò)表達(dá)和突變體，研究Rab7過(guò)表達(dá)和失活突變后對(duì)CpG激活的巨噬細(xì)胞RAW264.7中Ⅰ型干擾素和前炎性因子的影響，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Rab7能夠抑制CpG誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)，該研究為Rab7與TLR9的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)打下了基礎(chǔ)。

TLRs受體是一類古老的天然免疫受體，先前的研究表明，TLR9被其相應(yīng)的配體激活后通過(guò)依賴MyD88的信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒作用。TLR9除了依賴 MyD88-IRAK-TRAF6-TAK1-NF-κB/MAPKs 信號(hào)通路產(chǎn)生炎性因子、共刺激分子和趨化因子之外，也依賴MyD88-IRAKs-IRF7信號(hào)通路誘導(dǎo)Ⅰ-IFN等多種細(xì)胞因子的釋放[12，13]。通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Rab7參與了TLR9信號(hào)通路的調(diào)控，這為Rab家族其他成員的功能研究提供了新的思路。其次還發(fā)現(xiàn)Rab7過(guò)表達(dá)后不僅抑制了前炎癥因子IL-6、IL-1β的表達(dá)，同時(shí)也抑制了Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生，而將Rab7失活突變后卻可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。說(shuō)明Rab7發(fā)揮作用依賴于其GTP的結(jié)合活性。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的TLR9的負(fù)向調(diào)控因子Rab7，該結(jié)果對(duì)進(jìn)一步深入研究TLR9引起的生物效應(yīng)與相應(yīng)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制提供了新的線索和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2012-01-09 修回2012-03-16]

(編輯 倪 鵬)

Rab7 negatively regulates cytokines expression in macrophages induced by CpG

WANG Na，WANG Yu-Zhen，WAN Yong-Qing，XIE Ji-Ming，KANG Hong-Bin，LIU Chun-Xia.College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China

Objective:To analyze the effect of Rab7 overexpression or overexpression of dominant negative mutant form of Rab7 (Rab7T22N)on the production of cytokines in RAW264.7 macrophages induced by CpG.MethodsRT-PCR and Real-time PCR was used to measure the induced expression pattern of Rab7 in RAW264.7 cells stimulated by CpG.The eukaryotic expression vector of Rab7 and Rab7T22N were transfected into RAW264.7 cells by the methods of liposome，and screened by G418.The constant overexpression of Rab7 was verified by Western blot.The production of IL-6，IL-1β and IFN-β were measured with RT-PCR and Real-time PCR after transfected RAW264.7 cells were stimulated by CpG.ResultsThe Rab7 mRNA expression in RAW264.7 cells was gradually increased after stimulated with CpG，and the peak expression was at 8h，with about 4 times as much as the base expression.Overexpression of Rab7 inhibited CpG induced expression of IL-6，IL-1β and IFN-β in RAW264.7 cells.However，overexpression of Rab7T22N significantly promoted the expression of the above cytokines in RAW264.7 macrophages induced by CpG.ConclusionCpG induced the expression of Rab7 mRNA in RAW264.7 cells.Rab7 inhibits the expression of IL-6，IL-1β and IFN-β in CpG stimulated Raw264.7 cells.The inhibition effect of Rab7 is associated with the enzyme activity of GTP-binding.The experiments may lay a foundation for further study of the role of rab7 in CpG/TLR9 signaling pathways.

Rab7;CpG;Rab7T22N;RAW264.7 cell

R392.11

A

1000-484X(2012)08-0681-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.002

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(30801001)和內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010MS0513，2011MS1112)

②內(nèi)蒙古醫(yī)院檢驗(yàn)科，呼和浩特010020

③內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，呼和浩特010050

王 娜(1986年-)，女，在讀碩士，主要從事天然免疫調(diào)控方面的研究，E-mail:wangna1986320@163.com;

及指導(dǎo)教師:王玉珍(1976年-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然免疫調(diào)控方面的研究，E-mail: wangyuzhen817@eyou.com。

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