鞘氨醇激酶通過調(diào)控血管發(fā)生促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移

賽巖，代學(xué)強(qiáng)，白紀(jì)民，劉勇，常菁，范禮斌，崔春萍

鞘氨醇激酶通過調(diào)控血管發(fā)生促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移

賽巖，代學(xué)強(qiáng)，白紀(jì)民，劉勇，常菁，范禮斌，崔春萍

目的確定鞘氨醇激酶（SPK）在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用。

方法用 Ad-SPK1 腺病毒感染肝癌細(xì)胞 LM-3 使其 SPK過表達(dá)，Western blot 檢測(cè) SPK1 表達(dá)及激活情況；Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移情況。體外管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè) SPK 對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）管狀化形成的影響。建立 SPK 過表達(dá)裸鼠模型，體內(nèi)檢測(cè)肝癌遷移情況。

結(jié)果在體外 SPK 對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移無顯著影響；Ad-SPK 能夠促進(jìn) HUVEC 管狀結(jié)構(gòu)形成；裸鼠皮下移植瘤結(jié)果顯示 Ad-SPK 促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

結(jié)論鞘氨醇激酶通過調(diào)控血管發(fā)生促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。

疾病模型，動(dòng)物； 肝腫瘤； 腫瘤移植； 移植，異種； 鞘氨醇激酶

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 BALB/c 裸鼠，雌性，4 周齡，體重 16 ～ 18 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院 SPF 級(jí)動(dòng)物房。人肝癌細(xì)胞 LM-3 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購(gòu)自中國(guó)協(xié)和細(xì)胞庫(kù)；人胚腎細(xì)胞（HEK293）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑與儀器 BCA-200 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó) Pierce 公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)公司；DMEM 培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；ECM 培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物（ECGS）均購(gòu)自美國(guó) ScienCell 公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；基質(zhì)膠（Matrigel 膠）購(gòu)自美國(guó) BD 公司；SPK1 抗體購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司；GAPDH 抗體購(gòu)自中杉金橋公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭＜?xì)胞培養(yǎng)器材購(gòu)自美國(guó) Costar 公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀為美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Ad-SPK 的擴(kuò)增、純化及滴度的測(cè)定 將HEK293 細(xì)胞接種于 150 mm 平皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至 90% 匯合狀態(tài)時(shí)，加入 Ad-SPK1 病毒，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）約為 10 個(gè)蝕斑形成單位（plaque forming unit，pfu）/細(xì)胞[7]，36 ～ 48 h 后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)完全病變（CPE）時(shí)，收集細(xì)胞，凍存于 -70 ℃，待累計(jì)到 50 ～ 60 個(gè)平皿時(shí)，統(tǒng)一純化病毒。

將出現(xiàn) CPE 的 HEK293 細(xì)胞于 -70 ℃ 和37 ℃ 之間反復(fù)凍融 3 次，2500 r/min 離心 10 min，除去細(xì)胞碎片；配制 CsCl 密度梯度液，將凍融后的待純化病毒液加于各管的 CsCl 梯度液之上；10 ℃，136 000 ×g離心 1.5 h，于 1.35 g/ml CsCl溶液和 1.25 g/ml CsCl 溶液之間出現(xiàn)白色霧狀病毒帶；收集病毒帶，并與 1.35 g/ml CsCl 溶液混合，10 ℃，136 000 ×g離心 5.5 h，進(jìn)一步純化病毒，以 PBS 液為透析液于 4 ℃ 透析病毒，每 2 小時(shí)更換一次透析液，共換 5 次；取出純化的病毒液，加無菌甘油至終濃度為 10%，分裝，-70 ℃ 保存。用 TCID50 法測(cè)定病毒滴度（IU/ml）[8]。

1.2.2 細(xì)胞的感染效率確定 為評(píng)價(jià) Ad-SPK 的感染效率，以 Ad5/F11p-GFP（劉楊博士提供，感染滴度 1.0 × 1010pfu/ml）為對(duì)照，分別用 0、50、100、150、200 MOI 感染肝癌細(xì)胞 LM-3和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC，2 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)[9]。

1.2.3 SPK 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及激酶活性鑒定 用腺病毒 Ad-SPK 感染 LM-3 細(xì)胞。48 h 和72 h 后收集細(xì)胞，棄上清，加入冰預(yù)冷的 1 ml PBS重懸細(xì)胞，500 ×g離心 10 min，吸凈上清，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液；4 ℃ 放置 30 min 以上使細(xì)胞徹底裂解，隨后 16 000 ×g、4 ℃ 離心 30 min，收集上清。蛋白定量后，進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，置于 5% 脫脂牛奶中封閉，用 SPK 多克隆抗體檢測(cè) LM-3 細(xì)胞中SPK 的表達(dá)及 Ad-SPK 對(duì) LM-3 細(xì)胞中 SPK 的激活情況[10]。

1.2.4 Transwell 和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移情況 Transwell：24 孔板下室加入 600 μl 含 5%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，將小室嵌入。Ad-SPK 感染 LM-3 細(xì)胞 36 h 后，胰酶消化細(xì)胞，使?jié)舛葹? × 106個(gè)/ml，懸于 2% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中，每孔加入 200 μl；37 ℃ 常規(guī)培養(yǎng) 12 ～ 48 h；將 Transwells 轉(zhuǎn)移至另一加有 4% 多聚甲醛的孔中，固定細(xì)胞 15 min；結(jié)晶紫染色 10 min；用棉簽輕輕擦去膜上未遷移細(xì)胞，光鏡下觀察結(jié)果[11]。

劃痕實(shí)驗(yàn)：用馬克筆在 6 孔板背面畫橫線。Ad-SPK 感染 LM-3 細(xì)胞 36 h 后且細(xì)胞匯合率100%，劃痕，PBS 洗 2 遍；無血清 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后顯微鏡下觀察劃痕距離[12]。

1.2.5 HUVEC 體外管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn) 用添加ECGS 的 ECM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) HUVEC，待細(xì)胞長(zhǎng)至密度 70% ～ 80%，PBS 輕洗 4 ～ 5 次后加入無血清無生長(zhǎng)因子的 ECM 培養(yǎng)基 10 ml。收集培養(yǎng) 24 h 后的條件培養(yǎng)基，500 ×g，4 ℃ 離心10 min，除去死細(xì)胞。將上清轉(zhuǎn)移 EP 管中 -80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將 Matrigel 膠放于冰水中，置于 4 ℃ 冰箱過夜，使膠完全融化[13]。并預(yù)冷所需的吸管、槍頭和培養(yǎng)板；將培養(yǎng)板放在冰上，將膠混勻，用遇冷的無血清無生長(zhǎng)因子的 ECM 培養(yǎng)基將 Matrigel 膠稀釋為 30% 的濃度。按 50 μl/cm2比例將膠液加入培養(yǎng)板中；將培養(yǎng)板置于 37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱，放置 1 h，使膠凝固。將無血清無生長(zhǎng)因子的 ECM 培養(yǎng)基與收集的條件培養(yǎng)基等比例混合，加入胎牛血清，使其濃度達(dá)到 10% ～ 20%，將該混合物加到凝固的 Matrigel 膠上。按每孔 1.5 × 105個(gè)/100 μl 加入細(xì)胞，6 h 后顯微鏡下觀察結(jié)果[14]。

1.2.6 SPK 過表達(dá)裸鼠模型的建立及組織學(xué)檢測(cè) 皮下種植：選取 4 周齡雌性 BALB/c 裸鼠12 只，分為 Ad-SPK-LM-3 組與 Ad-null-LM-3組，每組 6 只。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞 LM-3，分別感染 Ad-SPK和 Ad-null 36 h 后消化計(jì)數(shù)，PBS 洗滌 2 次，重懸于 PBS 中制備成濃度為 1 ×107個(gè)/100 μl 的細(xì)胞懸液。以 100 μl/只的細(xì)胞懸液接種于裸鼠左前肢腋下[15]，3 d 后觀察皮下成瘤情況。接種 7 d 后，瘤體成型，此時(shí)瘤內(nèi)注射腺病毒[16-17]。每周注射 2 次至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。7 周后頸椎脫臼法處死小鼠，將腫瘤組織剝離，取出肝臟和肺臟固定于 10% 緩沖福爾馬林液中 48 h，將肺臟每隔 2 mm 水平剖開查找轉(zhuǎn)移灶，進(jìn)行脫水、包埋、切片、HE 染色。

尾靜脈注射：選取 4 周齡雌性 BALB/c 裸鼠12 只，分為 Ad-SPK-LM-3組與 Ad-null-LM-3組，每組 6 只。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞 LM-3，分別感染 Ad-SPK 和 Ad-null 36 h 后消化計(jì)數(shù)，PBS 洗滌 2 次，重懸于 PBS 中制備成濃度為 1 ×106個(gè)/100 μl 的細(xì)胞懸液。以 100 μl/只的細(xì)胞懸液注射于裸鼠尾靜脈[18-19]。7 d 后，尾靜脈注射腺病毒。每周注射 2 次至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。4 周后頸椎脫臼法處死小鼠，取出肝臟和肺臟固定于 10% 緩沖福爾馬林液中 48 h，將肺臟每隔 2 mm 水平剖開查找轉(zhuǎn)移灶，進(jìn)行脫水、包埋、切片、HE 染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SAS 8.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果的比較采用 Student’st檢驗(yàn)，均以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒的感染滴度

重組腺病毒在 HEK293 細(xì)胞中大量擴(kuò)增（圖1），收集細(xì)胞，釋放出病毒。經(jīng) CsCl 密度梯度和連續(xù)密度超速離心，獲得高度濃縮的腺病毒帶。感染滴度為 1.0 × 1011pfu/ml。

2.2 Ad5/F11P-GFP 對(duì) LM-3 細(xì)胞和 HUVEC 細(xì)胞的感染效率

結(jié)果如圖 2所示：隨著 MOI 的增加 Ad5/F11P-GFP 對(duì) LM-3 細(xì)胞和 HUVEC 細(xì)胞的感染效率增加，在 50 MOI 時(shí)均高達(dá) 90% 以上，說明Ad5/F11P 腺病毒載體對(duì)細(xì)胞的感染效率滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖 1 HEK293 細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)（A：正常細(xì)胞；B：病變區(qū)域）Figure 1 HEK293 cells with CPE (A: HEK293 cells; B:CPU)

2.3 SPK 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

肝癌細(xì)胞 LM-3 中的 SPK 活性高于正常細(xì)胞，利用這株細(xì)胞為模型，檢測(cè) Ad-SPK 對(duì) SPK的激活情況。結(jié)果如圖 3 所示：Ad-SPK 能有效激活 SPK酶活性。

2.4 Ad-SPK 對(duì) LM-3 細(xì)胞的遷移的影響

結(jié)果如圖 4、圖 5 所示：Ad-SPK 感染 LM-3細(xì)胞 36 h 后對(duì)細(xì)胞遷移并沒有顯著影響。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穿過小室的細(xì)胞并無明顯增加；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示未促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移。

圖 2 Ad5/F11P-GFP 對(duì)細(xì)胞的感染效率Figure 2 Cells were transfected with Ad5/F11P-GFP

圖 3 Ad-SPK 對(duì) LM-3 細(xì)胞 SPK 酶活性的激活Figure 3 Activation of SPK by Ad-SPK

圖 4 SPK 誘導(dǎo) LM-3 細(xì)胞的遷移[A：光學(xué)顯微鏡下觀察的細(xì)胞遷移結(jié)果（100 ×）；B：鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果]Figure 4 The effect of SPK to migration ability of LM-3 cells (A: The result of LM-3 cell migration; B: The result of LM-3 cell count)

2.5 Ad-SPK 促進(jìn) HUVEC 細(xì)胞管狀化結(jié)構(gòu)形成

用腺病毒 Ad-SPK 感染 HUVEC 24 h 后，收集細(xì)胞進(jìn)行管狀化實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果如圖 6 所示，50 MOI Ad-SPK 感染能夠顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞的成管。

圖 5 SPK 誘導(dǎo) LM-3 細(xì)胞的遷移光學(xué)顯微鏡下觀察的細(xì)胞遷移結(jié)果（100 ×）2.0 mmFigure 5 The effect of SPK to migration ability of LM-3 cell

2.6 Ad-SPK 在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)脫臼法處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，去除表面脂類和結(jié)締組織，如圖 7A?？梢娏鲶w表面光滑，表面被一層薄膜包裹，形狀不規(guī)則，質(zhì)軟。統(tǒng)計(jì)腫瘤體積和重量如圖 7B。結(jié)果顯示 Ad-SPK 在體內(nèi)明顯促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，隨瘤內(nèi)注射病毒刺激7 周后移植瘤體積明顯高于正常組。其稱重結(jié)果顯示，正常組較病毒組輕。

2.7 Ad-SPK 在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)脫臼法處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，去除表面脂類和結(jié)締組織，如圖 7A。可見瘤體表面光滑，表面被一層薄膜包裹，形狀不規(guī)則，質(zhì)軟。統(tǒng)計(jì)腫瘤體積和重量如圖 7B。結(jié)果顯示 Ad-SPK 可在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，瘤內(nèi)注射病毒刺激 7 周后移植瘤體積明顯高于對(duì)照給藥組。稱重結(jié)果顯示，對(duì)照給藥組較病毒組輕 40% 左右。HE 染色結(jié)果顯示肝肺部均未見轉(zhuǎn)移。

2.8 Ad-SPK 在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)脫臼處死小鼠，將肺臟每隔 2 mm水平剖開查找轉(zhuǎn)移灶，Ad-null-LM-3 組 6 只小鼠肺部切面正常；Ad-SPK-LM-3 組 6 只小鼠中 4 只可見灰白色粟粒狀結(jié)節(jié)。取全部小鼠肝臟和肺臟做HE 切片染色如圖 8，肝臟中均無明顯轉(zhuǎn)移灶；尾靜脈注射病毒組在肺部發(fā)現(xiàn)多處轉(zhuǎn)移灶，對(duì)照給藥組未見轉(zhuǎn)移灶。

圖 6 SPK 對(duì) HUVEC 細(xì)胞管狀化結(jié)構(gòu)形成的影響（100 ×）（NC：DMEM 培養(yǎng) HUVEC 組；CON：正常 HUVEC 組；SPK：Ad-SPK 感染 HUVEC 組）Figure 6 Effect of SPK on the tubular morphogenesis of HUVEC cells (100 ×).The cells were stimulated with Ad-SPHK (MOI 50)and plated on the Matrigel-coated 24-well plate; NC: DMEM culture; CON: Control group; SPK: SPK treat group

圖 7 移植瘤的體積和重量統(tǒng)計(jì)[A：皮下移植瘤的大體觀察；B：移植瘤的體積和重量（SPK：Ad-SPK 給藥組；CON：Ad-null 對(duì)照給藥組）]Figure 7 Volume and weight of the transplantation tumors of SPK and control groups [A: Observation of tumor; B: Volume and weight of the transplantation tumors (SPK: Ad-SPK treat group; CON: Ad-null treat group)]

圖 8 裸鼠肺臟 HE 染色（紅色箭頭：轉(zhuǎn)移灶）Figure 8 Histology of lung sections (HE stain, original magnification ×400; Red-arrow: observed in lung sections of tumor)

3 討論

磷脂代謝產(chǎn)生多種磷脂代謝產(chǎn)物，如神經(jīng)酰胺、SPK、S1P 等。SPK 是細(xì)胞內(nèi)合成 S1P 的關(guān)鍵酶，它可以使 SPK 磷酸化生成 S1P，是細(xì)胞增殖及存活的重要信號(hào)分子。S1P 在人胃腺癌細(xì)胞的增殖中起著極其關(guān)鍵的調(diào)控作用[20]。在氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）誘發(fā)的小鼠腸腺癌中，SPK 在 mRNA 水平的表達(dá)增高，說明 SPK/S1P信號(hào)途徑與結(jié)腸癌的發(fā)生是密切相關(guān)的[21]。

SPK 與肝癌相關(guān)報(bào)道仍不多見，肝臟是磷脂類代謝的重要器官，SPK/S1P 作為細(xì)胞微環(huán)境的重要信號(hào)途徑之一，其調(diào)節(jié)肝癌發(fā)生發(fā)展的作用和機(jī)制并不清楚。目前許多研究只停留在體外試驗(yàn)，還有一些問題需要進(jìn)一步研究，例如 SPK 與腫瘤的關(guān)系，本文就 SPK/S1P 信號(hào)通路和肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系作為研究重點(diǎn)，在體內(nèi)外研究 SPK 與肝癌轉(zhuǎn)移是否存在聯(lián)系。

在體外實(shí)驗(yàn)中，我們用 Ad-SPK 感染肝癌細(xì)胞系 LM-3，使其高表達(dá) SPK，用 Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移情況。結(jié)果顯示，SPK 在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)并不能明顯促進(jìn)其遷移。但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們卻發(fā)現(xiàn) Ad-SPK 可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。我們推斷 SPK 可能是通過調(diào)控血管發(fā)生促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中首先我們用 Ad-SPK 感染 LM-3 細(xì)胞 36 h，收集細(xì)胞接種于裸鼠皮下。因?yàn)橄俨《?Ad-SPK 不能長(zhǎng)期穩(wěn)定使 SPK 高表達(dá)，所以待成瘤后我們于瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射病毒以使其持續(xù) SPK 高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死小鼠發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍血管豐富，腫瘤體積及重量都有明顯區(qū)別，但體內(nèi)轉(zhuǎn)移并不明顯。之后我們同樣處理的細(xì)胞給裸鼠尾靜脈注射。據(jù)文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道，肝癌細(xì)胞尾靜脈注射約 5 ～ 6 周發(fā)生轉(zhuǎn)移，鑒于肝癌本身具備高轉(zhuǎn)移性，本研究中尾靜脈注射小鼠 4 周處死，擬選擇這個(gè)時(shí)間點(diǎn)是為了使 Ad-null-LM-3 組與Ad-SPK- LM-3 組產(chǎn)生明顯區(qū)別。處死小鼠后，將肺部每隔 2 mm 水平剖開查找轉(zhuǎn)移灶，Ad-null-LM-3 組 6 只小鼠肺部切面正常；Ad-SPK-LM-3組 6 只小鼠中 4 只可見灰白色粟粒狀結(jié)節(jié)。HE染色后 Ad-null-LM-3 組切片中未明顯轉(zhuǎn)移灶，但尾靜脈補(bǔ)注 Ad-SPK 組肺部見多處轉(zhuǎn)移灶。

大量研究表明，VEGF 在肝癌組織中表達(dá)較肝硬化和正常肝組織顯著增高[24]。VEGF 高表達(dá)有利于原發(fā)性肝癌的復(fù)發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且與肝癌的臨床病理特征密切相關(guān)。文獻(xiàn)[25]報(bào)道，在內(nèi)皮細(xì)胞及膀胱癌細(xì)胞中，VEGF 可以通過蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）激活 SPK 信號(hào)途徑，表明 SPK/S1P 參與 VEGF 的信號(hào)傳導(dǎo)，但 SPK/S1P是否參與調(diào)節(jié) VEGF 的表達(dá)和其在肝癌細(xì)胞信息傳導(dǎo)通路間的相互作用仍不清楚。人肝癌細(xì)胞HepG2 能夠合成和分泌 VEGF，而且經(jīng)不同濃度的 DMS 作用 12 h 后，其 VEGF 的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少。因此，在肝癌細(xì)胞中，SPK/S1P 信號(hào)途徑是調(diào)節(jié) VEGF 信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑之一[26-27]。所以我們用 Ad-SPK 感染 HUVEC，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SPK 可以明顯促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管狀化形成，較未處理的 HUVEC 管狀化密度更大。該結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

在體內(nèi)研究中，我們通過注射 Ad-SPK 促進(jìn)其VEGF 表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。SPK/S1P 是維持細(xì)胞存活的重要分子，并且參與了肝癌細(xì)胞的增殖及腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)過程。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):171-177

Sphingosine kinase promote HCC metastasis via regulation of angiogenesis

SAI Yan, DAI Xue-qiang, BAI Ji-min, LIU Yong, CHANG Jing, FAN Li-bin, CUI Chun-ping

ObjectiveTo determine the role of sphingosine kinase (SPK) in hepatocyte carcinoma (HCC) metastasis.

MethodsThe expression and activation of SPK in Ad-SPK infected LM-3 HCC cell line was detected by Western blot; and HCC cells migration was evaluated by Transwell and scar-healing experiments.The impact of SPK on HUVEC tube morphologenesis was examined byin vitrotube formation assay.The SPK-overexpressing nude mice model was established to access HCC metastasisin vivo.

ResultsSPK did not influence significantly HCC cells migrationin vitro; HUVEC tube formation was stimulate by Ad-SPK.Ad-SPK accelerated the tumor growth and metastasisin vivo.

Conclusion Sphingosine kinase promotes the HCC metastasis via regulating angiogenesis.

Disease models, animal; Liver neoplasms; Neoplasm transplantation; Transplantation, heterologous;Sphingosine kinase

s: FAN Li-bin, Email: lfan@ahmu.edu.cn; CUI Chun-ping, Email: cui_chunping2000@yahoo.com.cn

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(3):171-177

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）流行性廣、病程短、病死率高，是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病。2010年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示我國(guó)每年約有34.4 萬人死于肝細(xì)胞癌，占全球肝癌死亡人數(shù)的55%[1]。因此，深入研究肝癌發(fā)病機(jī)制并開發(fā)新的治療策略是關(guān)系人類健康的重大科學(xué)問題。

肝癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移特性是影響腫瘤患者生存和預(yù)后的關(guān)鍵因素，基質(zhì)膠原纖維的降解、腫瘤細(xì)胞的遷移、腫瘤血管形成等過程參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移[2]。在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，鞘磷脂的代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）、神經(jīng)鞘氨醇（sphingosine，Sph）和 1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）發(fā)揮著極為重要的作用，它們調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、存活和凋亡[3]。在細(xì)胞內(nèi)，這些代謝產(chǎn)物可以相互轉(zhuǎn)化，鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SPK）則是維系 Cer、Sph 和 S1P 三者間代謝平衡的關(guān)鍵酶，具有調(diào)節(jié) Cer 和 S1P 的雙重功能。SPK可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等多種與血管生成有關(guān)的細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，通過其表面受體EDGs 依賴的細(xì)胞骨架重組維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障的

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（30930041、30800558、81070330）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09102301-012）

230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院生物學(xué)教研室（賽巖、范禮斌）；100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（賽巖、代學(xué)強(qiáng)、白紀(jì)民、劉勇、常菁、崔春萍）

范禮斌，Email：lfan@ahmu.edu.cn；崔春萍，Email：cui_chunping2000@yahoo.com.cn

2012-02-20完整性[4]，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向血管樣結(jié)構(gòu)的形態(tài)轉(zhuǎn)變等，從而完成血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[5]。SPK在多種實(shí)體腫瘤中均有表達(dá)，如結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌，其基因具有癌基因的特征，并且通過SPK/S1P 信號(hào)途徑對(duì)腫瘤發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[6]。本文主要分析鞘氨醇激酶在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用。

Author Affiliations: Biology Laboratory of Life Science Academy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China (SAI Yan, FAN Li-bin); Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China (SAI Yan, DAI Xue-qiang,BAI Ji-min, LIU Yong, CHANG Jing, CUI Chun-ping)

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