絲裂霉素C對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響

吳曉明，孫 奎，張紅霞，許新華，孫喜平，楊景哲

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

增生性瘢痕是皮膚損傷后成纖維細(xì)胞(FB)增殖的結(jié)果，F(xiàn)B是合成、分泌大量膠原蛋白及其他細(xì)胞外基質(zhì)，而且是多種生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生者，它的過(guò)度增生及功能的亢進(jìn)是病理性瘢痕發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。在增生性瘢痕組織中及體外培養(yǎng)的增生性瘢痕FB中均發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞增殖調(diào)控及細(xì)胞程序性死亡方面的異常。2010年1～12月，本研究旨在探討絲裂霉素C(MMC)對(duì)增生性瘢痕FB增殖的影響及機(jī)制，為增生性瘢痕的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科手術(shù)治療的患者，增生性瘢痕患者無(wú)明顯創(chuàng)傷史，且增生性瘢痕都處于增生期，均經(jīng)臨床和病理確診。10例瘢痕增生標(biāo)本，其中男7例、女3例;部位分布:胸部6例，肩部2例，耳垂部1例，背部1例。

1.2 FB培養(yǎng) 將手術(shù)切下的增生性瘢痕組織采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下切除表皮及皮下脂肪，將標(biāo)本制成1 mm3左右的組織塊，置于培養(yǎng)瓶中，在95%空氣、5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)8～12 h。然后加入適量含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，3～4 d換液1次，2～3周后，原代細(xì)胞生長(zhǎng)成單層，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT法測(cè)定FB細(xì)胞的增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增生性瘢痕FB，用2.5 g/L胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104/mL，接種于3塊96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。常規(guī)培養(yǎng)FB 24 h后，吸去培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組，用DMEM培養(yǎng)液;MMC干預(yù)組，終末濃度分別為2.5、12.5、50、100、200 μg/mL。每孔加入各組溶液200 μL，每濃度復(fù)種8孔。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下分別各孵育24、48、72 h后，向每孔內(nèi)加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。倒置顯微鏡下觀察MTT結(jié)晶狀況，然后棄去孔內(nèi)上清液，每孔內(nèi)加入150 μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀下測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的光密度值，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，計(jì)算藥物作用于FB的生長(zhǎng)抑制率。抑制率=1－(實(shí)驗(yàn)藥物組 A490值/空白對(duì)照組 A490值)× 100%，最后以時(shí)間為X軸，抑制率為Y軸繪制生長(zhǎng)曲線，并獲得最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.4 Western blot方法檢測(cè)Smad7蛋白表達(dá)水平將待收集的FB以預(yù)冷的PBS液洗2次，加入100 μL預(yù)冷裂解液，冰浴30 min，刮勺收集樣本，4℃12 000 r/min離心20 min，取上清，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取蛋白濃度。取 15 μL蛋白質(zhì)經(jīng) 10% SDS2PAGE垂直凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h后，加入相應(yīng)的1∶2 000稀釋的Smad7，4℃過(guò)夜，TBST洗膜后，加入1∶2 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫作用1 h，TBST洗膜后，ECL增強(qiáng)發(fā)光，在暗室中將膜貼在X線膠片下曝光，常規(guī)方法顯影、定影，直至顯影出電泳帶。雜交信號(hào)在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行光密度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)資料以±s表示，進(jìn)行方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 增生性瘢痕FB細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)體外增生性瘢痕FB呈典型的梭形，走向趨于一致，多呈平行排列，細(xì)胞中央有圓形或卵圓形核，核質(zhì)比例高。見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖8。約10 d后細(xì)胞可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，進(jìn)行傳代。傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，3～4 d即可再次傳代。

2.2 MMC對(duì)增生性瘢痕FB增殖活性的影響 見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，2.5 μg/mL的MMC即對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，在200 μg/mL時(shí)達(dá)到最大，顯示出明顯的劑量—效應(yīng)依賴關(guān)系。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，顯示出一定的時(shí)間—效應(yīng)依賴關(guān)系。24 h為最佳作用時(shí)間。所用藥物作用于FB中在規(guī)定的時(shí)間、濃度內(nèi)無(wú)細(xì)胞壞死。

2.3 Smad7蛋白表達(dá)結(jié)果 見(jiàn)圖1。Western blot檢測(cè)顯示，增生性瘢痕FB經(jīng)不同濃度的MMC作用24 h后，Smad7蛋白表達(dá)量比正常對(duì)照組增多(P＜0.05)。并且隨著藥物濃度的增加，Smad7蛋白表達(dá)量有逐漸增高趨勢(shì)(P＜0.05)。

3 討論

增生性瘢痕是FB增生異常旺盛，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過(guò)度沉積、膠原纖維排列紊亂的一種皮膚纖維化疾病。瘢痕過(guò)度增生的病因?qū)W仍尚未清楚。增生性瘢痕組織中FB生物學(xué)特性異常，數(shù)量增多，合成并分泌大量膠原纖維，被認(rèn)為是增生性瘢痕組織形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。

表1 MMC對(duì)增生性瘢痕FB增殖活性的影響(±s，n=8)

表1 MMC對(duì)增生性瘢痕FB增殖活性的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01;與同濃度24 h時(shí)比較，△P＜0.05，#P＜0.01

?

圖1 各組FB中Smad7蛋白表達(dá)

MMC是一種抗腫瘤藥物，還是一種強(qiáng)有力的抑制FB增殖的藥物，在耳鼻喉科、眼科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域中治療瘢痕應(yīng)用比較廣泛，但在治療瘢痕增生臨床及基礎(chǔ)研究較少。于冬梅等［2］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MMC對(duì)體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩FB增殖的抑制作用與藥物濃度、處理時(shí)間有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)低劑量MMC對(duì)瘢痕疙瘩FB的作用是通過(guò)下調(diào)cyclinD1抑制細(xì)胞增殖和激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。Kim等［3］以0.02%MMC處理FB，證明MMC誘導(dǎo)其凋亡是通過(guò)下調(diào)bcl mRNA，上調(diào)bax mRNA表達(dá)量，同時(shí)下調(diào)TGF-β1mRNA而實(shí)現(xiàn)的。劉鶯等［4］通過(guò)MTT檢測(cè)證實(shí)100 μg/mL MMC對(duì)KFB細(xì)胞的增殖抑制效果最佳(P＜0.01)，為該藥物臨床應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前研究認(rèn)為，MMC抑制FB增殖作用是氟尿嘧啶的100倍，并有時(shí)間依從性，作用時(shí)間可達(dá)到無(wú)限期抑制增生，同時(shí)與劑量密切相關(guān)，大劑量時(shí)可以是不可逆性抑制［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MMC對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性。

TGF-β可促進(jìn)FB增殖，增加膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成。TGF-β信號(hào)主要由Smad家族介導(dǎo)，其作為配體形成受體復(fù)合物，激活Smad，進(jìn)入核，共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［6］。Smad家族是TGF-β受體下游信號(hào)蛋白。TGF-β是通過(guò)正、負(fù)反饋的調(diào)節(jié)通路自我調(diào)控的，其中Smad2、3發(fā)揮正反饋?zhàn)饔?，Smad7發(fā)揮負(fù)反饋?zhàn)饔?。Ashcroft等［7］證實(shí)Smad3缺陷的小鼠上皮再生加快，瘢痕形成減少。Smad7表達(dá)增加，能夠阻斷FB內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以抑制瘢痕增生。潘祝彬等［8］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5-氟尿嘧啶抑制瘢痕增生主要通過(guò)增加Ⅰ-Smad轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)Smad7的表達(dá)，抑制TGF-β的病理性作用，使FB增殖受阻而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MMC可通過(guò)增加抑制性Smad7蛋白的表達(dá)及使其從胞核轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)發(fā)揮作用，從而抑制FB增殖，進(jìn)一步為臨床提供理論依據(jù)。

在目前缺乏更有效的抗瘢痕藥物的情況下，本研究為MMC在臨床上治療及預(yù)防增生性瘢痕提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。今后的研究應(yīng)著重于其作用機(jī)理和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以期待早日將MMC應(yīng)用于臨床。

［1］Niessen FB，Spauwen PH，Schalkwjjk J，et al.On the nature ofhypertrophic scars and keloids:a review［J］.Plast Reconstr Surg，1999，104(5):1435-1458.

［2］于冬梅，郝立君，李穎，等.絲裂霉素C對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12 (8):900-905.

［3］Kim TI，Choi SI，Lee HK，et al.itomycin C induces apoptosis in cultured corneal fibroblasts derived from typeⅡ granular corneal dystrophy corneas［J］.Mol Vis，2008，14:1222-1228.

［4］劉鶯，于冬梅，郝立君，等.絲裂霉素C對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Cyclin D1、CDK4及P27基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2008，17(2):126-131.

［5］陳詩(shī)書(shū)，湯雪明.醫(yī)學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2004:717-722.

［6］于冬梅，郝立君，肖志波等.survivin和caspase-3在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其意義［J］.中國(guó)美容整形外科雜志，2008，19(1):77.

［7］Ashcroft GS，Yang X，Glick AB，et al.Mice lacking Smad3 showaccelerated wound healing and an impaired local inflammatory response［J］.Nat Cell Biol，1999，1(5):260-266.

［8］潘祝彬，李小靜，王明麗，等.5-氟尿嘧啶對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Smad7和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅠ型受體表達(dá)的影響［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(37):7245-7249.