LC-MS/MS法測定人血漿中辛伐他汀濃度

陶春蕾，許 釩，許 楊，朱玲玲

（1.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽萬邦醫(yī)藥科技有限公司，安徽 合肥 230088）

LC-MS/MS法測定人血漿中辛伐他汀濃度

陶春蕾1，許 釩1，許 楊2，朱玲玲2

（1.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽萬邦醫(yī)藥科技有限公司，安徽 合肥 230088）

為了建立高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測定人血漿中辛伐他汀濃度的方法，選用Ultimate XB-C18柱（2.1 m×100mm，3μm），以V（甲醇）：V（乙腈）∶V（2.5mmol/L乙酸銨）＝45∶50∶5的溶液為流動相，樣品用沉淀蛋白法處理后進樣，流速為0.3mL/min。選用Finnigan TSQ Quantum Access液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）分析儀的選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）掃描方式進行監(jiān)測，選擇電噴霧離子源ESI，正離子方式。辛伐他汀的線性范圍為0.1～20μg/L，定量下線為0.1μg/L。準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果顯示，方法日間、日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于15%，方法提取回收率為71.96%～78.44%。穩(wěn)定性試驗中，血漿中辛伐他汀在各種儲存條件下均較穩(wěn)定。試驗表明，該方法快速、靈敏，專屬性強、重現(xiàn)性好，可用于人血漿中辛伐他汀濃度的測定和藥代動力學(xué)研究。

高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法；人血漿；辛伐他汀；藥代動力學(xué)

辛伐他汀為3－羥基-3-甲基－戊二酰－輔酶 A（HMG-CoA）還原酶的抑制劑，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，為降血脂藥。辛伐他汀可降低正常的和升高的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，也可降低極低密度脂蛋白（VLDL）和甘油三酯（TG），并升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。辛伐他汀對于脂蛋白、纖維蛋白原和冠心病的其他生化指標(biāo)的影響尚不明確［2］。

辛伐他汀口服后對肝臟有高度的選擇性，其在肝臟中的濃度明顯高于其他非靶性組織，大部分辛伐他汀經(jīng)肝組織吸收，在肝臟發(fā)揮主要作用，隨后從膽汁中排泄。只有低于5%口服劑量活性結(jié)構(gòu)的辛伐他汀在外圍中發(fā)現(xiàn)，而其中95%可與血漿蛋白結(jié)合?？诜练ニ?0mg后，1.5h達(dá)到最大血藥濃度，T1/2約為4.0h。

辛伐他汀主要臨床適應(yīng)癥有高脂血癥和冠心病，辛伐他汀一般耐受性良好，大部分不良反應(yīng)輕微且為一過性。不良反應(yīng)（分為可能、可疑或肯定）與藥物有關(guān)的發(fā)生率大于或等于1%的有：腹痛、便秘、胃腸脹氣。發(fā)生率在0.5%～0.9%的不良反應(yīng)有疲乏、無力、頭痛。發(fā)現(xiàn)肌病的報告很罕見。

目前，文獻報道測定血漿中辛伐他汀濃度的方法有：HPLC-紫外檢測法、HPLC-熒光檢測法、GC/MS法和 LC/MS法［3－10］，這些方法靈敏度低、樣品處理方法復(fù)雜。本試驗建立了LCMS/MS方法，旨在為測定人血漿中辛伐他汀濃度和研究辛伐他汀片的人體藥代動力學(xué)打好基礎(chǔ)。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局2010L04904、2010L03719號批文的要求，觀察健康志愿者空腹口服威特（湖南）藥業(yè)有限公司和輔仁藥業(yè)集團有限公司的辛伐他汀片的血藥濃度經(jīng)時過程，計算相應(yīng)藥動學(xué)參數(shù)，以杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)的的辛伐他汀片為參比制劑，估算其相對生物利用度，并進行生物等效性檢驗，為臨床用藥的有效性和安全性提供依據(jù)，并進一步指導(dǎo)臨床用藥［11－12］。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

試驗制劑T1藥：辛伐他汀片，威特（湖南）藥業(yè)有限公司，規(guī)格：20mg/片，批號：100506，藥檢合格；試驗制劑T2藥：辛伐他汀片，輔仁藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格：10mg/片，批號：20101201，藥檢合格；參比制劑（R）：辛伐他汀片，杭州默沙東制藥有限公司，規(guī)格：20mg/片，批號：100497，藥檢合格；辛伐他汀對照品：批號：100601-201003，含量為99.0%，購買自中國藥品生物制品檢定所；瑞格列奈對照品：批號：HOI136，含量為99.8%，USP ROCKVILLE，MD；甲醇，乙腈：色譜純；乙醚，正己烷：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純；異丙醇：天津市康科德科技有限公司產(chǎn)品，色譜純；乙酸銨：沈陽市合富服務(wù)公司化學(xué)試劑分裝廠產(chǎn)品，分析純；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司產(chǎn)品；空白血漿：遼寧省血液中心提供。

1.2 儀器

Finnigan TSQ Quantum Access液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）分析儀：美國熱電公司產(chǎn)品，配備電噴霧離子源ESI、Finnigan Surveyor LC Pump Plus四元泵及Finnigan Surveyor autosampler Plus自動進樣器、Xcalibur2.0.7操作軟件及LCquan2.5.6定量分析軟件。SK-1快速混勻器，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；LD4-2A離心機：北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品；TGL-16G高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；MDF-U32V超低溫冰箱：日本SANYO公司產(chǎn)品；XS-225A電子分析天平：PRECISA生產(chǎn)；Finnpipette系列取液器：美國Thermo Finnpipette公司產(chǎn)品。

1.3 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（2.1m×100mm，3μm）；流動相：V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（2.5 mmol/L乙酸銨）＝45∶50∶5的混合溶液，流速0.3mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；離子檢測方式：SRM；離子極性：正離子；電噴霧電壓4 800V；毛細(xì)管溫度：350℃；鞘氣流速：45Arb；輔助氣流速：15Arb；碰撞氣壓力：0.2Pa；用于定量的離子分別為辛伐他汀m/z：419.3/199.1，碰撞電壓15eV；內(nèi)標(biāo)瑞格列奈 m/z：453.3/230.3，碰撞電壓 25 eV；掃描寬度為0.01，掃描時間為0.3s。

1.5 試驗方案

本試驗采用三周期三制劑交叉試驗設(shè)計，男性健康受試者24名隨機分成3組，每組8名受試者，按下表以相同劑量進行給藥，每位受試者均分別空腹口服試驗制劑威特（湖南）藥業(yè)有限公司的辛伐他汀片或輔仁藥業(yè)集團有限公司的辛伐他汀片，或參比制劑杭州默沙東制藥有限公司的辛伐他汀片，進行交叉對照和自身對照，按單劑給藥（20mg）。試驗周期之間的清洗間隔為1周，1周后再進行第二周期服藥，連服藥三周期。

服藥前受試者禁食過夜（禁食10h以上），于次日早晨8：00空腹服用試驗用辛伐他汀片，或輔仁藥業(yè)集團有限公司的辛伐他汀片，或參比制劑杭州默沙東制藥有限公司辛伐他汀片20 mg，用250mL溫開水送服。服藥后2h可飲水，4h進統(tǒng)一清淡飲食。受試者服藥后避免劇烈運動，試驗期間禁煙、酒、茶和含咖啡因的飲料，試驗前2周至整個試驗結(jié)束，禁服其它藥物。每例受試者均于服藥前在前臂靜脈安置留置針，抽取空白血樣3mL，并分別于服藥后0.33、0.67、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、15.0、24.0h各采血3mL，共計14針。血漿標(biāo)本收集于肝素鈉抗凝管內(nèi)，于室溫靜置后以3 000r/min離心10min分離血漿，血漿樣本置－80℃低溫冰箱避光保存，備測。于服藥清洗期密切觀察受試者的一般情況，1周后進行交叉服藥，連服藥三周期，每次按照上述時間點采血14針。試驗結(jié)束后所有受試者體檢。

1.6 血漿樣品處理

精密量取500μL血漿，加入50μL內(nèi)標(biāo)瑞格列奈對照溶液（40μg/L），渦旋30s，分別加入100μL乙腈和200μL 0.1mol/L的乙酸銨，再加入3mL提取劑（V（乙醚）∶V（正己烷）∶V（異丙醇）＝80∶20∶3），震蕩渦旋1min，以4 000r/min離心10min，提取上層有機相2.5 mL于試管中，在40℃水浴中空氣流吹干，加200μL流動相復(fù)溶，渦旋30s，以12 000r/min離心5min后，取上清液10μL進樣分析。

1.7 分析方法驗證

1.7.1 專屬性

精密量取健康人體混合空白血漿500μL，按1.6項下自“分別加入100μL乙腈和200μL 0.1mol/L的乙酸銨”起依法操作，得色譜圖示于圖A；取辛伐他?。?0μg/L）對照溶液50μL、瑞格列奈（40μg/L）對照溶液50μL，加入100 μL流動相混勻后，取10μL進樣分析得色譜圖B，辛伐他汀保留時間為2.808min，瑞格列奈保留時間為1.719min；取辛伐他?。?0μg/L）對照溶液50μL加入試管中，40℃水浴空氣流吹干，精密加入空白血漿500μL，按1.6項下，自“精密加入50μL內(nèi)標(biāo)瑞格列奈對照溶液（40 μg/L）”起依法操作，得色譜圖示于圖C，辛伐他汀保留時間為2.848min，瑞格列奈保留時間為1.718min；取受試者A給T2藥6.0h后采集的血漿樣品，按1.6項下依法操作，得色譜圖示于圖D，辛伐他汀保留時間為2.780min，瑞格列奈保留時間為1.668min。

結(jié)果表明，出峰時間和峰形狀均相近，峰形好，藥物峰及雜質(zhì)峰分離效果好，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾辛伐他汀和內(nèi)標(biāo)瑞格列奈的測定。

1.7.2 血漿中辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

精密配制200、100、50、25、10、5、2、1μg/L的辛伐他汀對照溶液；另精密配制40μg/L的瑞格列奈做為內(nèi)標(biāo)的儲備液。

取辛伐他汀儲備液，依次配制成相當(dāng)于辛伐他汀血漿濃度為0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10、20 μg/L的樣品，按1.6項下依法操作，并以上述色譜、質(zhì)譜條件進行測定，建立辛伐他汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以待測物辛伐他汀濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，待測物辛伐他汀色譜峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)瑞格列奈色譜峰面積（Ai）的比值（Y＝As/Ai）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（1/X2）最小二乘法進行線性回歸運算，求得的直線方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法學(xué)確認(rèn)結(jié)果列于（每天做2條標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合成一條）表2。結(jié)果表明辛伐他汀在0.1～20μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.1μg/L。（S/N＞10）。

1.7.3 精密度與準(zhǔn)確度

取空白血漿，配制辛伐他汀低、中、高3個濃度（0.25、3和16μg/L）的質(zhì)量控制（QC）樣品，按1.6項下依法操作，每一濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定3天，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算QC樣品的測得濃度。根據(jù)QC樣品結(jié)果計算本法的精密度和準(zhǔn)確度。辛伐他汀的低、中、高3個質(zhì)控濃度的日間精密度為10.19%、7.85%、6.60%。

圖1 辛伐他汀方法學(xué)專屬性圖譜Fig.1 Simvastatin methodology specificity mapping

1.7.4 待測樣品穩(wěn)定性

取空白血漿，配制成辛伐他汀濃度為（0.25、3和16μg/L）低、中、高3個濃度的血漿樣品；按1.6項下操作，考察室溫放置6h穩(wěn)定性，樣品處理后放置12h穩(wěn)定性，血漿樣品在－80℃冰箱中反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性，冷凍條件下放置32天穩(wěn)定性。結(jié)果表明，辛伐他汀血漿樣本室溫放置6h的 RSD分別為5.03%、3.46%、0.59%。樣品處理后放置12h的RSD分別為9.81%、1.77%、0.14%。血漿樣品在－80℃冰箱中反復(fù)凍融3次的 RSD分別為1.65%、3.18%、0.34%。冷凍條件下放置32天穩(wěn)定RSD分別為0.08%、3.17%、0.53%。

1.7.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗

取500μL空白血漿，分別加入100μL乙腈和200μL 0.1mol/L的乙酸銨，再加入3mL提取劑（V（乙醚）∶V（正己烷）∶V（異丙醇）＝80∶20∶3），震蕩渦旋1min，以4 000r/min離心10min，提取上層有機相2.5mL于試管中，分別精密加入辛伐他汀濃度為（2.5、30和160μg/L）低、中、高對照液50μL和內(nèi)標(biāo)瑞格列奈對照溶液（40μg/L）50μL，于40℃水浴中空氣流吹干，加200μL流動相復(fù)溶，渦旋30s，以12 000 r/min離心5min后，取上清液10μL進樣分析。得到辛伐他汀和內(nèi)標(biāo)瑞格列奈的峰面積值A(chǔ)SIM和AREP。

分別精密加入辛伐他汀濃度為（2.5、30和160μg/L）低、中、高對照液50μL和內(nèi)標(biāo)瑞格列奈對照溶液（40μg/L）50μL于試管中，40℃空氣流吹干，加入200μL流動相，混勻后取10μL進樣分析，得到辛伐他汀和內(nèi)標(biāo)瑞格列奈的峰面積值BSIM和BREP。

分別精密加入辛伐他汀濃度為（2.5、30和160μg/L）低、中、高對照液50μL，40℃空氣吹干，加入空白血漿500μL，配制成辛伐他汀濃度為（0.25、3和16μg/L）低、中、高3個濃度的血漿樣品，按1.6項下自“精密加入50μL內(nèi)標(biāo)瑞格列奈對照溶液（40μg/L）”依法操作，得到辛伐他汀和內(nèi)標(biāo)瑞格列奈的峰面積值CSIM和CREP；按下式計算：提取回收率 （%）＝C/A×100%，基質(zhì)效應(yīng)（%）＝A/B×100%，結(jié)果列于表1～4，辛伐他汀的提取回收率為71.96%～78.44%，內(nèi)標(biāo)瑞格列奈的平均提取回收率為86.97%。辛伐他汀的基質(zhì)效應(yīng)范圍77.69%～88.67%，內(nèi)標(biāo)瑞格列奈的平均基質(zhì)效應(yīng)為95.01%。

表1 辛伐他汀在血漿中的提取回收率Table 1 Simvastatin in plasma of extraction recovery

表2 內(nèi)標(biāo)瑞格列奈的提取回收率Table 2 Internal standard repaglinide extraction recovery

表3 辛伐他汀的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Simvastatin of matrix effect

表4 內(nèi)標(biāo)瑞格列奈的基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Internal standard repaglinide of the matrix effect

1.8 藥動學(xué)數(shù)據(jù)處理

采用DAS2.1.1軟件計算兩者的藥動學(xué)參數(shù)。以實測值計算Cmax、tmax；以末端血藥濃度的對數(shù)值對時間進行回歸，求得斜率Ke及t1/2，運用梯形法計算AUC（0－t）。根據(jù)試驗制劑和參比 制 劑 的 AUC（0－t）計 算 相 對 生 物 利 用 度。AUC（0－∞）＝ AUC0→t＋ Ct/λz（t為最后一次可實測血藥濃度的采樣時間；Ct為末次可測定樣本藥物濃度；λz為對數(shù)血藥濃度—時間曲線末端直線部分求得的末端消除速率常數(shù)）。

2 結(jié)果

2.1 平均血藥濃度－時間曲線圖

應(yīng)用本研究的方法測定24名中國成年健康受試者口服試驗制劑（T1、T2藥）和參比制劑（R藥）辛伐他汀片平均血藥濃度－時間曲線。如圖2所示，3種制劑的體內(nèi)過程相似。

2.2 藥動學(xué)參數(shù)

應(yīng)用本方法測定24名受試者口服辛伐他汀片20mg后的藥動學(xué)參數(shù)列于表5，方差分析結(jié)果顯示，主要藥動學(xué)參數(shù)在兩種制劑之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 24名受試者口服試驗制劑（T1、T2藥）辛伐他汀片和參比制劑的辛伐他汀片平均血藥濃度－時間曲線Fig.2 Twenty-four participants oral test preparation T1and T2medicine）simvastatin slice and preparation of CST simvastatin piece of average blood drug concentration-time curve

2.3 生物等效性分析

試驗制劑（T1藥）辛伐他汀片（威特（湖南）藥業(yè)有限公司）和參比制劑（R藥）辛伐他汀膠囊（杭州默沙東制藥有限公司）ln（AUC（0－24））、ln（AUC（0－∞））經(jīng)方差分析表明兩制劑間無顯著性差異，經(jīng)雙向單側(cè)t檢驗，［1-2α］置信區(qū)間分別為99.3%～108.6%和98.6%～107.9%，在80%～125%范圍內(nèi)，表明兩制劑在吸收和代謝程度上等效。ln（Cmax）經(jīng)方差分析表明兩制劑間無顯著性差異，經(jīng)雙向單側(cè)t檢驗，［1-2α］置信區(qū)間為91.1%～99.9%，在75%～133%范圍內(nèi)，表明兩制劑在達(dá)峰濃度上等效。結(jié)果表明兩種制劑在吸收和代謝程度上和達(dá)峰濃度上等效。兩制劑的Tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗（配對Wilcoxon法）無差異（P＞0.05），兩制劑達(dá)峰時間上等效。

表5 24名受試者口服辛伐他汀片20mg后的藥動學(xué)參數(shù)Table 5 Twenty-four participants oral simvastatin piece after 20mg pharmacokinetic parameters

綜上認(rèn)定試驗制劑（T1藥）辛伐他汀片（威特（湖南）藥業(yè)有限公司）與參比制劑（R藥）辛伐他汀膠囊（杭州默沙東制藥有限公司）生物等效。

試驗制劑（T2藥）辛伐他汀片（輔仁藥業(yè)集團有限公司）和參比制劑（R藥）辛伐他汀膠囊（杭州默沙東制藥有限公司）ln（AUC（0－24））、ln（AUC（0－∞））經(jīng)方差分析表明兩制劑間無顯著性差異，經(jīng)雙向單側(cè)t檢驗，［1-2α］置信區(qū)間分別為95.5%～104.4%和95.6%～104.7%，在80%～125%范圍內(nèi)，表明兩制劑在吸收和代謝程度上等效。ln（Cmax）經(jīng)方差分析表明兩制劑間無顯著性差異，經(jīng)雙向單側(cè)t檢驗，［1-2α］置信區(qū)間為92.2%～101.1%，在75%～133%范圍內(nèi)，表明兩制劑在達(dá)峰濃度上等效。結(jié)果表明兩種制劑在吸收和代謝程度上和達(dá)峰濃度上等效。兩制劑的Tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗（配對Wilcoxon法）無差異（P＞0.05），兩制劑達(dá)峰時間上等效。

綜上可以認(rèn)定試驗制劑（T2藥）辛伐他汀片（輔仁藥業(yè)集團有限公司）與參比制劑（R藥）辛伐他汀膠囊（杭州默沙東制藥有限公司）生物等效。

3 討論

LC-MS/MS法具有選擇性好、靈敏度高、高通量等優(yōu)點，目前已被廣泛應(yīng)用于檢測生物樣本中的藥物以及藥代動力學(xué)等。本實驗采用LC-MS/MS法測定健康受試者血漿中甘草次酸濃度，具有靈敏度高、出峰時間快、重現(xiàn)性好、特異性強的優(yōu)點，專屬性圖譜表明此色譜條件對血漿內(nèi)源性物質(zhì)與甘草次酸和熊果酸分離較好，且不干擾其檢測，最低可定量濃度為0.1μg/L。在進行血漿樣品處理過程中試用乙酸乙酯和乙醚作為提取劑，均有內(nèi)源性物質(zhì)干擾且回收率低；后試用乙醚－正己烷和乙醚－正己烷－異丙醇為提取劑，調(diào)試比例后經(jīng)LC-MS/MS分析結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在V（乙醚）∶V（正己烷）∶V（異丙醇）＝80∶20∶3的溶液中辛伐他汀的提取率較高，峰形較好，雜質(zhì)少，故采用此混合溶劑作為提取劑。

試驗中24名受試者在服用試驗（T1、T2）和參比（R）3種制劑辛伐他汀片后，測定其血漿中辛伐他汀濃度，并計算其主要的藥動學(xué)參數(shù)，所得結(jié)果均與文獻報道相近［3－4］。經(jīng)過方差分析和雙單側(cè)t檢驗，證明3制劑的體內(nèi)過程基本相似，判定試驗制劑（T1、T2）辛伐他汀片均與參比制劑（R）辛伐他汀片具有生物等效性。

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［10］VALIDATED.HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of simvastatin and simvastatin hydroxy acid in human plasma［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006（41）：517-526.

Determination of Simvastatin in Human Plasma by LC-MS/MS

TAO Chun-lei1，XU Fan1，XU Yang2，ZHU Ling-ling2
（1.Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China；2.Anhui state medical technology limited company，Hefei 230088，China）

Simvastatin in human plasma was determined by LC-MS/MS.After protein precipitation the analyte and internal standard were separated on a Ultimate XB-C18（2.1m×100mm，3μm）using the mobile phase of V（methanol）∶V（acetonitrile）∶V（2.5mmol/L ammonium acetate）＝45∶50∶5at a flow rate of 0.3mL/min.Detection was carried out by electrospray positive ionizaion mass spectrometry in the SRM mode.The assay is linear over the range 0.1～20μg/L with a lower limit of quantitation of 0.1μg/L.Intra-day and inter-day precision are both less than 15%，respectively.The recoveries of Simvastatin are 71.96%～78.44%，and stabilities are good.The results show that it is a rapid，sensitive，selective and reliable method for the determination of Simvastatin in human plasma.The assay can be applied for the determination of Simvastatin in human plasma and the study on pharmacokinetics.

book=88,ebook=204

LC-MS/MS；Simvastatin；pharmacokinetics；human plasma

O 657.63

A

1004-2997（2012）03-0087-07

2011-10-27；

2012-02-29

陶春蕾（1971～），女（漢），安徽合肥人，副主任藥師，從事臨床藥學(xué)研究。E-mail：13905514586＠139.com

許 釩（1970～），男（漢），安徽合肥人，教授，從事藥理學(xué)研究。E-mail：13905514586＠139.com