熟地中水溶性多糖超聲提取工藝的正交優(yōu)化

林春燕，暴 瓏，黃家園，李 淳，姜漢石，李文德，吳天秀

(1.廣東醫(yī)學(xué)院生理科學(xué)教研室，廣東湛江524023;2.廣東醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，廣東湛江524023;3.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524023;4.廣東醫(yī)學(xué)院解剖教研室，廣東湛江524023)

熟地為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)的炮制加工品，有補(bǔ)腎陽，生精血之功效。藥理實(shí)驗(yàn)表明，熟地多糖具有免疫和抑制腫瘤活性，并對(duì)心血管系統(tǒng)有強(qiáng)心、降壓、保護(hù)心肌、抑制血栓形成和降血脂等作用［1，2］，根據(jù)其水中的溶解度可分為水溶性和水不溶性兩類。目前有關(guān)熟地黃水溶性多糖提取的報(bào)道多是采用粗放的直接加熱法，關(guān)于超聲波提取熟地黃多糖工藝優(yōu)化的報(bào)道卻很少見。超聲波是頻率高于20 kHz，并且不引起聽覺的彈性波。很多研究表明，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，可加速植物材料中的有效成分進(jìn)入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時(shí)間，并且還可避免高溫對(duì)提取成分的影響［3］。本實(shí)驗(yàn)擬采用超聲波強(qiáng)化提取熟地黃中的水溶性多糖，利用正交實(shí)驗(yàn)法研究不同提取因素對(duì)熟地黃水溶性多糖提取效果的影響，并對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與儀器

1.1 材料 熟地原料為市售熟地黃飲片，干燥，粉碎過40目篩，備用。

1.2 儀器與試劑 UV－752分光光度計(jì)(上海分析儀器廠)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療有限公司工廠)，RE－

2 方法

2.1 水溶性多糖的提取與精制 稱取熟地干粉10 g，按一定料液比加水浸泡30 min，按一定的提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)進(jìn)行超聲提取，提取液冷卻后抽濾，再用漏斗過濾，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至約50 mL，加入無水乙醇，靜置過夜，抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，得精制多糖，真空干燥后稱重，計(jì)算多糖得率。

2.2 多糖含量測(cè)定

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.1 mg，溶解并定容至100 mL容量瓶，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其濃度為0.101 mg·mL－1。

2.2.2 6%苯酚溶液的配制 取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾。收集182℃餾分，稱取12 g加蒸餾水190 g溶解，即得6%的苯酚溶液，置于棕色瓶中備用。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用移液管分別吸取葡萄糖貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0 mL分別置于20 mL的比色管中，加蒸餾水至1 mL，另取1.0 mL蒸餾水做空白對(duì)照。分別加入6%的苯酚溶液0.5 mL，搖勻，迅速滴加2.5 mL濃硫酸充分搖勻，室溫放置30 min，于紫外分光光度計(jì)490 nm波長處測(cè)定吸光度值，同樣條件下以蒸餾水為空白對(duì)照。以濃度(C)對(duì)吸光度(A)，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程A= 0.008 7C+0.005 6，r=0.999 7。

2.2.4 樣品含量測(cè)定 精確吸取樣品液(精密稱取60℃干燥至恒重的熟地黃多糖0.100 g，置100 mL容量瓶中，加入少量蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法測(cè)定其吸收度值，按下式計(jì)算多糖含量，多糖含量(%)=CDf/W×100(C為樣品溶液的葡萄糖的質(zhì)量，D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，f為換算因素)。

2.3 水溶性多糖提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取10 g熟地樣品，以水為提取溶劑，改變提取時(shí)間、提取溫度、料液比和提取次數(shù)等因素，以多糖得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)為主要考察因素，以多糖得率及多糖含量作為考察指標(biāo)，試驗(yàn)采用綜合加權(quán)評(píng)分法［4］，權(quán)重系數(shù)均為0.5。分別把試驗(yàn)項(xiàng)中最大的指標(biāo)定為100分，其他各號(hào)按下式評(píng)分:綜合評(píng)分=(各實(shí)驗(yàn)組多糖得率/多糖得率最大值)×100×0.5+(各實(shí)驗(yàn)組多糖含量/多糖含量最大值)×100×0.5。采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1。

3 結(jié)果

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取時(shí)間的影響 以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶20，提取溫度為60℃，提取1次，提取時(shí)間為0～90 min時(shí)，多糖的提取效率隨著時(shí)間的延長有較大的提高，超過150 min有降低的趨勢(shì)，結(jié)果見圖1。

表1 因素水平表

圖1 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

3.1.2 料液比的影響 以蒸餾水為提取溶劑，提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60℃，提取1次，隨著料液比的增大，多糖得率也逐漸增大。但料液比達(dá)到1∶20時(shí)，增加提取溶劑，無法增加多糖得率，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)提取效果的影響

3.1.3 提取溫度的影響 以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時(shí)間為60 min，提取1次，提取溫度為60℃時(shí)，多糖得率最高，超過60℃多糖含量逐漸下降，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)提取效果的影響

3.1.4 提取次數(shù)的影響 以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60℃ 時(shí)，多糖的得率隨著提取次數(shù)的增加而增大，從節(jié)省時(shí)間提高效率等方面考慮，提取次數(shù)控制在3次以內(nèi)比較合適，結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響

3.2 多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 測(cè)定結(jié)果經(jīng)極差直觀分析見表2、3可知，各因素對(duì)熟地水溶性多糖提取效果的影響程度依次為:提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞超聲溫度＞料液比。最佳工藝組合為超聲溫度60℃，提取3次，超聲時(shí)間60 min，料液比1∶30。按優(yōu)選的最佳超聲提取工藝A2B2C3D1進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定多糖含量(重復(fù)3次)，其含量分別為12.85%，12.77%，12.46%。平均含量為12.69%，RSD=1.62%。

表2 水溶性多糖正交實(shí)驗(yàn)表

表3 水溶性多糖提取綜合評(píng)分方差分析結(jié)果

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以水溶性多糖的得率作為單因素提取工藝的考察指標(biāo)，能較簡便、快捷的確定采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選超聲波法的基本工藝條件及因素，再以多糖得率及多糖的含量兩者作為綜合評(píng)定正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選超聲提取工藝的指標(biāo)，結(jié)果表明，不同超聲溫度、超聲時(shí)間、提取次數(shù)和料液比都對(duì)多糖的提取率有不同程度的影響，其中超聲提取時(shí)間及次數(shù)兩種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和提取過程中經(jīng)濟(jì)成本等因素，本實(shí)驗(yàn)確定了超聲波提取熟地水溶性多糖的最佳工藝為:超聲溫度60℃，超聲時(shí)間60 min，提取次數(shù)為3次，料液比1∶30。

［1］ 劉培建，苗明三，高漸聯(lián).熟地黃多糖對(duì)氣血雙虛小鼠全血細(xì)胞及血清粒－巨噬細(xì)胞集落刺激因子水平的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(38): 7543－7546.

［2］ 李發(fā)勝，徐恒瑰，李明陽，等.熟地多糖提取物對(duì)小鼠免疫活性影響［J］.中國公共衛(wèi)生，2008，24(9):1109－1110.

［3］ 曾里，夏之寧.超聲波和微波對(duì)中藥提取的促進(jìn)和影響［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2002，14(3):245－249.

［4］ 宋崎，周小初，宋英，等.益母草炮制工藝的優(yōu)化［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(3):709－710.