硫化氫對D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響

許言午 張江虹 張麗娜 韓志芬 金國琴 (上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 003)

硫化氫對D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響

許言午 張江虹1張麗娜 韓志芬2金國琴 (上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

目的觀察硫化氫對D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激及細胞凋亡的影響。方法雄性SD大鼠40只，隨機分為對照組、D-半乳糖組、硫化氫6.25μmol/kg組(H2S-1)，硫化氫12.5μmol/kg(H2S-2)組，每組10只。D-半乳糖組每日腹腔注射D-半乳糖400 mg·kg-1·d-1，連續(xù)60 d;對照組每日腹腔注射等體積生理鹽水;硫化氫組處理同D-半乳糖組，同時分別按6.25和12.5μmol/kg腹腔注射硫化氫。采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸(TBA)法檢測心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;采用Western印跡檢測Bcl-2和Bax蛋白表達水平并測定組織Caspase-3相對活性。結(jié)果與對照組相比，D-半乳糖組大鼠心肌組織SOD活性下降、MDA含量升高，Bcl-2蛋白表達下調(diào)、Bax蛋白表達上調(diào)，Caspase-3相對活性升高;給予硫化氫能顯著改善D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平，減少細胞凋亡。結(jié)論硫化氫可通過提高抗氧化能力和減少細胞凋亡緩解D-半乳糖所致心肌組織損傷。

硫化氫;心肌損傷;氧化應(yīng)激;細胞凋亡;D-半乳糖

硫化氫(H2S)是近年發(fā)現(xiàn)的繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種內(nèi)源性氣體信號分子，在心血管系統(tǒng)發(fā)揮著重要的病理、生理作用〔1，2〕。大量的研究表明，H2S可通過抑制心肌細胞凋亡和減少氧化應(yīng)激而減輕由缺血-再灌注或缺氧引起的急性心肌損傷〔3～5〕。本研究以D-半乳糖亞急性損傷大鼠為模型，觀察H2S對亞急性中毒引起的心肌組織氧化應(yīng)激和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠，2月齡，體重(250±10)g。由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供〔動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005〕。

1.2 試劑 硫氫化鈉 (NaHS):Sigma公司;D-半乳糖:國藥集團化學(xué)試劑有限公司 (Cat.No.63004434);超氧化物歧化酶 (SOD)檢測試劑盒、丙二醛 (MDA)測定試劑盒、蛋白定量Bradford試劑盒:南京建成生物工程研究所;Caspase-3活性檢測試劑盒:BioVision公司 (Cat.No.K106-100);兔抗大鼠 Bcl-2抗體、Bax抗體:Cell Signalling公司:(Cat.No.2870，Cat.No.2772);兔抗大鼠 β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體:Abmart公司 (Cat.No.P30002，Cat.No.M21003);親水蛋白分離試劑盒:普利萊基因技術(shù)有限公司 (Cat.No.P1250);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒及超敏ECL試劑盒:Pierce公司 (Cat.No.23225)。其他常用試劑均為分析純:國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 組織超聲破碎儀(美國Misonix公司);酶聯(lián)免疫測定儀(美國MD公司);蛋白質(zhì)電泳、半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);G:BOX凝膠分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組、造模與給藥 40只大鼠，隨機分為4組:對照組、D-半乳 糖組、H2S-1(6.25 μmol/kg)組 和 H2S-2(12.5μmol/kg)組，每組10只。溫度18℃ ～22℃，光暗周期12 h∶12 h，群養(yǎng)，5 只/籠，常規(guī)喂養(yǎng)飼料，自由飲水。D-半乳糖組每日腹腔注射D-半乳糖400mg·kg-1·d-1，連續(xù)60 d;對照組每日腹腔注射等量生理鹽水;H2S-1組和H2S-2組處理D-半乳糖組，同時以NaHS為供體溶解于生理鹽水，每日分別按6.25μmol/kg和12.5μmol/kg腹腔注射H2S。

1.4.2 組織取材 大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，400 mg/kg)，腹主動脈取血處死;取下心肌組織，生理鹽水洗凈，立即測定或分置于Eppendorf管中-70℃保存。

1.4.3 大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量檢測 取左心室心肌組織，按100 mg/ml生理鹽水加入生理鹽水。于冰水浴中小彎剪剪碎，超聲破碎，使其充分裂解，4℃離心10 min后取上清，BCA法測定蛋白含量。其余操作按試劑盒說明書進行，并對測定結(jié)果進行蛋白含量校正。

1.4.4 大鼠心肌組織凋亡檢測

1.4.4.1 Western印跡檢測大鼠心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達 取左心室心肌組織，按100 mg/ml加入裂解液，裂解操作同1.4.3，后于4℃離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白含量。然后進行電泳及Western印跡分析，其中蛋白上樣量調(diào)整為80 μg，一抗稀釋度為 1∶2 000，二抗稀釋度為1∶5 000。Western印跡結(jié)果采用Genesnap進行圖像采集，Image pro6.0分析軟件對條帶進行密度掃描，得出條帶密度值，以β-actin為內(nèi)參照。

1.4.4.2 大鼠心肌組織Caspase-3相對活性測定 取大鼠左心室心肌組織50 mg，以100 mg/ml加入試劑盒提供的裂解液，制備組織勻漿，4℃離心5 min，取上清，以Bradford法進行蛋白定量。用稀釋液調(diào)整上清蛋白含量為2 mg/ml，其余按試劑盒說明書進行。以對照組活性為1，計算Caspase-3相對活性。

2 結(jié)果

2.1 硫化氫對D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響 見表1。

2.2 硫化氫對D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達及Caspase-3相對活性的影響 見表2，圖1。

表1 硫化氫對D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

表1 硫化氫對D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與D-半乳糖組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 SOD活性(U/mg) MDA含量(nmol/mg)對照組 49.8±3.64) 2.14±0.374)H2 S-1組 41.2±3.72)3) 3.28±0.762)3)H2 S-2組 45.1±4.52)4) 2.72±0.361)4)D-半乳糖組 37.1±2.52) 3.85±0.562)

表2 硫化氫對D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達和Caspase-3相對活性的影響(±s，n=10)

表2 硫化氫對D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達和Caspase-3相對活性的影響(±s，n=10)

組別Bcl-2 Bax Caspase-3對照組 1.00±0.004) 1.00±0.004) 1.00±0.274)H2 S-1組 0.65±0.132)3) 1.52±0.132)4) 2.54±0.332)4)H2 S-2組 0.71±0.142)4) 1.18±0.131)4) 1.76±0.292)4)D-半乳糖組 0.37±0.112) 2.12±0.352) 3.04±0.552)

圖1 各組Bcl-2、Bax W estern印跡檢測

3 討論

D-半乳糖引起的亞急性中毒模型是目前被廣為使用的擬衰老模型。雖然其作用機制尚未完全明確，但根據(jù)衰老的代謝學(xué)說，D-半乳糖引起的糖代謝紊亂必然會導(dǎo)致心、肝、腎、腦等重要器官代謝異常，最終出現(xiàn)衰老〔6〕。同時，大量的研究顯示，D-半乳糖可通過代謝過程中產(chǎn)生的自由基引起氧化應(yīng)激損傷〔7～9〕和細胞凋亡〔10，11〕。

長期以來，H2S一直被認為是污染環(huán)境的毒性氣體，是造成大氣和水以及某些職業(yè)病的主要危害物質(zhì)之一。超過生理劑量的H2S對活體器官的毒性主要體現(xiàn)在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及對呼吸系統(tǒng)的抑制作用。然而，近年研究表明H2S不但在體內(nèi)可以內(nèi)源性生成〔12〕，而且在心血管系統(tǒng)發(fā)揮著重要的病理生理作用，被確定為繼NO和CO之后的第三種內(nèi)源性氣體信號分子〔2〕。大量的研究表明，H2S預(yù)處理和后處理可以通過減少氧化應(yīng)激損傷、抑制心肌細胞凋亡等機制有效減輕缺血-再灌注或缺氧引起的急性心肌損傷〔3～5〕。那么，H2S對亞急性和慢性損傷引起的心肌氧化應(yīng)激和細胞凋亡的作用如何未見報道。本文結(jié)果說明，外源性給予H2S可通過增強SOD活性，降低MDA含量而減輕D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷，同時可以通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達、降低Caspase-3的活性而減輕心肌細胞凋亡，從而發(fā)揮其心肌保護作用。然而H2S對上述指標(biāo)作用的具體通路機制和內(nèi)源性H2S/CSE系統(tǒng)在心肌組織衰老等慢性變化中的作用和機制還有待進一步研究。

1 Kimura H.Hydrogen sulfide:its production and functions〔J〕.Exp Physiol，2011;96(9):833-5.

2 Wang R.Two's company，three's a crowd:can H2S be the third endogenous gaseous transmitter〔J〕?FASEB J，2002;16(13):1792-8.

3 King AL，Lefer DJ.Cytoprotective actionsof hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury〔J〕.Exp Physiol，2011;96(9):840-6.

4 Chen SL，Yang CT，Yang ZL，et al.Hydrogen sulphide protects H9c2 cells against chemical hypoxia-induced injury〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010;37(3):316-21.

5 Zhu YZ，Wang ZJ，Ho P，et al.Hydrogen sulfide and its possible roles in myocardial ischemia in experimental rats〔J〕.JAppl Physiol，2007;102(1):261-8.

6 朱亞珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老動物模型的建立及其檢測方法〔J〕.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2007;34(4):617-8.

7 Hsia CH，Wang CH，Kuo YW，et al.Fructo-oligosaccharide systemically diminished d-galactose-induced oxidativemolecule damages in BALB/cJ mice〔J〕.Br JNutr，2011;20(1):1-6.

8 Tsai SJ，Chiu CP，Yang HT，etal.s-Allyl cysteine，s-ethyl cysteine，and spropyl cysteine alleviate β-amyloid，glycative，and oxidative injury in brain ofmice treated by D-galactose〔J〕.JAgric Food Chem，2011;59(11):6319-26.

9 Parameshwaran K，Irwin MH，Steliou K，etal.D-galactose effectiveness in modeling aging and therapeutic antioxidant treatment inmice〔J〕.Rejuvenation Res，2010;13(6):729-35.

10 Zhang Q，LiX，Cui X，etal.D-galactose injured neurogenesis in the hippocampus of adultmice〔J〕.Neurol Res，2005;27(5):552-6.

11 Chen B，Zhong Y，Peng W，et al.Increased mitochondrial DNA damage and decreased base excision repair in the auditory cortex of D-galactoseinduced aging rats〔J〕.Mol Biol Rep，2011;38(6):3635-42.

12 Kimura H.Hydrogen sulfide induces cyclic AMP and modulates the NMDA receptor〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;267(1):129-33.

R285.5

A

1005-9202(2012)16-3471-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.057

上海市自然科學(xué)基金(10ZR1430000，09ZR1403600);上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金(szy08007);上海市教育委員會重點學(xué)科建設(shè)項目(J50301)資助

1 復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心

許言午(1974-)，男，博士，講師，主要從事中醫(yī)藥對老年病防治的研究。

〔2011-11-09收稿 2012-01-10修回〕

(編輯 曹夢園)