Twist基因沉默對人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響

劉洪義 邢 金 所 劍 (天津市南開醫(yī)院，天津 30000)

Twist基因沉默對人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響

劉洪義 邢 金1所 劍2(天津市南開醫(yī)院，天津 300100)

目的 探討Twist基因沉默對人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響。方法 以本課題組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-Twist質(zhì)粒的人胃癌SGC7901細(xì)胞作為研究對象，實(shí)驗分為三組:對照組、空載體組、Twist基因沉默組。通過倒置顯微鏡和透射電鏡觀察Twist基因沉默對SGC7901細(xì)胞形態(tài)的影響;通過Rhodamine123染色后流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化;采用DAPI染色和TUNEL法觀察Twist基因沉默對SGC7901細(xì)胞凋亡情況的影響。結(jié)果 與對照和空載體組相比，倒置顯微鏡下觀察顯示基因沉默組細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，有較多細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞異型性小;透射電鏡觀察顯示Twist基因沉默組細(xì)胞體積變小，微絨毛減少，細(xì)胞突觸變短且增多，空泡增多，核質(zhì)比例降低，異染色質(zhì)團(tuán)塊狀分布，核周間隙更大;Rhodamine123染色后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示Twist基因沉默組陰性細(xì)胞數(shù)增高;DAPI染色結(jié)果顯示細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，染色質(zhì)凝集，著色較重，核固縮，核小體碎片增加;TUNEL法檢測顯示Twist基因沉默組可見明顯細(xì)胞核棕黃色染色的陽性細(xì)胞。結(jié)論 Twist基因沉默促進(jìn)SGC7901細(xì)胞凋亡，提示Twist在胃癌惡性進(jìn)展中起重要作用，Twist可能成為腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。

胃癌;RNAi;Twist基因;凋亡

研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、前列腺癌、胃癌、甚至胰腺癌等惡性腫瘤中Twist明顯高表達(dá)〔1～5〕，Twist異常高表達(dá)可能引起腫瘤。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Twist是癌基因，能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用〔6，7〕。本課題組研究發(fā)現(xiàn)〔5〕，Twist在人胃癌SGC7901細(xì)胞與胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞相比表達(dá)顯著增高，表明Twist可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。通過對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-Twist質(zhì)粒的SGC7901細(xì)胞的生長活力的研究發(fā)現(xiàn)，Twist基因沉默可抑制SGC7901細(xì)胞的增殖，本研究將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，從而明確Twist基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌SGC7901細(xì)胞由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實(shí)驗室惠贈;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-Twist質(zhì)粒的SGC7901細(xì)胞由本實(shí)驗室建立;RPMI1640培養(yǎng)液購于Invitrogen公司;小牛血清購自杭州四季青公司;In situ cell death detection kit購于德國ROCHE公司;DAPI和Rhodamine123購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC7901細(xì)胞株和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-Twist質(zhì)粒的SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清RPMI1640的培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組 根據(jù)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不同，將細(xì)胞分為對照組、空載體組、Twist基因沉默組。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化 細(xì)胞分組后，將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板培養(yǎng)至約90%融合時，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍攝照片。

1.2.4 透射電鏡檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 將對數(shù)生長期細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至90%融合，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，取106～107個細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，使細(xì)胞形成微團(tuán)，0.1 mol/L PBS洗滌細(xì)胞3次，1 000 r/min，離心5 min，使細(xì)胞形成致密微團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)先用4%戊二醛固定，再用1%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，LKB-NOVA型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，最后HITACHI H-7650型透射電鏡觀察并拍攝照片。

1.2.5 線粒體跨膜電位檢測 將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)至約70%融合時，計數(shù)各組細(xì)胞，取1×106細(xì)胞置于1.5 m l EP管中，PBS洗3次，在500μl體系中加入終濃度為2 μmol/L Rhodamine123于細(xì)胞中，37℃，5%CO2孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測并分析結(jié)果。

1.2.6 DAPI染色 將DAPI染液用甲醇稀釋10～20倍，制成2μg/ml的DAPI工作液。將培養(yǎng)至90%融合的各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入500μl DAPI工作液洗一次，再加入500μl的DAPI工作液37℃染色15 min，離心棄去染色液，甲醇漂洗一次，滴加Buffer A，熒光顯微鏡下觀察，拍攝照片，并統(tǒng)計各組中的陽性細(xì)胞，在高倍鏡下各組細(xì)胞選取20個視野，計數(shù)每個視野中細(xì)胞核著色強(qiáng)陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測 按試劑盒(In situ cell death detection kit，POD)說明配制TUNEL反應(yīng)液。采用多聚賴氨酸處理蓋玻片防止細(xì)胞脫片，將高壓滅菌后的蓋玻片放入孔板中，分組接種細(xì)胞，待細(xì)胞90%融合時，取出蓋玻片進(jìn)行后續(xù)試驗，梯度酒精水化后，PBS沖洗2次，每次3 min，蛋白酶 K(20 μg/m l，10 mmol/L Tris/HCl，pH 7.4 ～8.0，21℃ ～37℃消化15～30 min)消化，PBS沖洗2次，每次3 min，每片加50μl的0.3%H2O2甲醇溶液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，每片加25～50μl的TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育盒中孵育60 min，PBS沖洗，每片加25～50μl的辣根過氧化物酶抗體37℃，孵育盒中孵育60 min，PBS沖洗，每片加一滴新鮮配制的DAB室溫孵育5～10 min，鏡下觀察到細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色的陽性細(xì)胞時終止反應(yīng)，PBS沖洗，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，采用方差分析法檢測各組實(shí)驗數(shù)據(jù)差異。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化 對照和空載體組細(xì)胞生長較快，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，異型性大，培養(yǎng)基中未見明顯懸浮的死細(xì)胞，而基因沉默組細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，有較多細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞異型性小，培養(yǎng)基中可見明顯懸浮的死細(xì)胞，提示Twist基因沉默使SGC7901細(xì)胞生長緩慢，形態(tài)發(fā)生變化。見圖1。

2.2 透射電鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 與對照和空載體組細(xì)胞相比，Twist基因沉默后細(xì)胞體積變小，微絨毛減少，細(xì)胞突觸變短且增多，排列紊亂，空泡增多，核質(zhì)比例降低，髓樣小體增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴(kuò)張，異染色質(zhì)團(tuán)塊狀分布，核周間隙更大，線粒體髓鞘樣變化尤為顯著。結(jié)果提示Twist基因沉默可能使SGC7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖2。

2.3 Twist基因沉默對SGC7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響與對照組〔(4.4±0.9)%〕和空載體組〔(4.9±1.2)%〕相比，Twist基因沉默組陰性細(xì)胞數(shù)〔(14.0±0.9)%〕顯著增高(P＜0.001)，提示Twist基因沉默可能促使SGC7901細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)(×400)

圖2 透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖3 線粒體跨膜電位流式細(xì)胞儀分析圖

2.4 DAPI染色檢測Twist基因沉默對SGC7901細(xì)胞的影響對照和空載體組細(xì)胞核呈圓形，邊緣清晰，染色均勻，而基因沉默組細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，染色質(zhì)凝集，著色較重，并且有核固縮現(xiàn)象。見圖4。Twist基因沉默組細(xì)胞核著色強(qiáng)陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對照和空載體組(P＜0.001)。提示Twist基因沉默促進(jìn)SGC7901細(xì)胞凋亡。

圖4 細(xì)胞凋亡DAPI染色(×400)

2.5 TUNEL法檢測Twist基因沉默對SGC7901細(xì)胞的影響Twist基因沉默組細(xì)胞可見有明顯細(xì)胞核呈棕黃色染色的陽性細(xì)胞，此細(xì)胞即凋亡細(xì)胞，而對照和空載體組較少見陽性細(xì)胞。見圖5。對照組和空載體組陽性細(xì)胞數(shù)分別為14.5±3.8和15.2±2.1，Twist基因沉默組陽性細(xì)胞數(shù)為35.1±8.2，與對照和空載體組相比，Twist基因沉默組陽性細(xì)胞數(shù)增高(P＜0.001)。提示Twist基因沉默促進(jìn)SGC7901細(xì)胞凋亡。

圖5 TUNEL法檢測各組細(xì)胞凋亡情況

3 討論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)Twist和腫瘤的發(fā)生有關(guān)，有報道認(rèn)為Twist基因是一個原癌基因，能通過不同的途徑抑制細(xì)胞的凋亡〔4，8〕，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖相關(guān)。Twist在黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)〔2，4，6，7〕。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Twist基因在胃癌SGC7901細(xì)胞高表達(dá)，且與細(xì)胞的增殖能力相關(guān)〔5〕，這與文獻(xiàn)報道相一致，本研究將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討Twist抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，從而明確Twist基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)Twist基因沉默SGC7901細(xì)胞后細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，有較多細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞異型性小，透射電鏡觀察進(jìn)一步顯示Twist基因沉默后細(xì)胞體積變小，微絨毛減少，細(xì)胞突觸變短且增多，空泡增多，核質(zhì)比例降低，異染色質(zhì)團(tuán)塊狀分布，核周間隙更大。結(jié)果提示Twist基因沉默后SGC7901細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，使增殖抑制。為了進(jìn)一步證實(shí)Twist基因沉默后細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，首先檢測細(xì)胞線粒體跨膜電位的改變，因為它是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，在細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。結(jié)果顯示Twist基因沉默組Rhodamine123陰性細(xì)胞數(shù)顯著增高，提示Twist基因沉默能夠降低細(xì)胞線粒體膜電位，細(xì)胞可能發(fā)生凋亡，進(jìn)一步通過DAPI染色和TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果提示Twist基因沉默后細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)合文獻(xiàn)報道，證實(shí)Twist基因沉默促進(jìn)細(xì)胞凋亡，揭示了Twist基因與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，Twist可能成為胃癌基因治療的靶點(diǎn)，但是Twist基因沉默促進(jìn)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制還未明確，有待進(jìn)一步探討。

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R73

A

1005-9202(2012)16-3464-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.054

1 吉林省前衛(wèi)醫(yī)院普外科 2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院胃結(jié)直腸外科

所 劍(1957-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事消化道腫瘤研究。

劉洪義(1972-)，男，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

〔2012-01-15收稿 2012-03-20修回〕

(編輯 徐 杰)