2%氫氣生理鹽水對阿爾茨海默病大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

周風(fēng)華 呂世軍 (濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

2%氫氣生理鹽水對阿爾茨海默病大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

周風(fēng)華 呂世軍 (濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

目的 探討2%氫氣生理鹽水治療的阿爾茨海默病(AD)大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力以及海馬神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化的影響。方法 雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對照組、生理鹽水治療組及2%氫氣生理鹽水治療組，每組各10只。按6 mg/kg腹腔注射三甲基錫(TMT)誘導(dǎo)AD大鼠模型。按10 m l/kg腹腔注射2%氫氣生理鹽水進(jìn)行治療，生理鹽水治療組按同樣劑量進(jìn)行注射。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力，尼氏染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量及尼氏小體的變化，免疫組織化學(xué)檢測caspase-3在海馬神經(jīng)元的表達(dá)，電鏡觀察海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 2%氫氣生理鹽水能顯著改善AD大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力障礙，抑制caspase-3的表達(dá)活性，降低海馬神經(jīng)元的凋亡，保護(hù)神經(jīng)元，同時電鏡檢測顯示海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)得到改善。結(jié)論 2%氫氣生理鹽水能夠改善海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)組織，從而提示2%氫氣生理鹽水對AD有保護(hù)治療作用，其深層機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

阿爾茨海默病;三甲基錫;2%氫氣生理鹽水;caspase-3

阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病有多種學(xué)說，其中膠質(zhì)細(xì)胞的活化、炎癥反應(yīng)及自由基的產(chǎn)生引起的神經(jīng)元損傷是發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。三甲基錫(TMT)是一種強(qiáng)效的神經(jīng)毒劑，可引起邊緣系統(tǒng)尤其是海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)及記憶功能的損害〔1〕，可作為研究AD的動物模型〔2〕。氫是自然界最簡單的元素，氫氣是無色、無嗅、無味、具有一定還原性的雙原子氣體。氫氣在生物體內(nèi)具有抗氧化作用，目前已證實(shí)氫氣可治療多種疾病。本實(shí)驗(yàn)探討2%氫氣生理鹽水對AD大鼠的治療保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年 SD大鼠，30只，8周齡，雄性，180～200 g，SPF級，由山東省中醫(yī)藥大學(xué)提供，每籠5只，23℃ ～25℃，55%濕度，每天采光12 h，常規(guī)飲食飲水。

1.2 藥物及實(shí)驗(yàn)試劑 TMT由廣東省職業(yè)病防治院唐小江教授惠贈，購自美國Acros organics，批號:12335301，常溫?zé)o菌生理鹽水溶解，4℃保存;2%氫氣生理鹽水由上海第二軍醫(yī)大學(xué)孫學(xué)軍教授惠贈，4℃密閉保存;甲苯胺藍(lán)購自美國Sigma公司;兔抗人多克隆抗體caspase-3，工作液，購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 大鼠模型構(gòu)建、分組及給藥 隨機(jī)選取20只大鼠，腹腔注射TMT無菌生理鹽水溶液(6 mg/kg)一次，誘導(dǎo)AD模型，另外10只作為正常對照組。20只大鼠隨機(jī)分為生理鹽水治療組、2%氫氣生理鹽水治療組，每組各10只，于TMT注射后2 h，按8 m l/kg的量分別腹腔注射生理鹽水及2%氫氣生理鹽水，連續(xù)2 w，前7 d上午、下午各一次，后7 d每天一次。

1.4 水迷宮實(shí)驗(yàn) 對各組實(shí)驗(yàn)大鼠，實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，每天1次，共測7次，錄像，并對錄像進(jìn)行分析，得出運(yùn)動的平均潛伏期及運(yùn)動軌跡，分別測量四個不同入水點(diǎn)的潛伏期。

1.5 標(biāo)本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛溶液灌注。迅速斷頭處死，取腦，10%中性甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，60℃溫箱浸蠟過夜，包埋框包埋，自然冷卻凝固。將石蠟包埋組織連續(xù)切片，厚5μm，待用。另分離部分海馬，將新鮮組織制成1 mm小塊，迅速浸入預(yù)冷的3%戊二醛中前固定，待做電鏡標(biāo)本。

1.6 尼氏染色 切片脫蠟至水，1%的甲苯胺藍(lán)染液，60℃，2～3 min，蒸餾水沖洗，梯度酒精分化，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA3及CA4區(qū)神經(jīng)元數(shù)量變化(放大400倍)，隨機(jī)選取10個高倍視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值，并在顯微圖像分析系統(tǒng)中檢測神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體的灰度變化，取其平均值。

1.7 免疫組織化學(xué) 切片脫蠟至水，3%H2O2去離子水孵育，PBS浸泡，微波抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，滴加封閉用正常山羊血清工作液37℃孵育，傾去，勿洗，滴加一抗caspase-3，以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃過夜，室溫放置30 min，PBS沖洗，，滴加生物素標(biāo)記山羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育，PBS沖洗，滴加SP工作液，37℃孵育，PBS沖洗，DAB顯色，鏡下控制顯色時間，自來水終止反應(yīng)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元的表達(dá)情況，拍照，圖像分析系統(tǒng)采集灰度值并分析。

1.8 電鏡 電鏡標(biāo)本經(jīng)醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛染色。由濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心電鏡室觀察。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力 各組平均潛伏期分別為:正常對照組:(5.2 ±0.3)s，(5.3 ±0.6)s，(8.5 ±0.1)s，(6.4 ±0.2)s。生理鹽水治療組:TMT注射后的第3天，大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶能力的損傷，極少數(shù)大鼠能夠在1 min內(nèi)找到平臺，潛伏期明顯延長，且不穩(wěn)定，大多數(shù)大鼠在1 min內(nèi)未能找到平臺。2%氫氣生理鹽水治療組:大鼠能找到平臺，但是潛伏期較正常對照組延長，分別為(19.6±0.5)s，(20.3±0.2)s，(28.5±0.6)s，(21.4 ±0.3)s。

2.2 尼氏染色 正常對照組，海馬神經(jīng)元數(shù)量較多，尼氏小體豐富;生理鹽水治療組，海馬區(qū)尤其是CA3及CA4區(qū)部分神經(jīng)元水腫部分神經(jīng)元胞體內(nèi)尼氏小體消失，細(xì)胞核固縮及溶解，較正常對照組神經(jīng)元數(shù)量減少(P＜0.05);氫氣生理鹽水治療組較正常對照組神經(jīng)元數(shù)量減少，但無顯著差異(P＞0.05)，較生理鹽水組神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P＜0.05)。見表1，圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)部位在細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀。正常對照組少數(shù)海馬神經(jīng)元表達(dá)，灰度值為0.32±0.01;生理鹽水治療組，caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量增多，灰度值為0.76±0.05，與正常對照組差異顯著(P＜0.05);氫氣生理鹽水治療組，陽性細(xì)胞較生理鹽水治療組減少，灰度值為0.68±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1，圖 2。

表1 海馬CA3、CA4區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù)比較及caspase-3灰度值比較(±s)

表1 海馬CA3、CA4區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù)比較及caspase-3灰度值比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05

組別 神經(jīng)元計(jì)數(shù)23.6±0.71 0.32±0.01生理鹽水組 15.3±0.151) 0.76±0.051)氫氣生理鹽水治療組 21.4±0.51) 0.68±0.031)caspase-3正常對照組

圖1 各組尼氏小體(尼氏染色，×400)

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3免疫組化表達(dá)(SP，×400)

2.4 電鏡觀察 生理鹽水治療組海馬神經(jīng)元，表現(xiàn)為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖體數(shù)量減少，部分區(qū)域出現(xiàn)似板層狀顆粒結(jié)構(gòu)，小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)電子密度降低，膠質(zhì)細(xì)胞可見核周隙局部增寬;氫氣生理鹽水治療組，海馬神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖體較豐富，膠質(zhì)細(xì)胞未見明顯異常。

3 討論

膠質(zhì)細(xì)胞的活化、炎癥發(fā)生以及自由基的產(chǎn)生在AD發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷〔3〕。

氫氣在生物體內(nèi)具有抗氧化作用，目前已證實(shí)氫氣可治療多種疾病。高壓氫氣可有效治療動物皮膚惡性腫瘤，并認(rèn)為是通過抗氧化作用〔4〕。2001年，法國潛水醫(yī)學(xué)家證明，呼吸8個大氣壓高壓氫氣可治療肝曼森血吸蟲感染引起的炎癥反應(yīng)，首次證明氫氣具有抗炎作用，并提出氫氣與羥自由基直接反應(yīng)是治療炎癥損傷的基礎(chǔ)〔5〕。有人報道，動物呼吸2%的氫氣就可有效清除自由基，顯著改善腦缺血再灌注損傷，他們采用化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞學(xué)等手段證明，氫氣溶解在液體中可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子〔6〕。早期治療可明顯改善新生兒腦缺血缺氧損傷晚期神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶能力。上述研究表明，作為一種選擇性抗氧化物質(zhì)，氫氣對某些疾病具有治療作用。

海馬CA3到CA1區(qū)椎體細(xì)胞的突觸連接對于空間學(xué)習(xí)及記憶能力的形成是非常重要的〔7〕。TMT是一種強(qiáng)效的神經(jīng)毒性有機(jī)錫化合物，可顯著誘導(dǎo)大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的變性及壞死，從而導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)及記憶功能的損害，誘導(dǎo)AD模型。大量研究表明，TMT誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷與活性氧自由基及活性氮自由基的產(chǎn)生有關(guān)。TMT可引起腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，釋放大量的細(xì)胞因子(如IL-1、TNF-α等)誘發(fā)炎癥反應(yīng)，同時體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基〔8～10〕，自由基的產(chǎn)生損傷神經(jīng)元，造成神經(jīng)元的變性及壞死。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TMT注射后的大鼠，其空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損，caspase-3表達(dá)活性增強(qiáng)，海馬CA3及CA4區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，尼氏小體減少，海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)了超微結(jié)構(gòu)的改變。而經(jīng)2%的氫氣生理鹽水同時治療后，學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，海馬神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加，尼氏小體數(shù)量增加，caspase-3的活性降低，抑制了海馬神經(jīng)元的凋亡，并且膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改善，能夠很好地治療TMT引起的AD，而氫氣對該模型神經(jīng)元的保護(hù)作用是否與抗氧化有關(guān)目前尚未證實(shí)，這將是我們下一步工作的重點(diǎn)。

1 Imai H，Nishimura T，Sadamatsu M.TypeⅡ glucocorticoid receptors are involved in neuronal death and astrocyte activation induced by trimethyltin in the rat hippocampus〔J〕.Exp Neurol，2001;171(1):22-8.

2 Nishimura T，Imai H，Minabe Y.Beneficial effects of FK506 for experimental temporl lobe epilepsy〔J〕.Neurosci Res，2006;56(3):386-90.

3 Akiyama H，Barger S，Barnum S.Inflammation and Alzheimer's disease〔J〕.Neurobiol Aging，2000;21(3):383-421.

4 Dole M，Wilson FR，F(xiàn)ife WP.Hyperbaric hydrogen therapy:a possible treatment for cancer〔J〕.Science，1975;190(4210):152-4.

5 Gharib B，Hanna S，AbdallahiOM.Anti-inflammatory propertiesofmolecular hydrogen:investigation on parasite-induced liver inflammation〔J〕.C R Acad SciⅢ，2001;324(8):719-24.

6 Ohsawa I，Ishikawa M，Takahashi K.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals〔J〕.Nat Med，2007;13(6):688-94.

7 Nakazawa K，McHugh TJ，Wilson MA.NMDA receptors，place cells and hippocampal spatialmemory〔J〕.Nat Rev Neurosci，2004;5(2):361-72.

8 Harry GJ，Sills R，Schlosser MJ.Neurodegeneration and glia response in rat hippocampus following nitro-L-argininemethyl ester(L-NAME)〔J〕.Neurotoxicol，2001;3(2):307-19.

9 Viviani B，Corsini E，Pesenti M.Trimethyltin-activated cyclooxygenase stimulates tumor necrosis factor-alpha release from glial cells through reactive oxygen species〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol，2001;172(1):93-7.

10 Yoneyama M，Nishiyama N，Shuto M.In vivo depletion of endogenous glutathione facilitates trimethyltin-induced neuronal damage in the dentate gyrus ofmice by enhancing oxidative stress〔J〕.Neurochem，2008;52(5):761-9.

R361

A

1005-9202(2012)16-3484-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.064

山東省教育廳課題(J12LK51)

呂世軍(1961-)，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)病理學(xué)研究。

周風(fēng)華(1977-)，女，講師，碩士，主要從事神經(jīng)病理研究。

〔2011-03-14收稿 2011-07-10修回〕

(編輯 曹夢園)