綠茶萃取液酶解工藝雙響應面法優(yōu)化研究

翁淑燚

大閩食品（漳州）有限公司 海西茶葉深加工研究所 福建省飲料用植物提取技術(shù)企業(yè)重點試驗室，福建 漳州 363000

茶萃取液（又稱茶浸提液）是以鮮茶、成品茶葉為原料，經(jīng)浸提、過濾等工序制得的原茶湯，是濃縮茶、速溶茶等深加工產(chǎn)品的原料。茶萃取液中富含的茶多酚、茶氨酸、茶多糖、兒茶素、黃酮以及咖啡堿等，不僅具有一定的營養(yǎng)價值，也是茶湯中主要的風味物質(zhì)。茶湯的感官風味與其理化成分密不可分，茶多酚是構(gòu)成茶湯的苦味、澀味和回甘生津的主要物質(zhì)，茶氨酸能夠增加茶湯的鮮爽度和甜度，茶多糖有利于茶湯風味和湯色的提高，咖啡堿是綠茶中的主要苦味物質(zhì)。在原茶湯中，由于滋味物質(zhì)的組成與含量不同常導致茶湯苦澀味重、收斂性強，從而影響成品茶飲料的感官風味。研究表明，茶葉深加工過程中使用外源酶進行前處理，能夠改善茶飲料的風味品質(zhì)與營養(yǎng)價值，因為酶可催化滋味成分的重組與合成，例如單寧酶可斷裂兒茶酚與沒食子酸間的酯鍵，生成非酯型兒茶素和沒食子酸，減輕苦澀味；纖維素酶可水解茶葉中的纖維素，增加茶氨酸、可溶性多糖等的含量；果膠酶可以通過分解果膠，釋放可溶性多糖等。

在實際的生產(chǎn)過程中，工藝參數(shù)的繁多與復雜可能使得茶萃取液的酶解效果不夠理想，感官品質(zhì)不能有效提升。因此，本研究采用復合酶M（單寧酶、纖維素酶和果膠酶復配）酶解炒青綠茶萃取液，通過對酶解工藝中的加工因素進行風險評估，選定優(yōu)化參數(shù)，以感官評價和生化品質(zhì)為標準，利用雙響應面優(yōu)化設計的方法，優(yōu)化綠茶萃取液的酶解工藝，得出最優(yōu)工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

炒青綠茶：G02-D 系列，福建興旺茶業(yè)有限公司；復合酶M：凱愛瑞食品貿(mào)易上海有限公司；福林酚、蒽酮、葡萄糖、碳酸鈉、沒食子酸、氧化鎂、硫酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇、乙醇（色譜純）：上海安譜試驗科技股份有限公司；咖啡堿、茶氨酸（HPLC 標品）：美國阿法埃莎公司；電子分析天平：BS223型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DK-S28型，上海精宏試驗設備有限公司；雙聯(lián)過濾器：YWDL-1P1S型，天臺縣清楚篩網(wǎng)有限公司；水處理裝置：自組儀器，大閩食品（漳州）有限公司；罐組低溫逆流裝置：自組儀器，大閩食品（漳州）有限公司；高效液相色譜儀：Waters 2487 型，美國沃特世公司；色譜柱：Phenomenex Luna C，美國菲羅門公司。

1.2 試驗方法

工藝流程：茶葉→水處理→低溫逆流浸提→超濾→茶萃取液→酶解。

水處理：自來水→原水箱→砂罐→炭罐→過濾器→原水箱→過濾器→RO膜→純水桶，處理后的水硬度≤1 德國度，無色無味無肉眼可見雜質(zhì)，pH值控制在6.5±0.5。

低溫逆流浸提：以料液比1∶15 的比例，于二級槽末端加水，水溫為（65±2）℃，一級槽與二級槽槽內(nèi)溫度（50±5）℃，一級槽和二級槽浸提時間均為15 min。

超濾：使用超濾膜（孔徑0.2 μm）對茶水茶渣進行過濾分離，獲得茶萃取液。

酶解：取1 000 mL 的茶萃取液，添加0.026%復合酶M，置于恒溫水浴鍋中60 ℃、47 min，得到酶解茶萃取液。

采用風險分析識別茶萃取液酶解工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)。采用魚骨圖分析列舉潛在酶解工藝性能的影響因素。采用失效模式與效應分析法（FMEA）對各潛在影響因素作定量風險評估，對每一個因素的風險嚴重度（）、風險發(fā)生度（）和風險檢測度（）進行屬性評分，其評分原則如表1。通過計算風險優(yōu)先系數(shù)（），對各類因素發(fā)生的風險程度進行量化評估，計算公式為：=××。

表1 風險評分規(guī)則

酶添加量的優(yōu)化：取1 000 mL 綠茶萃取液，設置復合酶M 的添加量為茶葉質(zhì)量的0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%，置于恒溫水浴鍋中，設定酶解溫度50 ℃，酶解時間50 min，通過感官評價篩選最優(yōu)酶添加量。

酶解溫度的優(yōu)化：取1 000 mL 綠茶萃取液，設置復合酶M 的添加量為茶葉質(zhì)量的0.04%，置于恒溫水浴鍋中，酶解溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，酶解時間為50 min，通過感官評價篩選最優(yōu)酶解溫度。

酶解時間的優(yōu)化：取1 000 mL 綠茶萃取液，設置復合酶M的添加量為茶葉質(zhì)量的0.04%，置于恒溫水浴鍋中，酶解溫度為50 ℃，設置酶解時間分別為10 min、30 min、50 min、70 min、90 min，通過感官評價篩選最優(yōu)酶解時間。

參考金孝芳等對綠茶滋味的描述、分析與感官評價方法，同時結(jié)合綠茶的特點，制定了針對酶解茶萃取液滋味的感官評分標準（表2），由5 位評審員對酶解綠茶萃取液滋味的澀味、苦味、甜味和鮮味4 個方面進行評分，綜合評價酶解綠茶萃取液的滋味品質(zhì)。

表2 酶解綠茶萃取液感官評分標準

茶多酚含量采用福林酚比色法測定，咖啡堿含量按《茶 咖啡堿測定》（GB/T 8312—2013）測定，茶氨酸含量按《茶葉中茶氨酸的測定 高效液相色譜法》（GB/T 23193—2017）測定，茶多糖含量采用蒽酮-硫酸比色法測定。

參考何文斌等和錢書云等對茶的各理化成分評價指標，結(jié)合炒青綠茶的特點，將各生化因子以及權(quán)重指數(shù)修正如下：茶多酚0.380 2，茶氨酸0.162 8，茶多糖0.120 6，咖啡堿0.192 0，（茶氨酸+茶多糖）/茶多酚0.144 4，組成權(quán)重數(shù)集A=（a，a，a，a，a）=（0.380 2，0.162 8，0.120 6，0.192 0，0.144 4），得到生化品質(zhì)模糊綜合評價關(guān)系式如下：

生化品質(zhì)模糊綜合評判值=×

式中為生化因子權(quán)重數(shù)集，為生化成分含量數(shù)集〔茶多酚、茶氨酸、茶多糖、咖啡堿、（茶氨酸+茶多糖）/茶多酚〕。

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原則，以感官評價和生化品質(zhì)模糊綜合評判值為雙響應值，對酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）3個因素進行優(yōu)化（表3）。

表3 響應面分析法因素與水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Office Excel 2013 和DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)V18.10 軟件進行平均值、標準偏差的計算，折線圖的繪制；通過Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken設計原則進行響應面試驗設計及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠茶萃取液酶解關(guān)鍵工藝參數(shù)識別

通過魚骨圖（圖1）分析列舉潛在工藝影響因素，得出5 個方面的影響因素，包括提取液固含量、溫度、pH值、酶添加量、酶解溫度和酶解時間等在內(nèi)的10個具體影響因素。通過FMEA對10個潛在影響因素作定量風險評估，并計算得出其風險性優(yōu)先值，綠茶萃取液的酶解工藝風險值分析結(jié)果如表4。結(jié)合FMEA的量化評估原則和生產(chǎn)實際經(jīng)驗，認定≥10 的酶解工藝因素為高風險因素。因此，由表4可知，酶添加量、酶解溫度和酶解時間為酶解工藝中的高風險因素，即關(guān)鍵工藝參數(shù)。

表4 綠茶萃取液酶解工藝風險值分析結(jié)果

圖1 綠茶萃取液酶解工藝的魚骨圖分析

2.2 綠茶萃取液酶解單因素試驗

復合酶M 由單寧酶、纖維素酶和果膠酶組成。Zhang等用單寧酶對綠茶沖劑進行水解，發(fā)現(xiàn)其苦澀味被顯著抑制，而甜味增加；梁靖等發(fā)現(xiàn)纖維酶的添加可得到浸出物含量高、口感鮮爽、香氣濃郁的綠茶速溶茶；尹軍峰等發(fā)現(xiàn)綠茶和烏龍茶經(jīng)果膠酶處理后，雖感官評價和理化成分沒有發(fā)生顯著變化，但超濾通量顯著提高，茶湯黏度下降。因此，復合酶M 對綠茶萃取液具有一定的減少澀味、增強回甘、降低液體渾濁度和黏度、提高澄清度的作用。

復合酶M 的添加量對感官評價分值的影響如圖2。隨著酶添加量的增加，綠茶萃取液的總感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當酶添加量為0.04%時，感官評價得分最高，此時綠茶萃取液的苦澀味較低，且甜味與鮮味較高（苦味、澀味分值越高，苦澀味越弱；甜味、鮮味分值越高，甜鮮味越強），因此復合酶M最優(yōu)添加量為0.04%。

圖2 酶添加量對酶解綠茶萃取液感官評價的影響

根據(jù)相關(guān)文獻報道，浸提茶湯的滋味屬性在一定程度上也受酶解溫度的影響，吳榮梅等用單寧酶處理夏秋綠茶時，發(fā)現(xiàn)在40 ℃下浸提液的苦澀味最低，回甘最強，整體風味最佳；羅紅玉等通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)纖維素酶的最適反應溫度為30～60 ℃，在60 ℃時，速溶茶中浸出物含量顯著增多；錢曉軍等得出果膠酶在綠茶浸出液中最佳的工作溫度為35 ℃，此時茶湯黏度顯著下降，超濾通量提高18.5%。由圖3可見，隨著酶解溫度的上升，綠茶萃取液的總感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在50 ℃時取得最大值。此時綠茶萃取液具有口感清爽、苦澀感低等特點。而隨著酶解溫度的上升，各感官因素評分略有下降，可能是由于在溫度較高的環(huán)境下，復合酶活性有所下降，滋味物質(zhì)的組成與含量轉(zhuǎn)化低下。因此，以綜合感官評分為評判標準，選擇最優(yōu)酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對酶解綠茶萃取液感官評價的影響

適當?shù)拿附鈺r間對綠茶萃取液的感官評價與生化品質(zhì)的提升具有一定影響，當酶解時間過短時，酯型兒茶素、果膠等分解量較小，茶湯苦澀味依舊較強，茶湯渾濁，感官與生化品質(zhì)均較差；當酶解時間過長時，酶活力逐漸降低，不利于高效連續(xù)的工業(yè)生產(chǎn)。復合酶M 的酶解時間對酶解工藝的影響如圖4，在酶解時間為50 min 時，總感官評分最高。酶解時間過長導致綠茶萃取液無鮮爽感，口感濃澀，且不利于實際生產(chǎn)效率，因此最優(yōu)酶解時間為50 min。

圖4 酶解時間對酶解綠茶萃取液感官評價的影響

2.3 雙響應面設計試驗及分析

在綠茶萃取液酶解工藝單因素試驗的基礎上，根據(jù)響應面Box-Behnken設計原理，應用Design-Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平的響應面試驗，試驗方案如表5。

表5 響應面試驗方案

根據(jù)試驗方案的條件對綠茶萃取液進行酶解處理，對不同酶解工藝下的綠茶萃取液進行感官評價以及理化成分（茶多酚、咖啡堿、茶氨酸和茶多糖）含量檢測，并按照各理化成分評價指標的權(quán)重指數(shù)，計算得出不同酶解工藝的生化品質(zhì)模糊綜合評判值，以未經(jīng)酶解處理的綠茶萃取液為對照（CK），結(jié)果如表6。對該試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到生化品質(zhì)模糊綜合評判值（）和感官評價（）的二元多項次回歸方程分別為：

表6 不同酶解條件下綠茶提取液的主要生化成分含量、生化品質(zhì)模糊綜合評判值及感官結(jié)果

=622.76-3.56A + 24.01B-12.72C-12.90AB-1.45AC+23.12BC-11.95A-8.73B-15.60C（R=0.814 7），

=81.90+3.12A+2.96B-0.1125C-2.90AB+2.30AC-1.43BC+0.4625 A+1.49B-2.06C（R=0.885 3）。

由表7和表8可知，模糊綜合評判值模型的值為0.000 8，感官評價模型的值為0.002 6，均小于0.05，說明模型和均顯著，失擬性分別為0.060 8、0.136 6，均大于0.05，說明模型擬合性均較好。由值可以看出，各因素對生化品質(zhì)模糊綜合評判值大小分別為B＞C＞A，感官評價的影響顯著性大小分別為A＞B＞C。其中，在（模糊綜合評判值）模型中，因素B、C、AB、BC的值均＜0.05，說明酶解溫度、酶解時間、酶添加量和酶解溫度的交互作用，以及酶解溫度和酶解時間的交互作用對酶解綠茶萃取液的模糊綜合評判值影響較為顯著，而酶添加量及其與酶解時間的交互影響作用較小。在（感官評價值）模型中，因素B、C、AB、BC 的值均＜0.05，說明酶添加量、酶解溫度、酶添加量和酶解溫度的交互作用，以及酶添加量和酶解時間的交互作用對酶解綠茶萃取液的感官評價影響較為顯著，而酶解時間以及其與酶解溫度的交互作用影響不大。

表7 基于生化品質(zhì)模糊綜合評判值的方差分析

表8 基于感官評分的方差分析

通過Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件優(yōu)化對兩個回歸方程進行計算，得到最佳酶解工藝參數(shù)的理論值為酶添加量0.026% 、酶解溫度59.029 ℃、酶解時間47.152 min，此時生化品質(zhì)模糊綜合評判值預測為6.435，感官評價值預測為87.597。結(jié)合前期單因素試驗和實際生產(chǎn)情況，將其參數(shù)修正如下：酶添加量為0.026%、酶解溫度為59 ℃、酶解時間為47 min。

按照此條件對綠茶萃取液進行酶解處理，對其生化成分和感官進行測定和評估，結(jié)果如下：茶多酚含量為（13.563±0.034）mg/mL，茶氨酸（0.795±0.000 8）mg/mL，茶多糖（4.592±0.017 9）mg/mL，咖啡堿（1.852±0.032）mg/mL，（茶氨酸+茶多糖）/茶多酚為0.397±0.00 1；生化品質(zhì)模糊綜合評價關(guān)系式計算得到其平均模糊綜合評判值為6.428，感官分值為87.2，與預測理論值相近，說明該模型擬合性好，可信度高。

與未酶解的綠茶萃取液對比，酶解后的綠茶萃取液整體感官分值顯著提高，其苦味、澀味有所降低，而且鮮味、甜味有所提高；從測定的生化成分含量可知，經(jīng)酶解作用后的綠茶萃取液中的茶多酚、茶氨酸、茶多糖、咖啡堿含量以及（茶氨酸+茶多糖）/茶多酚比值也都得以提高，說明該優(yōu)化的酶解工藝能夠顯著改善綠茶萃取液的感官和生化品質(zhì)。

3 結(jié)論

本試驗選用由單寧酶、纖維素酶以及果膠酶組合的復合酶M 對炒青綠茶的萃取液進行酶解，通過FMEA 對酶解工藝的各個因素進行風險評估，選定酶添加量、酶解溫度和酶解時間作為優(yōu)化參數(shù)，以感官評價和生化品質(zhì)評價為響應值，通過雙響應面法設計優(yōu)化綠茶萃取液的酶解工藝，經(jīng)綜合分析得出酶解綠茶萃取液最優(yōu)的工藝方案為：酶添加量0.026%、酶解溫度59 ℃、酶解時間47 min。在此條件下，酶解綠茶萃取液的平均模糊綜合評判值為6.428，平均感官分值為87.2，此時酶解綠茶萃取液口感鮮爽、無苦澀味，研究結(jié)果可為綠茶萃取液的酶解工藝優(yōu)化研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。