RP-HPLC測(cè)定通絡(luò)解毒凝膠劑中士的寧和鹽酸小檗堿的含量*

陳 玲 敖 利

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

通絡(luò)解毒凝膠劑來(lái)源于重慶市中醫(yī)院名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，由黃連、馬錢(qián)子等中藥組成，臨床應(yīng)用40多年，具有開(kāi)通經(jīng)絡(luò)、活血鎮(zhèn)痛的功效，其主要有效部位為生物堿類(lèi)。為進(jìn)一步控制本品的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC法）［1］同時(shí)測(cè)定士的寧和鹽酸小檗堿含量，以保證臨床用藥的安全、有效。

1 材 料

1.1 儀器 HP-1100高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵、G1314A可變紫外波長(zhǎng)檢測(cè)器 （美國(guó)安捷倫科技公司）；AE-200型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥 通絡(luò)解毒凝膠劑 （由本院研究部提供，批號(hào)20100504）。 鹽酸 小檗堿 （110713-200609），士的寧（110705-200306）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用。乙腈、甲醇為色譜純，其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 取不同批次通絡(luò)解毒凝膠劑1.0 g，置100 mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，取一定量置于5 mL離心管中，以4000 r/min離心5 min，用孔徑為0.2 μm的微孔濾膜濾過(guò)后直接進(jìn)樣。

2.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取士的寧對(duì)照品0.014 g，鹽酸小檗堿對(duì)照品0.024 g，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置同一100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，分別測(cè)定士的寧和鹽酸小檗堿的峰面積，數(shù)據(jù)以峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果士的寧絕對(duì)進(jìn)樣量在0.056～0.336 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為：A=2528.7317×C-9.8933 （r=0.9996）； 鹽酸小檗堿絕對(duì)進(jìn)樣量在 0.096～0.576 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為：A=3330.1577×C-11.0256（r=0.9998）。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 按供試品溶液制備方法，分別制備缺黃連的陰性對(duì)照品和缺馬錢(qián)子的陰性對(duì)照品，分別注入液相色譜儀，色譜柱：（phenomenex Luna C18，5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶25 mmol/L 磷酸二氫鈉溶液（30∶30∶40）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃；流量：0.9 mL/min。結(jié)果缺黃連的陰性對(duì)照在鹽酸小檗堿出峰時(shí)間無(wú)色譜峰出現(xiàn)；缺馬錢(qián)子的陰性對(duì)照在士的寧出峰時(shí)間無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取士的寧對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，其RSD為0.5%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品正文方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測(cè)定士的寧、鹽酸小檗堿的峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.7%、0.9%，表明供試品溶液至少在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按擬定的含量測(cè)定方法，分別制備6份供試品溶液，測(cè)定士的寧、鹽酸小檗堿的峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為2.2%、2.6%，說(shuō)明本方法重現(xiàn)性好。

2.7 回收率試驗(yàn) 精密量取本品（士的寧0.55 mg/g，鹽酸小檗堿1.91 mg/g）0.5 g，置100 mL量瓶中，再分別精密加入士的寧對(duì)照品溶液（0.029 mg/mL）8、10、12 mL，鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（0.100 mg/mL）8、10、12 mL，按擬定的含量測(cè)定方法試驗(yàn)，分別測(cè)定士的寧、鹽酸小檗堿的量，按下式計(jì)算回收率（結(jié)果見(jiàn)表1~表2）。結(jié)果表明方法具有良好的回收率。

2.8 樣品含量測(cè)定 取3批本品中試樣品，按正文方法測(cè)定，結(jié)果批號(hào)為20101201、20101202、20101203的樣品中，士的寧含量分別為 0.95、0.92、0.82 mg/mL，平均 0.89 mg/mL；鹽酸小檗堿的含量分別為 2.40、2.27、2.00 mg/mL，平均 2.22 mg/mL。

表1 士的寧回收試驗(yàn)

表2 鹽酸小檗堿回收試驗(yàn)

3 討 論

本試驗(yàn)樣品處理簡(jiǎn)便，經(jīng)反復(fù)進(jìn)樣，柱壓未見(jiàn)明顯上升，柱效未見(jiàn)明顯下降，由于未見(jiàn)提取等操作，不存在中間步驟引入的誤差，方法簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，因此擬定了正文中供試品溶液的制備方法。色譜柱選用了phenomenexLunaC18（5μm，250mm×4.6 mm），Dikma HPLC column（200 mm×4.6 mm，5 μm），兩者峰形都較佳。前者保留時(shí)間適中（10～20 min），后者保留時(shí)間較長(zhǎng)（20 min以后），流動(dòng)相參照藥典和文獻(xiàn)資料［2］，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了篩選，結(jié)果以甲醇-乙腈-25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液 （30∶30∶40）能排除陰性及雜質(zhì)峰干擾，士的寧和鹽酸小檗堿均能與相鄰成分達(dá)到基線(xiàn)分離，保留時(shí)間適中，分離度高。檢測(cè)波長(zhǎng)兼顧鹽酸小檗堿和士的寧的最大吸收波長(zhǎng)，最后確定為254 nm。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：36，215.

［2］ 魯燕俠，崔佳，劉鷹.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定祛痹丹膠囊中士的寧和馬錢(qián)子堿的含量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001，21（8）：1.